Виктор мошкович: Мошкович Виктор Михайлович, ГБОУ Школа № 138, Москва

• Имя: Инна Луцкер
• Адрес: 2388 Trevor Dr Commerce Twp, MI 48390
• Телефон: (248) 470-5334
• Возраст: 49 лет
• Семейное положение: Холост
• Профессия: Ремесленник / Синий воротничок
• Образование: закончила среднюю школу
• Тип жилья: Дом на одну семью
• Продолжительность проживания: три года
• ID отчета: 420739091
• Возможно связано с: Имма Луцкер, Виктор Мошкович

Знаете ли вы?

• Люди с фамилией Луцкер живут больше в Мичигане и в основном не состоят в браке .
• 0,00% из Инна Луцкерс имеет высшее образование, а 100,00% имеет только аттестат о среднем образовании.
• 0,00% состоят в браке и 0,00% являются домовладельцами

Российскому миллиардеру Виктору Вексельбергу о своих благотворительных проектах — интервью

Российскому миллиардеру Виктору Вексельбергу действительно не повезло с тех пор, как США ввели против него санкции в апреле 2018 года.Имея множество деловых и благотворительных проектов в США, партнер и давний друг Лен Блаватник, который является гражданином Америки, и сын Александр, который родился и все еще живет в США, Вексельберг считался «одним из американских, »В отличие от других участников списка Forbes, которых постигла та же участь.

Два года назад вы сказали, что Фонд «Сколково» был вашим основным проектом и что он занимал 50% вашего времени. В середине декабря 2020 года было объявлено, что в результате реформы «Сколково», «Роснано» и еще шесть компаний будут переведены в управление ВЭБа.РФ, государственная корпорация развития. В канун Нового года председатель правления ВЭБ.РФ Игорь Шувалов был назначен главой правления фонда, заменив вас, пока вы возглавляете попечительский совет Сколтеха — Сколковского института науки и технологий. Что это значит для тебя?

Первое десятилетие «Сколково» закончилось, и начался новый этап, требующий новых задач. Развитие Сколтеха — один из ключевых приоритетов на ближайшие десять лет. На мой взгляд, образование имеет первостепенное значение, поэтому было решено, что я буду заниматься усилением роли Сколтеха и превращать его в инновационный исследовательский центр для всех исследовательских институтов.Десять лет назад, когда появились исследовательские институты, возникла идея создать так называемый «инновационный лифт». Предполагалось, что каждый институт будет нести ответственность за свой сектор, совместными усилиями сосредоточившись на продвижении самых передовых проектов и воспитании тех «единорогов», которых все в нашей стране хотели бы видеть. Однако далеко не всем это удалось, а все развивается по спирали. На мой взгляд, объединение основных научно-исследовательских институтов России под эгидой ВЭБа.РФ — правильный ход.

Вы несколько раз подчеркивали, что в «Сколково» ничего не заработали, а наоборот, вложили туда большие деньги. Какие еще благотворительные проекты важны для вас?

Думаю, что рано или поздно каждый человек чувствует потребность делать добрые дела. Но благотворительность имеет несколько форм. Вы можете просто пожертвовать деньги на качественные проекты и не участвовать лично, или вы можете вкладывать свое время и свои эмоции. Последнее лучше соответствует моему определению благотворительности, потому что дает обратную связь.Вот почему я всегда стараюсь делать проекты, которые находят отклик в моей душе. Отсюда Еврейский музей и Центр толерантности, Музей Фаберже, реставрация Архангельского дворца и KES Basket — Российская школьная баскетбольная лига. И, конечно же, наши крупнейшие музеи: Третьяковская галерея, ГМИИ им. А.С. Пушкина, Эрмитаж, Политехнический музей.

Вы принимали активное участие в еврейских делах — в качестве председателя попечительского совета Еврейского музея и центра толерантности в Москве и в качестве члена президиума Российского еврейского конгресса.

Какой у вас был этнический статус в школьной зачетной книжке? Русский?

Вы председатель правления музея с момента его основания. Ходят слухи, что в 2021 году вы покинете эту должность. Так ли это, и если да, то что привело вас к такому решению?

На самом деле это не совсем слухи. Я слишком долго нахожусь в таком положении. Каждое дело требует новой инициативы, новой крови, а в музее работает хороший коллектив заинтересованных людей.Огромен вклад Александра Бороды, президента Федерации еврейских общин России. В Совет также входят Роман Абрамович и Лен Блаватник, мой деловой партнер. Кстати, именно Абрамович подарил музею нынешнее здание [это был бывший Бахметьевский автобусный гараж, где до 2011 года располагался музей современного искусства «Гараж»]. Недавно к нам присоединился бизнесмен Вадим Мошкович. Михаил Гуцериев, еще один бизнесмен, с самого первого дня его работы являвшийся одним из первых попечителей совета, не еврей.У нас есть мусульманские представители и члены Русской православной церкви. Я считаю, что это разнообразие очень важно. После того, как я уйду с нынешней должности — а точнее, операционного менеджера — я возьму на себя роль почетного председателя.

У вас прочные связи с США: у вас там есть родственники, ваши дети там учились, и вы когда-то перевезли туда свою семью. Ваш сын все еще живет в Америке, а ваш партнер Леонард Блаватник — гражданин США. Здесь базировался ваш бизнес и ряд благотворительных проектов.Как вы поступили с санкциями, наложенными на вас Минфином США? Насколько они усложняют вашу жизнь и работу?

Мир раскололся на две части — слава богу, неравные части: те, кто меня поддерживает, и те, кто просто исчез. Более того, среди пропавших без вести есть люди, которых я никак не мог заподозрить в том, что они могут разорвать все связи (из-за санкций). И я не говорю о деловых связях — это я как-то понимаю. Я имею в виду обычные человеческие отношения. Конечно, у меня были трудности с ведением бизнеса и там, и здесь.Что касается благотворительности, то все проекты за рубежом пришлось закрыть, а в России наши возможности были ограничены. Мы поддерживали Большой театр, Мариинский театр, различные музейные проекты, многие благотворительные фонды. Но сейчас, к сожалению, из-за санкций финансирование многих из этих проектов пришлось прекратить.

Ваши счета в американских и швейцарских банках на сумму более 1,5 миллиарда долларов были заморожены. Есть ли способ использовать эти деньги?

Более крупные суммы замораживаются и могут использоваться только с разрешения Министерства финансов США.Мне не разрешили использовать деньги на благотворительность, даже на борьбу с пандемией. Мы говорили об относительно небольших суммах, нескольких миллионах долларов, которые я хотел перевести, чтобы помочь в борьбе с COVID-19 в Европе. Для меня это стало неприятным открытием. Как можно отклонить запрос на перевод денег нуждающимся в такое трудное время? После того, как разразилась пандемия, мы немало поработали в России. В этих проектах участвовали все предприятия Группы «Ренова», каждый по-своему.Мы закупили тесты на COVID-19 и аппараты ИВЛ, разослали лекарства по всей стране и просто помогали региональным организациям по запросу. Наш бизнес в аэропорту принимал очень активное участие, доставляя еду для пожилых людей. Общая сумма, которую мы потратили в прошлом году на борьбу с COVID-19, составляет около двух миллиардов рублей.

Но в то же время у нас есть крупный международный бизнес, поэтому я лично получил много обращений за помощью, в том числе от еврейских общин в Швейцарии. Моя естественная реакция была такой: «У одного из наших предприятий заморожены деньги на счету в швейцарском банке, так что возьмите их и помогите членам вашего сообщества.«Это не для моего личного использования, не для моего бизнеса, а исключительно для благотворительности. Мы отправили запрос в Казначейство. Это превратилось в очень долгую историю и закончилось ничем — ни ответом, ни да, ни нет.

Предпринимали ли вы какие-либо дальнейшие попытки?

Я сделал это летом, когда американский Forbes организовал крупную благотворительную онлайн-конференцию. Меня пригласили, что было странно, так как я нахожусь в санкционном списке. Это была очень респектабельная конференция. Обращения выступили величайшие благотворители со всего мира.Именно здесь Билл Гейтс объявил о своем пожертвовании в размере 300 миллионов долларов на разработку вакцины. Сказанные там слова были настолько правдивыми. С большим обращением выступила Урсула фон дер Ляйен [президент Европейской комиссии]. Она призвала всех присоединиться к усилиям по борьбе с пандемией. Она произвела на меня впечатление, и после конференции я отправил ей письмо с объяснением моей ситуации и того, что я хочу помочь тем, кто в Европе в этом нуждается. Я попросил ее помочь мне получить одобрение Министерства финансов США. Кто-то из ее офиса ответил примерно так: «Мы не совсем поняли, о чем вы говорите, и, конечно, мы все за поддержку всех, но какое отношение к этому имеют санкции?» Я отправил ей более подробное письмо, и на этом история заканчивается.

Ваши американские проекты тоже не финансируются? Например, Форт Росс?

Некоторое время назад у нас было несколько проектов в США, в основном в сфере инновационных технологий. А вот Форт Росс — благотворительный проект. Это небольшая русская крепость в Калифорнии, построенная в начале 19 века. Мы помогли его восстановить. Соглашение было подписано с Арнольдом Шварценеггером, когда он был губернатором Калифорнии. Проект развивался с большим энтузиазмом: действовал музей, мы проводили республиканские мероприятия и исторические реконструкции, привозили туда детей, снимали фильмы.Но все остановилось из-за санкций, и теперь мы ничем не можем помочь. Последнее, что мы сделали, — это установили большую ветряную мельницу, которую построили в российской Вологде по старым чертежам и перевезли в Калифорнию.

Какие еще инновационные проекты Вы упомянули?

У нас был достаточно крупный инновационный фонд, который составлял около 40 проектов, но все остановилось. Кстати, что касается благотворительности, вот еще интересная история. Возвращение колоколов Данилова монастыря из Гарварда на их прежний дом в России.Еще в 1930-х годах монастырские колокола собирались переплавить, чтобы бронзу можно было использовать в другом месте. Чарльз Крейн, американский бизнесмен и выпускник Гарварда, купил все 18 колоколов по цене металлолома и перевез их в США. Колокола были установлены на колокольне Гарварда. В середине 2000-х к нам обратились представители Русской Православной Церкви с просьбой помочь вернуть колокола. Они пытались договориться с американцами, но не смогли. Я думал, что задача довольно простая.Американцы поймут историческую ценность и ее значение для страны и обязательно согласятся вернуть колокола. Я поехал в Бостон и встретился с президентом Гарварда, который сначала отреагировал, что нет, колокола принадлежат им, и нет никаких шансов вернуть их.

Мы начали их убеждать и нашли сторонников, которые нам помогли. В конце концов мы достигли договоренности в 2007 году. Они потребовали, чтобы мы сделали точные копии колоколов, и мы сделали. Их отлили в Воронеже, а люди из Гарварда приехали просто проверить куранты — настаивали на точном совпадении.Мы потратили на это много времени и денег, от 7 до 8 миллионов долларов. Колокола были доставлены морским путем в Санкт-Петербург и освящены на площади перед Исаакиевским собором, а затем доставлены в Москву на грузовиках-платформах. По прибытии в Москву состоялась церемония их возведения в Данилов монастырь. На протяжении всего пути к колоколам встречали толпы верующих.

И за это Вы получили Почетную грамоту Патриарха Алексия.

Да, Патриарх наградил меня орденом Сергия Радонежского.

У вас был еще один американский проект, вы купили знаменитые императорские пасхальные яйца Фаберже у семьи Форбс, которые собирались выставить на аукцион Sotheby’s. Как вам удалось отменить аукцион и сколько это вам обошлось?

Все началось с новости о том, что семья Форбс решила продать свою коллекцию предметов Фаберже и выставить ее на аукцион Sotheby’s. Был издан каталог всей коллекции, насчитывающий около 200 предметов, в том числе девять императорских пасхальных яиц.Малькольм Форбс и его жена собирали предметы в течение нескольких десятилетий, и каждый выставлялся на продажу отдельно по своей цене. Я осознал историческую ценность коллекции для России и то, как было бы здорово вернуть ее домой целиком. Мы отправили Forbes предложение, основанное на средней каталожной цене каждого предмета в коллекции. Никто особо не верил, что это получится, но случилось чудо: они ответили, что готовы продать всю коллекцию, не выходя на аукцион.Теперь у меня есть вырезка из New York Times, рассказывающая эту историю в рамке. Почему братья Форбс согласились? Им, вероятно, было жаль продавать коллекцию по частям, поэтому они продали ее при условии, что коллекция останется полной и будет доступна для всеобщего обозрения.

Примечательно, что многие предметы коллекции использовались членами семьи Форбс в повседневной жизни — настольные принадлежности, посуда и т. Д. Они не намеревались сохранять свою историю для музея, в отличие от нас.Нас попросили провести выставку в Нью-Йорке, прежде чем увезти коллекцию в Россию. Мы по-прежнему поддерживаем связь, а Кристофер является членом Попечительского совета музея Фаберже.

Правильно ли мы поняли? Вы купили коллекцию за 100 миллионов долларов?

Ну как то так.

А сколько вы вложили в создание музея Фаберже?

Около 50 миллионов долларов, если брать только реконструкцию Шуваловского дворца.Я хотел создать музей в Москве, и мы много времени вели переговоры с Юрием Михайловичем [Лужков, тогда мэр Москвы]. Я попросил его выбрать здание в центре Москвы, но он не сделал этого. Однако Валентина Ивановна [Матвиенко, тогдашний губернатор Санкт-Петербурга] почти сразу же предложила сдать Шуваловский дворец при условии, что мы его отремонтируем. Он был в руинах. На его ремонт мы потратили более четырех лет. Было очень интересно перелистывать страницы советской истории и постепенно погружаться в мир России XIX века.Первоначально дворец принадлежал семье графа Нарышкина и был передан графу Шувалову. Потомки Нарышкиных до сих пор живут в России и Швейцарии. Они были у нас и привезли старые фотографии. Действительно увлекательно.

Приносит ли музей прибыль?

Никакой прибыли [смеется]. Для работы такого музея недостаточно коммерческого успеха. Лучшие музеи мира существуют только благодаря их спонсорам и благотворителям. Одна только наша постоянная экспозиция в настоящее время содержит 4000 предметов, на сбор которых, кстати, потребовалось намного больше денег, чем на покупку коллекции Forbes.И мы пошли еще дальше, организовав «внешние» (вспомогательные) выставки, доставив выставки Фриды Кало и Сальвадора Дали в Санкт-Петербург и Москву.

Интересуют ли работы этих художников лично вас или это выбор музея?

В основном я привез Дали. Я очень интересуюсь его личностью и философией, и особенно мне нравится его наблюдение, одно из моих любимых: «Я слишком умен, чтобы быть хорошим художником».

Есть ли в вашей коллекции его картины? Вы что-то покупали за последние несколько лет?

Да, у меня есть Дали, но я ничего не покупал последние три года.Я не могу участвовать в международных аукционах по известным причинам.

Вы очень много занимаетесь воспитанием детей; Вы председатель Попечительского совета Международной гимназии «Сколково». Какое отношение вы имеете к Образовательному центру «Сириус», которому вы передали в 2015 году свой роскошный отель, построенный для размещения гостей Олимпийских игр? Почему пришлось отдать его детям?

Логика тогдашнего руководства страны была проста. Что делать с (физическим) материальным наследием, оставленным Олимпийскими играми? Поэтому у них возникла идея создать крупный детский центр, который мог бы использовать сочинские спортивные площадки и другие объекты.Мы были лучшими — никто не построил ничего лучше нас. Приехала высокопоставленная делегация и согласилась, что это лучший вариант.

Так вас заставили сдать?

Нас очень вежливо спросили. Поверьте, они могут спрашивать по-разному. И нам возместили все расходы до последней копейки. Сириусу также был предоставлен выставочный центр, где они открыли лаборатории; была построена школа. В итоге у ребят появился серьезный инновационный образовательный центр. Было бы обидно, если бы отель передали кому-то другому, независимо от того, под каким знаком этот кто-то действовал.Но поскольку его передали детям, я очень доволен.

Какой ваш любимый детский проект?

Мой любимый детский проект — KES Basket — Школьная баскетбольная лига. Более десяти лет мы продвигаем детский баскетбол. Мы с нуля создали настоящую школьную баскетбольную лигу. Он начался с местного проекта в Перми и теперь охватывает 69 регионов и несколько соседних стран. Более миллиона мальчиков и девочек — не только из крупных городов, но и из небольших деревень — борются за главный приз — поездку на мероприятие «Финал четырех» Евролиги.Мы очень гордимся этим проектом!

(PDF) Порядковые суждения в анализе решений по множеству атрибутов

сделки могут привести к удовлетворительному, легко объяснимому и надежному решению. Такие формы человеческого суждения

позволяют проводить логический анализ

извлеченной предпочтительной информации, обнаруживать

возможных несоответствий и преодолевать эти

посредством дополнительного анализа.

Приложение A. Доказательство правила

У нас есть это для каждого q; p2K9tðqÞ, tðpÞsuch

, которое (aiq, aip) предпочтительнее или в равной степени предпочтительнее —

может (ajtðqÞ, ajtðpÞ).Это означает, что

kqvqðaiqÞþkpvpðaip Þ

PktðqÞvtðqÞðajtðqÞÞþktðpÞvtðpÞðajtðpÞÞ:

Суммируя эти неравенства для каждой пары оце-

товарищей, получаем

X

Q q¼1

kqvqðaiqÞPX Q

q¼1 kqvqðajqÞ:

Таким образом, vðaiÞPðvajÞ; и ai предпочтительнее или

в равной степени предпочтительнее aj.

Ссылки

Barron, F.H., 1973. Использование методов Фишберна для анализа деревьев решений

: некоторые примеры.Decision Sciences 4 (2), 247–

267.

Barron, F.H., 1992. Выбор лучшей альтернативы с несколькими атрибутами

с частичной информацией о весах атрибутов. Acta

Psychologica 80, 91–103.

Barron, F.H., Barrett, B.E., 1996. Качество решения с использованием ранжированных весов атрибутов

. Наука управления 42 (11),

1515–1523.

Brans, J.P., Vincke, P.H., 1985. Метод организации ранжирования предпочтений —

, метод PROMETHEE.Менеджмент

Наука 31 (6), 647–656.

Borcherding, K., Eppel, T., Von Winterfeldt, D., 1991. Com-

паритет взвешивающих суждений в мультиатрибутной утилите

измерения. Наука управления 37 (2), 1603–1619.

Кук, У. Д., Кресс, М., 1992. Порядковая информация и структура предпочтений

(модели решений и приложения).

Прентис-Холл, Энглвуд Клис, Нью-Джерси.

Corner, J.L., Kirkwood, C.W., 1991. Приложения для анализа решений.

катионов в литературе по исследованию операций, 1970–1989.

Исследование операций 39, 206–219.

Эдвардс, У., Баррон, Ф.Х., 1994. Умные и умные:

Улучшенные простые методы для измерения утилит с несколькими атрибутами. Организационное поведение и человеческое решение

Процессы 60, 306–325.

Fishburn, P.C., 1964. Теория принятия решений и ценности. Wiley, New

York.

Гудвин П., Райт Г., 1991. Анализ решений для человека —

Судебные решения по возрасту. Вили, Нью-Йорк.

Канеман, Д., Slovic, P., Tversky, A. (Eds.), 1982. Решение

по статье «Неопределенность: эвристика и предвзятость». Cambridge Uni-

Versity Press, Кембридж.

Кини, Р., 1992. Мышление, ориентированное на ценности. Гарвардский университет —

sity Press, Кембридж, Массачусетс.

Кини, Р., Райша, Х., 1976. Решения с несколькими целями —

тива: предпочтения и компромиссы. Вили, Нью-Йорк.

Кирквуд, К. В., Корнер, Дж. Л., 1993. Эффективность частичной информации

о весах атрибутов для ранжирования альтернатив

при принятии решений по множеству атрибутов.Организационное поведение

и процессы принятия решений людьми 54, 456–

476.

Кирквуд, К.В., Сарин, Р.К., 1985. Ранжирование с частичной информацией

: метод и приложение. Операции

Исследования 33, 38–48.

Korhonen, P., 1988. Подход на основе визуального ориентира к

, решающий дискретные задачи с множеством критериев. Европейский журнал

Оперативные исследования 34 (2), 152–159.

Корхонен П., Валлениус Дж., Зионц, С., 1984. Решение задачи множественных критериев

с использованием выпуклых конусов.

Наука управления 30 (11), 1336–1345.

Ларичев О.И., 1992. Когнитивная валидность в дизайне решения —

Вспомогательные методы. Журнал многокритериального анализа решений —

тезис 1, 127–138.

Ларичев О.И., Мошкович Х.М., 1995. ЗАПРОС-ЛМ —

Способ и система заказа мультиатрибутных альтернатив.

тивов. Европейский журнал операционных исследований 82, 503–

521.

Ларичев О.И., Мошкович Х.М., 1997. Устное решение

Анализ неструктурированных задач. Kluwer Academic

Publishers, Берлин.

Ларичев О.И., Мошкович Х.М., Мечитов А.И., Олсон,

Д.Л., 1993. Эксперименты, сравнивающие качественные подходы

к ранжированию мультиатрибутных альтернатив. Журнал

Анализ принятия решений по нескольким критериям 2 (1), 5–26.

Ларичев О.И., Олсон Д.Л., Мошкович Х.М., Мечитов,

А.I., 1995. Сравнение числовых и кардинальных измерений при принятии решений multiat-

tribute (насколько точно?). Организационные процессы

поведения и принятия решений 64 (1),

9–21.

Лофти, В., Стюарт, Т.Дж., Зионц, С., 1992. Интерактивная модель уровня стремления

для принятия решений по множеству критериев.

Компьютеры и исследования операций 19 (7), 671–681.

Мошкович, Х.М., Шелленбергер, Р., Олсон, Д.Л., 1998.

Данные влияют на результат больше, чем предпочтения: около

уроков от применения методов множественных атрибутов

в реальной задаче принятия решений.Системы поддержки принятия решений 22, 73–

84.

Олсон Д.Л., 1992. Обзор эмпирических исследований многокритериального математического программирования

: предметное обучение и реакция

на нелинейную полезность. Decision Sciences 23 (1), 1–20.

640 Х.М. Мошкович и др. / European Journal of Operational Research 137 (2002) 625–641

Дора Пухальская с мужем Виктором Пухальским и их сыном Анатолием Пухальским

Это я, Дора Пухальская (урожденная Гитман), мой муж Виктор Пухальский и наш сын Анатолий сфотографированы в Центральная площадь Тернополя в 1961 году.

В 1952 году поступил на агрономический факультет сельскохозяйственного техникума села Верховка Ободовского района Винницкой области. Я начал встречаться с украинским парнем еще в училище. Его звали Виктор Пухальский. Мы с Виктором полюбили друг друга и фактически стали мужем и женой в последний год обучения в колледже. Мы с Виктором поженились в 1956 году.

В 1957 году у нас родился сын Анатолий. Я осталась дома, а мой муж работал агрономом в колхозе недалеко от города. Виктор был честным человеком и не позволял никому воровать в колхозе.Руководство колхоза не очень обрадовало. Однажды Виктор купил в колхозе мешок с картошкой, но они привезли тележку с мешками с картошкой, пытаясь подкупить мужа. Он сказал им забрать его обратно. С тех пор его начальство продолжало приставать к нему и стрелять из-за незначительного недостатка. Виктор год не мог найти другую работу. Он обратился в вышестоящие инстанции и обком партии, но не смог найти с ними справедливости. Затем он написал письмо в газету «Комсомольская правда» [одна из самых популярных ежедневных газет в СССР].Он возобновил свою работу после вмешательства газеты. На этот раз Виктора отправили работать в дальний колхоз. Я последовал за ним туда, и моя мать присматривала за Анатолием. Я пошла работать директором магазина в этот колхоз. У меня был диплом агронома, но работы для меня не было. Мы пробыли там недолго, так как Виктор снова потерял работу. Мы вернулись во Владимир-Волынский и почти год жили на зарплату моей матери. Нас поддержали и родители Виктора, и мой отец.

Когда началась Великая Отечественная война, отца не было дома, он уехал в командировку.До 1945 года о нем ничего не известно. В июле 1945 года отец вернулся домой. Он ходил искать нас в 1941 году, но тогда повсюду были немцы. Отец знал, что Владимир-Волынский оккупирован, и считал, что уже мертвы. Он вернулся в Жмеринку, взял грузовик и отвез родителей, тётю Фанию и её детей на вокзал, где они сели в поезд, идущий на восток. Он тоже пошел с ними. В поезде он встретил еврейку. Ее звали Фира. Он страдал и находил у нее утешение и сочувствие.На следующий день они расстались. Отец был призван в армию. Служил в дорожно-строительном отряде, занимался монтажом мостов для передовых частей. Наш отец переписывался с этим отрядом и знал, что она родила девочку в 1942 году. Девочку назвали Эллой. Наш отец попросил нашу мать простить его и попытался объяснить, что то, что с ним произошло, было результатом боли, которую он испытывал от мысли, что мы мертвы. Он решил, что они с мамой должны забыть о том, что с ними случилось, и снова жить вместе, но наша мама была гордая женщина.Она никогда не простила нашего отца. Наш отец уехал в Киев, где жили Фира с дочерью. Он жил со второй семьей, но не терял надежды вернуть нашу маму.

Через некоторое время отец стал директором завода стройматериалов в Закарпатской области с центром в городе Тернополь. Его жена и дочь не хотели ехать за ним в этот провинциальный район, и он предложил нам поехать с ним. Моя мама настояла на том, чтобы мы приняли его предложение. В 1959 году Виктор переехал в Тернополь и устроился на завод.Затем он и мой отец вернулись, чтобы забрать меня и моего сына, и мы уехали оттуда. Мы жили в однокомнатной квартире, которую мой отец получал несколько лет, пока Виктор не ушел работать на другой завод, и мы получили трехкомнатную квартиру, в которой живем сейчас.

В 1961 году родилась наша дочь Анна, названная в честь моей бабушки Ханы, а в 1964 году родилась наша дочь Евгения. Мы были бедны. Получила лицензию на изготовление цветов и свадебных букетов, изготовила и продала свои товары. Я много работала дома, шила и вязала.У моего мужа была язва желудка, и он ездил отдыхать на курорты, а я не могла позволить себе отпуск.

Зарегистрированные избиратели штата Мичиган, по алфавиту

Измерение и характеристика отличительных клинических фенотипов с использованием модуля лобно-височной долевой дегенерации (FTLD-MOD)

@article {d0f9c591a67d44d58983812864e5a088,

title = «Измерение и характеристика отличительных клинических фенотипов Lobar-Degenepes (MOD) FTLD-модуль (модуль FTLD-Degeneporal) «,

abstract =» Введение. Модуль лобно-височной долевой дегенерации (FTLD-MOD) был разработан в качестве исследовательской нейропсихологической батареи для оценки клинических симптомов, связанных с FTLD.В этом исследовании изучали, может ли FTLD-MOD различать первичную прогрессирующую афазию (PPA) и поведенческий вариант лобно-височной деменции (bvFTD), два различных синдрома, связанных с FTLD. Методы. Ретроспективный анализ был проведен на данных, собранных при первоначальном посещении 165 субъектов с PPA, 268 с bvFTD и 251 когнитивно нормального контроля из Национального координационного центра по борьбе с болезнью Альцгеймера. Обобщенные линейные модели использовались для сравнения групповых моделей выполнения задач языка, поведения и памяти FTLD-MOD.Результаты: участники PPA показали значительно более низкие результаты по всем языковым задачам, тогда как участники bvFTD продемонстрировали худшие результаты по большинству поведенческих показателей. По характеристикам памяти отличий не было. Описательные данные по группам участников приведены для справки. Обсуждение: Результаты этой многоцентровой выборки предполагают, что FTLD-MOD может различать различные клинические фенотипы, обычно связанные с FTLD. «,

keywords =» FTLD-MOD, поведенческий вариант лобно-височной деменции, лобно-височная долевая дегенерация, первичная прогрессирующая афазия » ,

author = «Тамар Гефен и Тейлан, {Мерили А.} и Лайла Бессер, Эмма Поллнер и Анна Мошкович и Сандра Вайнтрауб «,

note =» Информация о финансировании: Эта работа была частично поддержана Премией раннего исследователя Национального координационного центра (NACC) (T. Gefen; U01 AG016976), (NIA) / NIH R01AG062566 (T. Gefen) и грант Центра исследований болезни Альцгеймера NIA / NIH (P30AG013854 (PI, Vassar)). База данных NACC финансируется NIA / NIH Grant U01 AG016976. Данные NACC предоставлены АЦП, финансируемыми NIA: P30 AG019610 (PI Eric Reiman, MD), P30 AG013846 (PI Neil Kowall, MD), P50 AG008702 (PI Scott Small, MD), P50 AG025688 (PI Allan Levey, MD, PhD), P50 AG047266 (PI Todd Golde, MD, PhD), P30 AG010133 (PI Andrew Saykin, PsyD), P50 AG005146 (PI Мэрилин Альберт, PhD), P50 AG005134 (PI Bradley Hyman, MD, PhD), P50 AG016574 ( PI Рональд Петерсен, MD, PhD), P50 AG005138 (PI Mary Sano, PhD), P30 AG008051 (PI Thomas Wisniewski, MD), P30 AG013854 (PI M.Marsel Mesulam, MD), P30 AG008017 (PI Jeffrey Kaye, MD), P30 AG010161 (PI David Bennett, MD), P50 AG047366 (PI Victor Henderson, MD, MS), P30 AG010129 (PI Charles DeCarli, MD), P50 AG016573 (PI Frank LaFerla, PhD), P50 AG005131 (PI James Brewer, MD, PhD), P50 AG023501 (PI Bruce Miller, MD), P30 AG035982 (PI Russell Swerdlow, MD), P30 AG028383 (PI Linda Van Eldik, PhD) , P30 AG053760 (PI Генри Полсон, MD, PhD), P30 AG010124 (PI John Trojanowski, MD, PhD), P50 AG005133 (PI Oscar Lopez, MD), P50 AG005142 (PI Helena Chui, MD), P30 AG012300 (PI Roger Розенберг, Мэриленд), P30 AG049638 (PI Suzanne Craft, PhD), P50 AG005136 (PI Thomas Grabowski, MD), P50 AG033514 (PI Sanjay Asthana, MD, FRCP), P50 AG005681 (PI John Morris, MD), P50 AG047270 ( П.И. Стивен Стритматтер, доктор медицинских наук).Информация о финансировании: эта работа была частично поддержана премией для ранних исследователей Национального координационного центра (NACC) (T. Gefen; U01 AG016976), (NIA) / NIH R01AG062566 (T. Gefen) и NIA / NIH по исследованию болезни Альцгеймера. Центр Грант (P30AG013854 (PI, Vassar)). База данных NACC финансируется NIA / NIH Grant U01 AG016976. Данные NACC предоставлены АЦП, финансируемыми NIA: P30 AG019610 (PI Eric Reiman, MD), P30 AG013846 (PI Neil Kowall, MD), P50 AG008702 (PI Scott Small, MD), P50 AG025688 (PI Allan Levey, MD, PhD), P50 AG047266 (PI Todd Golde, MD, PhD), P30 AG010133 (PI Andrew Saykin, PsyD), P50 AG005146 (PI Мэрилин Альберт, PhD), P50 AG005134 (PI Bradley Hyman, MD, PhD), P50 AG016574 ( PI Рональд Петерсен, MD, PhD), P50 AG005138 (PI Mary Sano, PhD), P30 AG008051 (PI Thomas Wisniewski, MD), P30 AG013854 (PI M.Marsel Mesulam, MD), P30 AG008017 (PI Jeffrey Kaye, MD), P30 AG010161 (PI David Bennett, MD), P50 AG047366 (PI Victor Henderson, MD, MS), P30 AG010129 (PI Charles DeCarli, MD), P50 AG016573 (PI Frank LaFerla, PhD), P50 AG005131 (PI James Brewer, MD, PhD), P50 AG023501 (PI Bruce Miller, MD), P30 AG035982 (PI Russell Swerdlow, MD), P30 AG028383 (PI Linda Van Eldik, PhD) , P30 AG053760 (PI Генри Полсон, MD, PhD), P30 AG010124 (PI John Trojanowski, MD, PhD), P50 AG005133 (PI Oscar Lopez, MD), P50 AG005142 (PI Helena Chui, MD), P30 AG012300 (PI Roger Розенберг, Мэриленд), P30 AG049638 (PI Suzanne Craft, PhD), P50 AG005136 (PI Thomas Grabowski, MD), P50 AG033514 (PI Sanjay Asthana, MD, FRCP), P50 AG005681 (PI John Morris, MD), P50 AG047270 ( П.И. Стивен Стритматтер, доктор медицинских наук).Эта работа была частично поддержана Премией раннего исследователя Национального координационного центра (NACC) (T. Gefen; U01 AG016976), (NIA) / NIH R01AG062566 (T. Gefen) и грантом NIA / NIH Центра исследования болезни Альцгеймера ( P30AG013854 (ИП, Вассар)). База данных NACC финансируется NIA / NIH Grant U01 AG016976. Данные NACC предоставлены АЦП, финансируемыми NIA: P30 AG019610 (PI Eric Reiman, MD), P30 AG013846 (PI Neil Kowall, MD), P50 AG008702 (PI Scott Small, MD), P50 AG025688 (PI Allan Levey, MD, PhD), P50 AG047266 (PI Todd Golde, MD, PhD), P30 AG010133 (PI Andrew Saykin, PsyD), P50 AG005146 (PI Мэрилин Альберт, PhD), P50 AG005134 (PI Bradley Hyman, MD, PhD), P50 AG016574 ( PI Рональд Петерсен, MD, PhD), P50 AG005138 (PI Mary Sano, PhD), P30 AG008051 (PI Thomas Wisniewski, MD), P30 AG013854 (PI M.Marsel Mesulam, MD), P30 AG008017 (PI Jeffrey Kaye, MD), P30 AG010161 (PI David Bennett, MD), P50 AG047366 (PI Victor Henderson, MD, MS), P30 AG010129 (PI Charles DeCarli, MD), P50 AG016573 (PI Frank LaFerla, PhD), P50 AG005131 (PI James Brewer, MD, PhD), P50 AG023501 (PI Bruce Miller, MD), P30 AG035982 (PI Russell Swerdlow, MD), P30 AG028383 (PI Linda Van Eldik, PhD) , P30 AG053760 (PI Генри Полсон, MD, PhD), P30 AG010124 (PI John Trojanowski, MD, PhD), P50 AG005133 (PI Oscar Lopez, MD), P50 AG005142 (PI Helena Chui, MD), P30 AG012300 (PI Roger Розенберг, Мэриленд), P30 AG049638 (PI Suzanne Craft, PhD), P50 AG005136 (PI Thomas Grabowski, MD), P50 AG033514 (PI Sanjay Asthana, MD, FRCP), P50 AG005681 (PI John Morris, MD), P50 AG047270 ( П.И. Стивен Стритматтер, доктор медицинских наук).Авторские права издателя: {\ textcopyright} 2020 Авторы. Альцгеймер и деменция, опубликованные Wiley Periodicals, Inc. от имени Ассоциации Альцгеймера. «,

год =» 2020 «,

месяц = ​​июнь,

день =» 1 «,

doi =» 10.1002 / alz.12098 «,

language =» Английский (США) «,

volume =» 16 «,

pages =» 918-925 «,

journal =» Alzheimer’s and Dementia «,

issn =» 1552-5260 «,

publisher =» Elsevier Inc.»,

number =» 6 «,

}

Haspin киназа модулирует ядерную архитектуру и Polycomb-зависимое подавление гена

Abstract

Было показано, что Haspin, высококонсервативная киназа у эукариот, ответственна за фосфорилирование гистона h4 по треонину 3 (h4T3ph) во время митоза у млекопитающих и дрожжей. Здесь мы сообщаем, что haspin — это киназа, которая фосфорилирует h4T3 в Drosophila melanogaster и участвует в слипании сестринских хроматид во время митоза.Наши данные показывают, что haspin также фосфорилирует h4T3 в интерфазе. h4T3ph локализуется в широких заглушенных доменах в гетерохроматиновых и обогащенных ламином эухроматических областях. Потеря шпильки ставит под угрозу инсуляторную активность в анализах блокирования энхансеров и запускает уменьшение размера ядра, которое сопровождается изменениями морфологии ядерной оболочки. Мы показываем, что haspin является супрессором позиционно-зависимого разнообразия, участвующего в организации гетерохроматина. Наши результаты также демонстрируют, что haspin необходим для чувствительного к спариванию сайленсинга, и он необходим для устойчивого Polycomb-зависимого сайленсинга гомеотических генов.Haspin связывается с комплексом cohesin в интерфазе, опосредует связывание Pds5 с хроматином и кооперируется с Pds5-cohesin для модификации Polycomb-зависимых гомеотических преобразований. Таким образом, это исследование раскрывает неожиданную роль haspin киназы в организации генома интерфазных клеток и демонстрирует, что haspin необходим для регуляции гомеотических генов.

Информация об авторе

Haspin — это высококонсервативная киназа эукариот, участвующая в организации хромосом во время митоза.В этом исследовании мы продемонстрировали, что шпилька также необходима для поддержания правильной организации хроматина во время интерфазы. Наш анализ показал, что Drosophila haspin необходим для инсуляторной активности, ядерной архитектуры, организации гетерохроматина и чувствительного к спариванию сайленсинга генов. Мы также обнаружили, что haspin модулирует ассоциацию Pds5-cohesin с хроматином, и он необходим для надежного подавления гомеотического гена, опосредованного Polycomb. В целом наши результаты показывают, что киназа haspin является ключевым элементом в организации хроматина и тем самым регулирует экспрессию генов.

Образец цитирования: Fresán U, Rodríguez-Sánchez MA, Reina O, Corces VG, Espinàs ML (2020) Киназа Haspin модулирует ядерную архитектуру и Polycomb-зависимое молчание генов. PLoS Genet 16 (8): e1008962. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008962

Редактор: Ками Ахмад, Центр исследования рака Фреда Хатчинсона, США

Поступила: 10 октября 2019 г .; Принят в печать: 29 июня 2020 г .; Опубликовано: 4 августа 2020 г.

Авторские права: © 2020 Fresán et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в рукописи и ее файлах вспомогательной информации, за исключением файлов ChIP-seq, которые доступны в базе данных NCBI GEO (инвентарный номер GSE98223).

Финансирование: Эта работа была поддержана Министерством экономики и конкуренции Испании (BFU2013-48712-P) и Женералитатом Каталонии (SGR2017-475).У. Ф. и М. Р-С. подтвердить получение докторских стипендий от Consejo Superior de Investigaciones Cientificas и Ministerio de Economia y Competitividad соответственно. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Организация генома в ядре клетки играет важную роль в регуляции экспрессии генов во время клеточной дифференцировки и развития [1,2].Инсуляторные или архитектурные белки являются важными компонентами трехмерной организации хроматина, опосредуя дальнодействующие взаимодействия между удаленными участками генома. Текущие результаты предполагают, что архитектурные комплексы выполняют две взаимосвязанные функции: организовывать геном в доменах и облегчать взаимодействие между регуляторными элементами [3,4,5]. Несколько архитектурных белков были охарактеризованы в Drosophila melanogaster , включая ДНК-связывающие белки (CTCF, SuHw, BEAF-32, GAGA, DREF, TFIIIC, Z4, Elba, ZIPIC, Ibf1 и Ibf2), которые привлекают вспомогательные факторы (CP190, mod (mdg4), Rad21, Cap-h3, Fs (1) hL, L (3) mbt и хромататор), чтобы опосредовать взаимодействия хроматина [6].Небольшое количество архитектурных белков было охарактеризовано у млекопитающих, и среди них, CTCF и cohesin, как было показано, также поддерживают взаимодействия между удаленными сайтами в геноме [5].

Регуляция генов дальнего действия также включает эпигенетические компоненты, такие как белки группы Polycomb (PcG) [7,8,9,10,11]. У Drosophila гомеотические (Hox) гены, которые кодируют эволюционно консервативные главные регуляторы развития, являются наиболее заметными мишенями для PcG. Точная пространственно-временная экспрессия Hox-генов включает сложный набор энхансеров, промоторов, элементов ответа polycomb (PRE) и инсуляторов.С помощью методов флуоресцентной гибридизации in situ и захвата конформации хромосом было продемонстрировано, что организация хроматина в локусе Abdominal-B ( Abd-B ) в комплексе bithorax (BX-C) является критическим детерминантом. регуляции экспрессии гена. Несколько отчетов показали, что инсуляторы и PRE взаимодействуют с промотором Abd-B в тканях, где ген не экспрессируется, и для этих взаимодействий необходимы Polycomb и инсуляторные / архитектурные белки CTCF и CP190 [12,13,14,15 ].

Модификации гистонов и ответственные за них ферменты также играют важную роль в регуляции организации хроматина. Haspin, высококонсервативная киназа у эукариот, ответственна за фосфорилирование гистона h4T3 во время митоза [16]. Было показано, что киназа Haspin участвует в слипании сестринских хроматид [17] и необходима для локализации Chromosomal Passenger Complex (CPC) на митотическом хроматине в центромерах для активации Aurora B, которая регулирует прикрепление кинетохор к микротрубочкам [18,19,20] .В делящихся дрожжах и клетках млекопитающих haspin, как было показано, связывает cohesin-ассоциированный белок Pds5 на центромерах и противодействует фактору разгрузки cohesin Wapl [21,22,23]. Было показано, что дефосфорилирование h4T3ph при выходе из М фазы необходимо для деконденсации хромосом и реформирования ядерной оболочки [24]. Сообщалось, что киназа Haspin сильно активируется Cdk1 и Polo-подобной киназой в митозе [25,26]. Однако haspin содержит атипичный домен протеинкиназы, который сохраняется от дрожжей до человека, и не требует фосфорилирования в петле активации для активности, что позволяет предположить, что он может быть частично активным на протяжении всего клеточного цикла.Мы показываем здесь, что haspin необходим для инсуляторной активности, позиционно-зависимого разнообразия (PEV) и чувствительного к спариванию молчания (PSS), модулирующего ядерную архитектуру в интерфазе. Мы также демонстрируем, что haspin необходим для надежного Polycomb-зависимого сайленсинга гомеотических генов. В целом наши результаты показывают, что Drosophila haspin kinase участвует не только в организации хромосом во время митоза, но также в организации генома в интерфазных клетках, играя функциональную роль в регуляции генов.

Результаты

Киназа Haspin необходима для инсуляторной активности

Чтобы идентифицировать новые белки с инсуляторной активностью, мы выполнили скрининг мутагенеза у Drosophila путем случайной транспозиции P-элемента. Новые вставки были проанализированы на предмет изменений в экспрессии репортерного гена в анализах блокирования энхансера с использованием трансгенной линии, которая содержит граничный / инсуляторный элемент Fab7 BX-C между энхансером white и репортерным геном mini-white ( В7 ^27.1 , S1 фиг.), Который блокирует активацию промотора дистальным энхансером. Любое ослабление активности инсулятора должно обеспечивать связь между энхансером и промотором репортерного гена white , увеличивающего цвет глаз. Среди всех линий, показывающих значительное облегчение блокирования энхансеров, мы дополнительно изучили линию 86 (фиг. 1A). Вставка P-элемента в этой линии была картирована с первым экзоном в 5’UTR гена haspin (S2A на фиг.). Мы проанализировали экспрессию haspin в гомозиготной линии и наблюдали сильное снижение уровней транскриптов, указывающее, что haspin ⁸⁶ является либо нулевым, либо сильным гипоморфом haspin alelle (S2B фиг.).Путем мобилизации P-элемента в строке 86 мы получили линию 128, которая содержит частичную делецию P-элемента, первого и второго экзонов и части второго интрона гена haspin (S2A фиг.), Что, вероятно, делает ген нефункциональным. . Haspin ¹²⁸ гомозиготные мутантные мухи жизнеспособны, они демонстрируют снижение продолжительности жизни взрослых особей, которое сильнее у самок, чем у самцов (фиг. S2C), и явно страдает плодовитость обоих полов (фиг. S2D).

Рис 1.Изолирующая активность шайбы.

A) Цвет глаз типичных мух в анализах на блокирование энхансеров с использованием трансгенной линии B7 ^27.1 , которая содержит инсуляторный элемент Fab7 на фоне дикого типа и гетерозиготной линии 86. B) Цвет глаз типичных мух в анализах блокирования энхансеров с использованием трансгенной линии F7 ^2,5 , которая содержит инсулятор Fab7 и элементы PRE на фоне мутантной haspin RNAi. C) Количественный анализ пигмента глаз у мух с помощью F7 ^2.5 и указанные генотипы. n = 3, значимые различия между диким типом и различными мутантными фонами, как определено с помощью теста Стьюдента t (p <0,001). D) Количественный анализ глазного пигмента у мух с конструкциями, содержащими инсуляторные элементы Fab6 , Fab7 и Fab8 (см. Детали конструкций на фиг. S1) у дикого типа и haspin ¹²⁸ гетерозиготных мутантов. фон (n = 3).Статистическую значимость (** p <0,01 и *** p <0,001) определяли с помощью теста Стьюдента t .

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008962.g001

Чтобы дополнительно установить роль haspin в функции инсулятора, мы выполнили анализы блокирования энхансеров с независимым мутантным фоном и различными элементами инсулятора. Мы сбивали уровни хомутов с помощью системы UAS / Gal4. Наши результаты показывают явное увеличение пигментации глаз у мух со сниженным уровнем шипов при использовании другой трансгенной линии, которая содержит элемент Fab7 BX-C (рис. 1B).Действительно, количественный анализ показал значительное облегчение активности блокирования энхансера Fab7 и в различных мутантных линиях haspin, что аналогично тому, которое наблюдается на фоне мутантного инсуляторного белка CP190 (рис. 1C). Более того, аналогичные эффекты были получены с использованием трансгенных линий, содержащих либо элементы инсулятора Fab6 , либо Fab8 между энхансером white и репортерным геном mini-white (рис. 1D). Эти результаты указывают на то, что haspin необходим для функции различных инсуляторов комплекса bithorax, и предполагают, что haspin может участвовать в модуляции организации хроматина более высокого порядка BX-C.

Haspin — это высококонсервативная киназа, которая, как было показано, ответственна за митотическое фосфорилирование гистона h4 по треонину 3 в центромерных областях у дрожжей и млекопитающих [27]. Чтобы проанализировать, выполняет ли haspin эту функцию у Drosophila , мы провели иммуноокрашивание метафазных хромосом в головном мозге личинок Drosophila с использованием антител против h4T3ph и маркера центромеры Cenp-C.Наши результаты показывают, что h4T3ph сконцентрирован во внутренней центромере между парными областями Cenp-C и что сигнал h4T3ph полностью исчезает в haspin ¹²⁸ мутантном фоне (Рис. 2A и S3A Рис.). Эти анализы проводились в присутствии колцемида, который задерживает клетки в длительной прометафазе, что приводит к открытию плеч сестринских хроматид для образования Х-образных хромосом [28]. Наши анализы показывают, что истощение haspin нарушает связь между сестринскими хроматидами в центромерах (S3A Fig, см. Различия в связи между хроматидами в панелях ДНК), как ранее сообщалось у млекопитающих [17].Действительно, расстояние между кинетохорами на разбросах хромосом, полученных из мутантного мозга haspin ¹²⁸ , которое измеряли с использованием маркера центромеры Cenp-C, было на 30% дальше по сравнению с контролем (S3B Рис). Т.о., митотические функции haspin, вероятно, сохраняются у Drosophila .

Рис. 2. Киназа Haspin фосфорилирует h4T3 в митозе и интерфазе, и она необходима для связывания Pds5 с хроматином.

A) Иммунолокализация h4T3ph (зеленый) и Cenp-C (красный) в митотических клетках дикого типа и haspin ¹²⁸ мутант Drosophila личиночный мозг.ДНК окрашивается DAPI (синий). Шкала 2 мкм. B) Репрезентативное распространение политенных хромосом от дикого типа и haspin ⁸⁶ мутантных слюнных желез личинок третьего возраста, иммуноокрашенных антителами против h4T3ph (зеленый). ДНК окрашивается DAPI (синий). C) Типичный образец политенной хромосомы распространяется из слюнных желез личинок третьего возраста, которые экспрессируют Pds5-HA под контролем промотора нуббина в GFP (верхние панели) или haspin (нижние панели) на фоне РНКи, иммуноокрашенных антителами против HA (красный) и CP190 (зеленый).ДНК окрашивается DAPI (синий). D) Соотношение интенсивности иммунофлуоресценции Pds5-HA / CP190 в политенных хромосомах, распространяющихся из слюнных желез личинок третьего возраста, которые экспрессируют Pds5-HA под контролем промотора нуббина в GFP или фоне haspin RNAi. n = 5, означает и s.d. показаны. *** p <0,001 было определено с помощью теста Стьюдента t .

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008962.g002

Большинство митотических киназ должны быть фосфорилированы в петле активации для активации, и это происходит только во время митоза [29].Хотя было также показано, что киназа haspin сильно активируется в митозе за счет фосфорилирования, она по своей природе активна без фосфорилирования, что позволяет предположить, что она может быть частично активной на протяжении всего клеточного цикла [27]. Следовательно, чтобы охарактеризовать, фосфорилируется ли h4 по Thr3 во время интерфазы, мы выполнили иммуноокрашивание политенных хромосом слюнных желез Drosophila . Как показано на рис. 2B, сигналы h4T3ph наблюдаются в дискретных локусах на расширенных политенных хромосомах у личинок дикого типа, в то время как эти сигналы отсутствуют на фоне мутанта haspin ⁸⁶ (рис. 2B), что указывает на то, что требуется haspin для фосфорилирования гистона h4 по Thr3 в интерфазе.

Связывание с хроматином когезин-ассоциированного белка Pds5 зависит от haspin

Haspin и когезиновый комплекс, как было показано, функционально связаны во время митоза у млекопитающих и дрожжей. Haspin участвует в защите сцепления митотических центромер за счет связывания с cohesin-ассоциированным белком Pds5 и противодействием фактору разгрузки cohesin Wapl [21,22,23]. Поскольку наши результаты показывают, что haspin необходим для слипания центромер у Drosophila (S3 Fig), мы спросили, сохраняется ли взаимодействие haspin с Pds5 и, более того, имеет ли эта ассоциация не только во время митоза, но также и в интерфазе.Чтобы охарактеризовать взаимодействие между haspin и Pds5 во время интерфазы, мы выполнили эксперименты по коиммунопреципитации в экстрактах ядер слюнных желез личинок трансгенной линии, которые экспрессируют Pds5-HA-Flag. С этой целью мы получили антитела против haspin (см. Материалы и методы и фиг. S4A), которые были способны специфически соосаждать Pds5-HA-Flag (фиг. S4B). Чтобы дополнительно охарактеризовать это взаимодействие, мы выполнили тесты иммунолокализации Pds5 в политенных хромосомах слюнных желез личинок Pds5-HA-Flag на ложном (GFP) или наспиновом фоне РНКи.Наши результаты показывают сильное снижение связывания Pds5 с хромосомами при сбивании уровней хэшпина (рис. 2C и 2D). Поскольку отсутствие связывания Pds5 с хроматином также может отражать вклад haspin в синтез и / или стабильность белка, мы проанализировали мРНК Pds5 и уровни белка. Хотя нет значительных изменений в уровнях мРНК Pds5 (фиг. S4C), уровни белка явно снижены в личиночных слюнных железах (фиг. S4D). Эти результаты убедительно свидетельствуют о дестабилизации белка Pds5, скорее всего, из-за его неспособности связываться с haspin и хроматином.В целом, наши результаты показывают, что haspin взаимодействует с cohesin-ассоциированным белком Pds5 во время интерфазы, и он необходим для связывания Pds5 с хроматином.

Было показано, что белки Pds5 имеют как положительные, так и отрицательные эффекты на ассоциацию когезина с хроматином; они сотрудничают с Wapl в высвобождении когезина из ДНК, но они также участвуют в слипчивости во время митоза [30]. Чтобы охарактеризовать взаимосвязь между haspin и ядром когезинового комплекса, мы провели эксперименты по коиммунопреципитации с использованием экстрактов ядер слюнных желез, которые повсеместно экспрессируют субъединицу когезина Rad21, слитую с эпитопом myc на мутантном фоне Rad21 ( Vtd ^ex3 ).Антитела α-гаспина были способны специфически соосаждать Rad21-myc (S5A фиг.), что указывает на то, что haspin связывается с ядром комплекса когезина во время интерфазы. Затем мы выполнили тесты иммунолокализации в политенных хромосомах слюнных желез личинок, которые не показали явных изменений в связывании Rad21 с хромосомами в отсутствие заспина (S5B Рис., Сравните верхнюю и нижнюю панели). Мы также проанализировали экспрессию Rad21, и наши результаты показали, что уровни транскриптов аналогичны фону мутантов haspin по сравнению с контролем (S5C фиг.).Чтобы дополнительно проанализировать, модулирует ли haspin взаимодействие этого комплекса с хроматином, мы количественно оценили количество связанного с хроматином когезина в отсутствие haspin. С этой целью проводили формальдегидное сшивание ядер эмбрионов Drosophila , которые экспрессируют Rad21-myc на мутантном фоне Rad21 ( Vtd ^ex3 ) либо в контроле, либо в haspin ¹²⁸ мутантном фоне, Фракции хроматина очищали и сравнивали количество Rad21 и гистона h4.В течение первых часов развития ядра эмбриона Drosophila проходят 13 быстрых митотических делений, имеющих очень короткие S-фазы и пропускающие фазы промежутков, в то время как на более поздних этапах развития скорость митоза намного ниже. Следовательно, у ранних эмбрионов клетки большую часть времени находятся в митотической фазе клеточного цикла, тогда как у поздних эмбрионов большинство клеток находится в интерфазе. Наши анализы показали значительное снижение связанного с хроматином Rad21 в отсутствие haspin у ранних эмбрионов (0-4 часа), которое, хотя и ослаблено, также присутствует в поздних эмбрионах (20-24 часа) (S5D и S5E Fig).В целом эти данные указывают на то, что haspin модулирует динамическую ассоциацию когезина с хроматином во время клеточного цикла.

Дефекты ядерной морфологии и ядерное уплотнение во время интерфазы при отсутствии активности шипа

Мы провели эксперименты по иммуноокрашиванию на слюнных железах личинок Drosophila дикого типа и мутантных по haspin Drosophila позднего третьего возраста. Мы обнаружили, что клетки, истощенные по haspin, демонстрируют ядра неправильной формы, показывающие смятый изюмоподобный вид, выявленный иммунолокализацией ламина Dm0 (рис. 3A).Чтобы охарактеризовать субклеточную локализацию haspin, мы выполнили биохимическое фракционирование эмбрионов Drosophila , которые экспрессируют меченный эпитопом белок haspin-HA. Значительное количество haspin-HA было обнаружено во фракции ядерного матрикса, которая характеризуется присутствием ламина Dm0 (S6A на фиг.). Инсуляторный белок CP190 и белки группы Polycomb также были обнаружены в основном связанными с ядерным матриксом (S6A фиг.), Что согласуется с ранее опубликованными результатами [31,32]. Эти данные указывают на то, что haspin локализуется в ядерной пластинке и модулирует морфологию ядра.

Рис. 3. Модуляция ядерной архитектуры с помощью haspin киназы.

A) Иммуноокрашивание слюнных желез Drosophila антителами против ламина Dm0 у личинок третьего возраста дикого типа (верхняя панель) и haspin ⁸⁶ мутантный фон (нижняя панель). ДНК окрашивают DAPI. В перекрытии (правые панели) ламинат Dm0 показан зеленым, а DAPI — синим. Шкала 50 мкм. B) График в виде прямоугольников, показывающий количественную оценку сигналов DAPI ядер слюнных желез Drosophila в диком типе (WT), мутантный фон haspin ( haspin ⁸⁶ ), сверхэкспрессия haspin под контролем его собственного промотора ( haspin ^PROM ), сверхэкспрессия haspin на мутантном фоне ( haspin ⁸⁶ ; haspin ^PROM ) и в haspin, CP190 и CTCF RNA под контролем nubbin промотор (нуб> haspin ^РНКи , нуб> CP190 ^РНКи и нуб> CTCF ^RNAi ).Размер ядер был определен примерно в 50 ядрах для каждого состояния (n≥3). Указаны значения p, определенные с помощью теста Вилкоксона для различных генетических фонов по отношению к WT (*** p <0,001). C) График в виде прямоугольников, показывающий количественную оценку сигнала DAPI ядер слюнных желез Drosophila в диком типе (WT) и сверхэкспрессию под контролем 69B меченых версий либо haspin дикого типа ( haspin-HA ), либо haspin с мутированный киназный домен ( haspin ^h520A -HA и haspin ^K282M -HA ).Размер ядер был определен примерно в 50 ядрах для каждого состояния (n≥3). Значительные различия между доменами киназ дикого типа и мутированными доменами, как определено с помощью теста Вилкоксона (*** p <0,001).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008962.g003

В анализах, описанных выше, очевидны изменения в размере ядер между контрольными и истощенными слюнными железами (рис. 3A). Далее мы подробно охарактеризовали этот фенотип с помощью экспериментов по иммуноокрашиванию DAPI в отношении потери или увеличения функциональных аллелей haspin.Наш анализ показал, что у личинок позднего третьего возраста, в то время как дальнейшая репликация отсутствует, мутанты haspin демонстрируют уменьшенный размер ядер (S6B Fig, сравните WT и haspin ⁸⁶ панелей). Количественный анализ подтвердил уменьшение при отсутствии штифта (рис. 3В). Напротив, сверхэкспрессия haspin в трансгенной линии с двумя дополнительными копиями геномного локуса haspin приводила к явному увеличению размера ядра личиночных слюнных желез (фиг. 3B и S6B).Экспрессия haspin под контролем его собственного промотора на мутантном фоне полностью спасла фенотип потери функции (фиг. 3B и фиг. S6B, никаких существенных различий в размере ядер между WT и haspin не наблюдалось) ⁸⁶ ; шпилька ^PROM ). Эти измененные размеры ядер не являются следствием изменений в репликации ДНК, поскольку и WT, и мутантные слюнные железы haspin показали сходное содержание ДНК (S6C, фиг.).Когда мы снизили уровни хэспинов в ядрах слюнных желез с помощью системы UAS / Gal4 и драйвера nubbin-Gal4 , мы также наблюдали сильное уменьшение размера ядра (рис. 3B, бугорок> haspin ^RNAi lane) . Сходные эффекты были получены при отключении двух хорошо охарактеризованных инсуляторных / архитектурных белков, таких как CP190 и CTCF (рис. 3B). Чтобы охарактеризовать вклад киназного домена haspin в этот фенотип, мы получили трансгенные линии, которые экспрессируют меченные эпитопом белки haspin-HA либо дикого типа, либо с заменой Lys282Met в мотиве узнавания АТФ или His420Ala, изменение, которое было Ранее было показано, что он необходим для активности шипов у млекопитающих [33].Сходные уровни экспрессии белков, меченных эпитопом, в различных трансгенных линиях были получены с использованием системы UAS / Gal4 (S6D фиг.). Наш анализ показал, что, хотя сверхэкспрессия белка haspin-HA дикого типа на фоне нулевых мутантов была способна полностью восстановить ядерный размер клеток слюнных желез, сверхэкспрессия мертвых белков киназы — нет (рис. 3C). Таким образом, активность haspin киназы необходима для глобальной ядерной организации в интерфазных клетках.

В совокупности наши результаты показывают обширное межфазное ядерное уплотнение в клетках, истощенных по haspin, что связано с дефектами ядерной морфологии, и они предполагают, что киназа haspin является ферментативным белком, который связывается с ядерным матриксом / пластинкой, чтобы выполнять ключевые роли в организации хроматина и ядерной архитектуре. .

Haspin — подавитель пестроты позиционного эффекта

Для определения локализации h4T3ph по всему геному мы выполнили анализ последовательности иммунопреципитации хроматина (ChIP-seq) в клетках S2 с использованием антитела αh4T3ph. Участки обогащения (пики) были идентифицированы с помощью биоинформатического и биостатистического анализа согласованных данных ChIP-seq (см. Экспериментальные процедуры). Области, обогащенные h4T3ph, по всему геному накапливаются в гетерохроматических областях хромосом, где они совместно локализуются с HP1a (рис. 4A).Для статистической оценки перекрытия между сайтами связывания h4T3ph и HP1a мы использовали тесты перестановки перекрытия, которые показали высокую степень статистически значимой ассоциации (z-значение> 38, p-значение <0,01 для всех репликатов HP1a modENCODE, S7A, рис.). Мы также исследовали расположение пиков h4T3ph по отношению к различным состояниям хроматина Drosophila melanogaster 9, как определено в клетках S2 [34], и обнаружили, что они преимущественно расположены в состоянии 7, которое соответствует центромерному гетерохроматину и хромосоме 4 (S7B Инжир).В самом деле, сильная ассоциация между h4T3ph и регионами гетерохроматина была статистически оценена с использованием тестов перестановки перекрытия (положительные z-баллы для состояний 7 и 8, S7B рис.). Модель, созданная Харченко и др. [34] различает набор гетерохроматин-подобных регионов (состояние 8), обогащенных хроматиновыми метками, обычно связанными с гетерохроматиновыми регионами (h4K9me2 / me3 и HP1a), но на более низких уровнях, чем в перицентромерном гетерохроматине. Это состояние занимает обширные домены в эухроматических плечах хромосом, такие как область, показанная на рис. 4В.Линия вверху соответствует профилю связывания h4T3ph (нормализованный IP h4T3ph по сравнению с входным сигналом), а линия внизу соответствует пикам, обогащенным h4T3ph. Наши анализы показали, что h4T3ph обогащен этими гетерохроматиноподобными областями (фиг. 4B и S7B).

Рис. 4. Haspin — подавитель пестроты позиционного эффекта.

A) Данные ChIP-seq для локализации h4T3ph по всему геному. Обогащенные области HP1a (данные modENCODE, см. Текст S1) изображены ниже. B) Данные ChIP-seq для h4T3ph в области 500 т.п.н. в хромосоме 3 в клетках Drosophila S2.Показаны профили связывания CP190 и Ibf2 [66], Pol II S5ph и HP1a (данные modENCODE). Пики h4T3ph показаны в последней строке. C) Влияние мутации haspin ¹²⁸ на пестроту с эффектом положения у In (1) w ^m4 самцов (n = 3). D) Репрезентативные данные ChIP-seq для h4T3ph на участке хромосомы 3R размером 400 т.п.н. в клетках S2 Drosophila . Показаны профили связывания CP190 и Ibf2 [66], Pol II S5ph, h4K27me3 и HP1a (данные modENCODE, см. S1 Text) и ламина Dm0 [69].Пики h4T3ph показаны в последней строке.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008962.g004

Наши анализы ChIP-seq не позволяют определить, присутствует ли гетерохроматическое обогащение h4T3ph только в митотических клетках или оно также обнаруживается в интерфазных клетках, поскольку мы показали выше, что сигнал h4T3ph сильно активируется во время митоза в центромерных регионах у Drosophila (Fig 2A), как это было ранее описано у млекопитающих [25,26]. Чтобы изучить, может ли haspin участвовать в организации гетерохроматина в интерфазе, мы проанализировали вариэгацию с эффектом положения (PEV) на фоне мутантов haspin.В реаранжировке In (1) w ^m4 инверсия приводит к сопоставлению гена white с гетерохроматической областью Х-хромосомы. В этой линии распространение гетерохроматина в эухроматический домен приводит к подавлению и изменению экспрессии white [35]. Наш анализ показал, что haspin ¹²⁸ гетерозиготная мутация сильно подавляла молчание white в реаранжировке In (1) w ^m4 (рис. 4C), что указывает на то, что haspin является новым Su (var) ген (супрессор PEV), такой как Su (var) 2-5 (HP1a) и Su (var) 3-9 (гистон h4K9 метилтрансфераза) [35].Таким образом, наши результаты показывают, что haspin участвует в организации гетерохроматина, и предполагают, что фосфорилирование h4T3 с помощью haspin модулирует образование и / или стабильность гетерохроматина.

Наши анализы показали, что обогащенные h4T3ph области, обнаруженные в эухроматических плечах хромосом, часто локализованы в широко обогащенных крупных геномных областях, обычно фланкированных белками-инсуляторами, такими как CP190 и Ibf2. В то время как некоторые из этих областей обогащены HP1a, такие как область, показанная на фиг. 4B, другие, как было обнаружено, обогащены ламином Dm0.Пример этих областей показан на рис. 4D. Мы также использовали тесты перестановки перекрытия, чтобы статистически оценить расположение пиков h4T3ph в эухроматических плечах хромосом по отношению к различным состояниям хроматина [34]. Эухроматические области h4T3ph были определены как области, не перекрывающиеся с состоянием 7 хроматина, и мы обнаружили, что они предпочтительно расположены в состоянии 9, которое соответствует молчащим доменам (S7C фиг.). Области, обогащенные h4T3ph, часто обнаруживались в кластерах, представляющих большое количество областей в очень близкой последовательности, в то время как другие области с умеренным сигналом h4T3ph представляли меньшее количество редко описываемых областей, как это показано линией внизу на рис. 4B и 4D и S8A. Инжир.В зависимости от плотности накопления области, обогащенные h4T3ph, при визуальном осмотре были описаны как высоко или слабо обогащенные (S8A фиг., Области b и c соответственно). Мы наблюдали, что в то время как области с высоким (плотным) обогащением h4T3ph имели тенденцию к совместной локализации с ламином Dm0, области с низким (редким) обогащением совместно с h4K27me3, такие как область c, которая соответствует комплексу Antennapedia, предполагая, что молчащие домены PcG содержат низкие уровни h4T3ph. Наши данные ChIP-seq также предполагают, что области, обогащенные h4T3ph, не содержат сайтов связывания для активной формы РНК-полимеразы II, фосфорилированной по серину 5 (фиг. 4B и 4D и S8A фиг.).Действительно, общие сравнения h4T3ph с сайтами связывания активной РНК-полимеразы II показали взаимно антагонистическое расположение (S8B фиг.). В целом, наши результаты показывают, что фосфорилированный гистон h4 по Thr3 колокализуется с молчащим хроматином.

Haspin необходим для надежного Polycomb-зависимого гомеотического сайленсинга генов

Инсуляторные / архитектурные элементы BX-C, как было показано, участвуют в регуляции экспрессии гомеотических генов [36,37,38], и наши результаты, представленные выше, показывают, что haspin необходим для функции некоторых из этих регуляторных элементов ( Рисунок 1).Таким образом, мы проанализировали уровни экспрессии гомеотического гена с помощью обратной транскрипции с последующей количественной ПЦР и обнаружили, что ген Abd-B был дерепрессирован в мутанте (рис. 5A), что указывает на то, что haspin необходим для подавления гена Abd-B . Гомеотическое молчание генов зависит от комплексов PcG, и мы спросили, влияет ли haspin на ассоциацию хроматина комплексов PcG. Мы выполнили ChIP-анализы на мутантных фонах дикого типа и haspin ¹²⁸ и проанализировали связывание Polycomb с несколькими PRE-содержащими регуляторными элементами Abd-B .Наши результаты показывают значительное снижение связывания Pc в Mcp , Fab7 , Fab8 и промоторных областях A и B гена Abd-B в отсутствие haspin (фиг. 5B).

Рис. 5. Haspin необходим для Polycomb-зависимого сайленсинга гомеотических генов.

A) Abdominal-B уровни транскрипции, нормализованные до Actin5C у дикого типа или haspin ¹²⁸ мутантный мозг Drosophila личинок.n = 4, означает и s.d. показаны. B) ChIP-qPCR с использованием антитела против Polycomb и праймеров для указанной в качестве контрольной отрицательной области, регуляторных элементов Mcp , Fab7 и Fab8 и промоторов A и B Abd-B . входной образец) представлены как соотношение осажденной ДНК в головном мозге личинок дикого типа или ¹²⁸ Drosophila по отношению к контрольной отрицательной области.n = 3, означает и s.e.m. показаны. C) Репрезентативные примеры наблюдаемых гомеотических преобразований: вторая в первую ногу (L2-L1), третья в первую ногу (L3-L1) и крыло в жужжальца (W-H). Красным кружком отмечены половые соты, которые появляются на второй и третьей ногах самцов мух. D) Частоты гомеотических трансформаций у мух, гетерозиготных по Pc ¹ , Pc ³ или Pc ¹⁵ мутаций дикого типа или гомозиготных haspin мутантных фонов.n = 3, набрали более 20 человек. E) Цвет глаз репрезентативных мух трансгенной линии P7 ¹⁴ , содержащей гомозиготный PRE- miniwhite дикого типа или haspin ¹²⁸ мутантного фона (n = 3). F) Частоты гомеотических трансформаций у мух, гетерозиготных по мутации Pc ³ либо в генах дикого типа, либо в комбинациях гетерозиготных мутантных фонов для haspin ¹²⁸ и компонентов когезинового комплекса.n = 4, набрали более 50 человек. Статистическую значимость (* p <0,05, ** p <0,01 и *** p <0,001) определяли с помощью теста Стьюдента t (A и B) или теста z (D и F).

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1008962.g005

Чтобы дополнительно охарактеризовать участие haspin в Polycomb-зависимом подавлении гомеотического гена, мы искали фенотипические изменения на сенсибилизированном фоне. Мы проанализировали гомеотические трансформации, уже наблюдаемые у мух с дефектным сайленсингом Pc, такие как появление половых гребней на второй (L2-L1) и третьей (L3-L1) парах ног самцов мух и дефектное развитие крыльев, указывающее на крыло. для прерывания (WH) преобразования (рис. 5C).Мы обнаружили, что в трех разных фонах мутантов Pc , Pc ¹ , Pc ³ и Pc ¹⁵ [39,40,41], частота трансформации был намного выше у мух, гомозиготных по мутации haspin ¹²⁸ и гетерозиготных по мутации Pc по сравнению с животными, несущими только соответствующую мутацию Pc (рис. 5D). Более того, частоты преобразований L2-L1 и WH были также выше при сбивании уровней haspin в гетерозиготном фоне Pc ³ с использованием системы UAS / Gal4 для экспрессии haspin ^RNAi под контролем промотор Act5C (фиг. S9A).Следовательно, мутация haspin действует как усилитель мутаций Pc , и в целом эти результаты указывают на то, что haspin необходим для эффективного Polycomb-зависимого подавления гомеотического гена.

PcG, как известно, опосредуют сайленсинг не только цис, но и транс; соответственно, в трансгенных линиях PRE-опосредованное молчание является чувствительным к спариванию (PSS), которое сильнее у гомозиготных, чем у гетерозиготных индивидуумов [42]. Мы проанализировали PSS в трансгенной линии, несущей конструкцию, содержащую PRE элемента Fab7 и репортерный ген mini-white [43] в haspin ¹²⁸ мутантном фоне.Наши анализы показали явное увеличение пигментации глаз в отсутствие шипа (рис. 5E), что указывает на то, что PSS зависит от шипа. Ранее было показано, что в другой трансгенной линии встраивание трансгена Fab7 в Х-хромосому на 9,6 т.п.н. выше гребешкового гена ( sd ) индуцирует мутантный фенотип, приводящий к нарушению морфологии крыла (трансгенная линия 5F24 25,2 [44]). Этот фенотип зависит от спаривания, поскольку он наблюдается с сильной пенетрантностью до 85–95% у гомозиготных самок, тогда как он отсутствует у гетерозиготных самок или гемизиготных самцов и ослабляется мутациями в генах PcG [44,45]. .Фенотип sd у гомозиготных самок сильно подавлен в мутантном фоне haspin ¹²⁸ , причем 66% особей вообще не проявляют фенотип sd (рис. S9B). Таким образом, эти результаты указывают на то, что haspin необходим для чувствительного к спариванию PRE сайленсинга, и предполагают, что истощение haspin может усиливать гомеотические трансформации за счет потери PRE контактов и прогрессивного снижения эффективности замалчивания хроматина в последующих поколениях.

Как у Drosophila , так и у млекопитающих комплексы cohesin, как было установлено, влияют на PcG-обеспечиваемое молчание генов, поддерживая дальнодействующие взаимодействия между доменами Polycomb, которые важны для репрессии [46,47]. Мы показали выше, что haspin необходим для связывания Pds5 с хроматином (Fig 2C) и модулирует динамику cohesin (S5 Fig). Чтобы проанализировать, связаны ли haspin и cohesin функционально у Drosophila , мы охарактеризовали гомеотические трансформации у мух с комбинацией мутантных аллелей для haspin и компонентов комплекса cohesin Rad21 / Vtd и Pds5 .Хотя мутации одних только белков когезина существенно не изменяют фенотип дополнительных половых гребней Pc ³ (рис. S9C), частота трансформаций увеличивается, когда мутантные аллели когезина находятся в комбинации с haspin ¹²⁸ ( Рис 5F). Действительно, мухи, содержащие оба, Pds5 ^e6 и haspin ¹²⁸ гетерозиготных мутантных аллелей, показали сильное усиление фенотипа Pc ³ , так как почти все мухи представили преобразования L2-L1 и L3-L1 со средним числом 7 половых гребней в L2 и 4 в L3.

Итак, наши данные демонстрируют, что haspin необходим для надежной PcG-опосредованной регуляции экспрессии генов, и предполагают, что haspin и когезиновый комплекс, особенно когезин-ассоциированный белок Pds5, взаимодействуют, чтобы регулировать сайленсинг гомеотических генов.

Discussion

В этой работе мы сообщаем, что Drosophila haspin модулирует ключевые аспекты организации хроматина во время интерфазы: инсуляторную активность, индуцируемое гетерохроматином вариэгацию эффекта положения, морфологию ядра и PRE-зависимое чувствительное к спариванию молчание.Некоторые из этих аспектов могут находиться под влиянием митотических событий и, следовательно, регулироваться функциональностью шипа в организации хромосом во время митоза. Однако наши результаты также показывают, что haspin фосфорилирует гистон h4 в интерфазе и ассоциируется с комплексом cohesin, опосредующим связывание Pds5 с хроматином в интерфазных клетках, что убедительно указывает на то, что эта киназа модулирует организацию хроматина не только во время митоза, но и в интерфазе.

Thr3 в гистоне h4 расположен непосредственно рядом с Lys4, который, как было показано, триметилирован по активным промоторным сайтам [48,49].Связывание TFIID с h4K4me3, которое участвует в рекрутировании транскрипционного аппарата, сильно снижается в митозе в результате фосфорилирования h4T3 [50]. С другой стороны, исследования in vitro показали, что три-метилирование h4K4 снижает распознавание субстрата с помощью haspin, предполагая антагонизм между метилированием h4K4 и фосфорилированием h4T3 [33]. В соответствии с этими исследованиями, наши результаты показывают, что h4T3ph локализуется в гетерохроматиновых и обогащенных ламинами областях, в то время как он не колокализуется с активной РНК-полимеразой II.Несмотря на то, что в будущем потребуются исследования, чтобы выяснить, действительно ли h4T3ph никогда не колокализуется с h4K4me и не активна транскрипция, в целом эти исследования предполагают антагонизм между фосфорилированным h4T3 и активной транскрипцией. Более того, haspin предпочтительно обнаруживается в ядерной пластинке, как и инсуляторный белок CP190 и белки polycomb (наши результаты и ранее опубликованные исследования [30,31]). В то время как белки, которые связаны с транскрипционно активным хроматином, легко солюбилизируются в анализах субклеточного фракционирования, белки haspin, insulator и polycomb прочно связаны с ядерным матриксом, где они совместно локализуются с пластинками, что позволяет предположить, что ядерная организация этих белков может способствовать их функциональности.

Мы сообщаем здесь, что haspin является сильным супрессором позиционно-эффектной пестроты, играющей роль в организации гетерохроматина. Белки HP1, которые являются ключевыми компонентами гетерохроматина, как сообщается, способствуют локализации заспиновки на митотических центромерах, чтобы защищать слипчивость центромер у млекопитающих [51]. Способствуют ли белки HP1 локализации шипов на центромерном гетерохроматине в интерфазе и участвует ли фосфорилирование h4T3 в организации гетерохроматина, еще предстоит определить.

Мы также показали здесь, что haspin необходим для устойчивого Polycomb-зависимого подавления гомеотического гена на основании следующих наблюдений в отсутствие haspin: i) дерепрессия транскрипции Abd-B , ii) снижение связывания Pc на нескольких PRE- содержащие регуляторные элементы и iii) усиленные гомеотические трансформации в сенсибилизированных мутантом Pc фонах. Более того, истощение haspin оказывает сильное влияние на чувствительное к спариванию молчание, которое вовлекает дальнодействующую организацию хроматина [11,52].Наши результаты также показывают, что haspin кооперируется с Pds5-cohesin для усиления Polycomb-зависимых гомеотических преобразований. Т.о., haspin может регулировать сайленсинг гомеотических генов путем прямого воздействия на связывание белков PcG с хроматином или путем воздействия на динамику Pds5-cohesin, модулирующую организацию хроматина в доменах Polycomb. Недавние результаты указывают на важную роль комплексов cohesin в установлении и / или поддержании Polycomb-репрессированных доменов в клетках млекопитающих, но также в ограничении их агрегации [46].Мы показали здесь, что haspin обеспечивает связывание Pds5 с хроматином в интерфазе и модулирует ассоциацию cohesin с хроматином на протяжении клеточного цикла. Белки Pds5 обладают как положительными, так и отрицательными эффектами на ассоциацию cohesin с хроматином, они кооперируются с Wapl в высвобождении cohesin из ДНК, но они также необходимы для поддержания когезии сестринских хроматид в G2 / M [30]. Pds5 взаимодействует с Wapl, Dalmatian / Sororin, Eco / Eso acetyltransferase и haspin через один и тот же консервативный белок-белковый модуль [21,53].Было показано, что взаимодействию Wapl-Pds5 противодействуют Eco и Sororin в S-фазе, противодействуя способности Wapl диссоциировать когезин от ДНК [53,54]. С другой стороны, haspin, как было показано, фосфорилирует Wapl [22] и противодействует взаимодействию Wapl-Pds5, чтобы защитить собственное центромерное сцепление в митозе [21,22,23]. Хотя взаимосвязь между haspin и комплексом cohesin нуждается в дальнейшем описании, наша работа указывает на важную роль haspin в комплексной регуляции динамики Pds5-cohesin на протяжении всего клеточного цикла.

Pds5 белков также необходимы для правильного поддержания гетерохроматина [55] и участвуют в образовании петли хроматина [56,57]. Было высказано предположение, что они могут быть необходимы для пограничной функции CTCF, поскольку клетки, лишенные белков Pds5, содержат намного меньше петель, чем контрольные клетки, что сходно с эффектом истощения CTCF [57]. С другой стороны, было показано, что хроматин становится более компактным после снижения уровней CTCF и Rad21, и анализ молекулярной основы этого противоречащего интуиции поведения показал, что уплотнение может быть следствием изменений петель хроматина [58].Наши данные показывают, что haspin необходим для инсуляторной активности, ядерного уплотнения, неоднородности, вызванной гетерохроматином, и чувствительного к спариванию молчания, опосредованного PcG, что дает веские основания предполагать, что haspin может участвовать в организации генома в доменах и петлях хроматина путем модуляции Pds5 -кохезин ассоциация с хроматином.

Было высказано предположение, что ингибирование haspin может иметь сильные противоопухолевые эффекты с меньшим количеством побочных эффектов по сравнению с другими противораковыми средствами [59].Наши результаты показывают митотические дефекты у Drosophila haspin мутантов, что согласуется с ранее опубликованными исследованиями на дрожжах и млекопитающих [17,21]. Однако сообщалось, что мутанты haspin не являются летальными для почкующихся дрожжей [60] и для делящихся дрожжей [61], и наши данные показывают, что они также жизнеспособны для Drosophila , даже несмотря на то, что это влияет на продолжительность жизни и фертильность. Кроме того, наши результаты показывают, что haspin контролирует организацию генома интерфазных клеток, что вызывает опасения по поводу использования ингибиторов haspin в качестве мощных противораковых препаратов, специфичных для митозов.

Материалы и методы