Логотип сдэк вектор: Логотип СДЭК / Грузоперевозки / TopLogos.ru

Содержание

Бесплатные PNG клипарт векторы и файлы PSD для бесплатной загрузки

  • социальные медиа иконы установлен facebook

    800*800

  • значок instagram логотип instagram

    800*800

  • instagram социальные медиа значок дизайн шаблон вектор

    4167*4167

  • градиент кнопки социальных сетей

    2000*2000

  • логотип facebook значок facebook

    4167*4167

  • instagram логотип социальных медиа значок instagram

    800*800

  • значок whatsapp логотип whatsapp

    800*800

  • белый значок instagram png instagram instagram логотип

    1200*1200

  • instagram социальные медиа значок дизайн шаблон вектор

    4167*4167

  • значок instagram логотип instagram

    800*800

  • whatsapp социальные медиа значок дизайн шаблон вектор whatsapp логотип

    4167*4167

  • facebook социальные медиа значок facebook логотип

    4167*4167

  • набор иконок социальных медиа логотип

    800*800

  • красный синий против металлического шрифта

    1200*1200

  • whatsapp социальные медиа значок дизайн шаблон вектор whatsapp логотип

    4167*4167

  • значок facebook логотип facebook значок fb логотип fb

    800*800

  • значок логотипа youtube

    800*800

  • instagram значок логотип

    800*800

  • модные постепенные иконки социальных медиа

    1200*1200

  • набор иконок социальных медиа

    1099*800

  • whatsapp значок логотип

    800*800

  • значок whatsapp логотип whatsapp значок whatsapp бесплатный шаблон

    800*800

  • instagram цветной значок instagram логотип

    800*800

  • социальные медиа

    800*800

  • whatsapp значок логотип

    4167*4167

  • youtube цвет значок

    800*800

  • значок instagram логотип instagram

    800*800

  • белый значок whatsapp png

    1200*1200

  • значок instagram логотип instagram

    800*800

  • facebook логотип значок fb логотип

    800*800

  • социальные медиа иконами коллекцию

    1099*800

  • черные иконки социальных сетей

    1200*1200

  • подписка на youtube привлекательная кнопка

    1200*1200

  • whatsapp значок социальных сетей whatsapp логотип

    800*800

  • instagram логотип значок

    800*800

  • значок instagram логотип instagram

    800*800

  • значок instagram логотип instagram

    800*800

  • социальные иконки черные иконки

    1200*1200

  • корона логотип дизайн вектор

    8338*8338

  • наборы иконок для социальных сетей

    1200*1200

  • стиль граффити и элементы шрифта

    1200*1200

  • треугольник неоновый цвет светящийся

    2000*2000

  • набор иконок социальных медиа

    813*800

  • чат значок

    800*800

  • золотая корона векторный дизайн

    5000*5000

  • кофе

    1200*1200

  • стрелка в плоском стиле стрелка символ веб дизайн

    800*800

  • акварель цветочные открытки шаблон с геометрическим золотым рисунком цветка и сохранить дату многоцелевой

    1200*1200

  • набор иконок социальных медиа

    1200*1200

  • youtube подписаться кнопку вектор баннер

    2500*2500

  • СДЭК Пенза ул Центральная 1 к2

    Наименование:
    Подразделение службы доставки "Экспресс-курьер" (ТК СДЭК, транспортная компания)

    Код подразделения:
    PNZ2

    Адрес:
    440004, Российская Федерация, Пензенская область, г.
    Пенза, ул. Центральная, д. 1 к2, на карте

    Номер телефона:
    +7 (8412) 98-98-36

    Руководитель:
    нет данных

    Электронная почта:
    [email protected]

    Официальный сайт:
    www.cdek.ru

    Пункт выдачи / приёма:
    Есть

    Весовые ограничения:
    0 - 30 кг

    Реклама

    Офис на карте

    Ближайшая остановка: ТЦ «Ритэйл-Парк»
    Доехать до остановки ТЦ «Ритэйл-Парк», У входа в гипермаркет «Вектор» с левой стороны

    Режим работы

    Работает:
    Пн. - Пт. - с 10:00 до 20:00
    Сб. - Вс. - с 10:00 до 16:00
    Без перерыва

    Приём и выдача грузов:
    Пн.- Вс. - в течение всего рабочего дня

    *Рекомендуем перед посещением офиса уточнить по контактным телефонам график приёма

    Услуги ПВЗ

    • Выдача заказов;
    • Приём отправлений;
    • Примерочная

    Способы оплаты:
    5
     
    • Наличные;
    • Банковские карты;
    • Наложенный платеж;
    • Электронные деньги;
    • Платежные терминалы и банкоматы

    Срок хранения заказов:

    • в пункте выдачи - 7-14 дней (бесплатно)
    • на складе - до 3-х лет (не востребовано)

    Для получения отправления необходимо:

    • документ удостоверяющий личность (например, паспорт)
    • 10-ти значный номер отправления (содержится в SMS при поступлении заказа в ПВЗ)

    Отзывы

    Пожалуйста, оставьте небольшой отзыв об этом пункте выдачи. Большое спасибо!

    Другие офисы города

    Доставка

    Наша компания осуществляет доставку по территории РФ и стран СНГ.

    Доставка по территории РФ

    Российская Федерация состоит из 85 равноправных субъектов: 22 из которых являются республиками, 46 - областями и 9 краями. Мы можем доставить товар в любой из этих субъектов!

    Краснодар, Майкоп, Челябинск, Уфа, Улан-Удэ, Пенза, Махачкала, Назрань, Великий Новгород, Нальчик, Элиста, Черкесск, Петрозаводск, Сыктывкар, Петропавловск-Камчатский, Йошкар-Ола, Саранск, Якутск, Владикавказ, Казань, Тамбов, Кызыл, Ижевск, Абакан, Чебоксары, Барнаул, Краснодар, Красноярск, Владивосток, Ставрополь, Белгород, Хабаровск, Благовещенск, Архангельск, Астрахань, Брянск, Владимир, Волгоград, Вологда, Воронеж, Иваново, Иркутск, Калининград, Калуга, Кемерово, Киров, Кострома, Курган, Курск, Санкт-Петербург, Липецк, Магадан, Москва, Мурманск, Нижний Новгород, Новосибирск, Омск, Оренбург, Орел, Пермь, Псков, Ростов-на-Дону, Рязань, Самара, Саратов, Южно-Сахалинск, Екатеринбург, Смоленск, Тверь, Томск, Тула, Тюмень, Ульяновск, Чита, Ярославль, Биробиджан, Нарьян-Мар, Дудинка, Ханты-Мансийск, Анадырь, Тура, Салехард, Грозный и это лишь малая часть городов в нашем списке доставки!

    Доставка по странам СНГ

    Список стран, с которыми мы работаем: Белоруссия, Казахстан, Армения, Азербайджан, Узбекистан, Киргизия

    Транспортные компании

    С каждым годом количество транспортных компаний увеличивается и на рынке доставки появляется серьезная конкуренция. Уже много лет мы сотрудничаем с лучшими, по нашему мнению, компаниями - это «Деловые линии» и «СДЭК». Крупногабаритные грузы отправляем Деловыми линиями, а более легкие (до 5 кг) и мелкие (до 0,1 м.куб) компанией СДЭК. Для отправки грузов в ближайшее зарубежье мы пользуемся услугами транспортных компаний «Глотус» или «Транслогистик». Данные компании за годы сотрудничества показали свою компетентность, надежность и оперативность. При желании, Вы можете выбрать любую другую транспортную компанию, через которую мы осуществим доставку приобретенного оборудования.

    Расчет доставки

    Расчет стоимости доставки производится на сайте выбранной транспортной компании.

    Для расчета Вам понадобится информации о габаритах и весе оборудования, ее Вы сможете найти в характеристиках товара. Доставка оплачивается при получении заказа.

    Стоимость доставки

    Москва

    Стоимость товара до 10000 р – 500 руб

    Стоимость товара более 10000 р –бесплатно

    МКАД и Мо - рассчитывается индивидуально и зависит от общей стоимости заказа и километража.

    Наш склад

    Наш основной склад находится в Московской области в г. Коломна


     

     

    Новый вектор развития для фабрики PROFI DRESS и Самарского колледжа сервисных технологий и дизайна

    В этом году сентябрь задал новый вектор развития для фабрики PROFI DRESS и Самарского государственного колледжа сервисных технологий и дизайна.

    Вчера я была приглашена в колледж на торжественное открытие мастерской «Цифровой модельер». О такой автоматизированной мастерской можно только мечтать! Помимо программ, плоттера и отлично оборудованных мест, здесь есть БОДИСКАНЕР, который позволяет за несколько секунд определить 150 размерных признаков фигуры человека и создать ее 3D-модель. Это позволит шить одежду, которая будет максимально хорошо сидеть по фигуре каждого клиента.

    Это удачное приобретение колледж получил во многом из-за стараний его директора, Татьяны Александровны Санниковой. Она – настоящий фанат своего дела, который не жалеет сил для того, чтобы студенты ее заведения учились в самых лучших условиях и имели возможность работать с передовыми технологиями.

    Я посетила корпус, в котором обучают на портных, модельеров, дизайнеров, конструкторов – приятно знать, что учащиеся с таким хорошим базисом когда-нибудь станут и нашими будущими кадрами. Особенно очень порадовал и тот факт, что на территории колледжа у ребят есть свой бутик, оборудованный со вкусом.

    Полагаю, что Самарский колледж – единственное место в области, где можно получить качественное образование в области швейного дела. Благодаря ему не только наша фабрика, но и другие учреждения легкой промышленности смогут получать хорошо подготовленные кадры. И мы, как производственная компания, должны обеспечить для таких специалистов места не хуже, чем организованные сейчас на территории колледжа.

    А главным событием вчерашнего дня стал тот факт, что наша фабрика и директор колледжа подписали соглашение, которое позволит проходить студентам колледжа практику на нашей фабрике с учетом наших производственных задач.

    Я горжусь за наше общее дело и обязательно и постараюсь сделать все, чтобы самые лучшие выпускники хотели работать у нас. Чтобы они по-настоящему горели своим делом, и наша команда пополнялась настоящими мастерами различных специальностей.

    SdeK требуется для развития раннего плодового тела у Myxococcus xanthus

    Abstract

    Клетки Myxococcus xanthus , несущие вставку Ω4408 Tn 5lac в локусе sde , обнаруживают дефекты в развитии плодового тела и споруляции. Наш анализ паттернов экспрессии sde показал, что этот локус индуцируется на ранних этапах программы развития (от 0 до 2 часов) и что экспрессия увеличивается примерно в пять раз после 12 часов развития.Дальнейшие исследования показали, что экспрессия sde индуцируется, когда растущие клетки входят в стационарную фазу, предполагая, что активация локуса

    sde не ограничивается процессом развития. Поскольку пиковые уровни экспрессии sde как в sde + , так и в мутантном фоне sde были сходными, мы пришли к выводу, что локус sde не регулируется автоматически. Характеристика локуса sde с помощью анализа последовательности ДНК показала, что вставка Ω4408 произошла в гене sdeK .Анализ удлинения праймера локализовал 5'-конец транскрипта sde на гуаниновом нуклеотиде на 307 п.н. выше предполагаемого начала кодирующей последовательности SdeK. Последовательность ДНК в областях -12 и -24 перед сайтом начала транскрипции sde демонстрирует сходство с семейством промоторов ς 54 . Результаты исследований комплементации предполагают, что дефекты развития и споруляции, вызванные вставкой Ω4408, происходят из-за инактивации sdeK .Было обнаружено, что предсказанная аминокислотная последовательность SdeK имеет сходство с последовательностями гистидиновых протеинкиназ двухкомпонентных регуляторных систем. Основываясь на наших результатах, мы предполагаем, что SdeK может быть частью пути передачи сигнала, необходимого для активации и распространения программы раннего развития.

    В ответ на голодание клетки грамотрицательной почвенной бактерии Myxococcus xanthus запускают программу развития, которая завершается формированием куполообразной структуры, называемой «плодовое тело».«Строительство многоклеточного плодового тела требует депривации питательных веществ, скоординированных усилий примерно 10 5 клеток и твердой поверхности. В плодовом теле отдельные клетки дифференцируются в экологически устойчивые и метаболически неподвижные споры (обзоры см. В ссылках 17, 18 и 47).

    Развитие плодового тела проходит через серию этапов, которые требуют передачи сигналов между клетками. По крайней мере, пять внеклеточных сигналов (обозначенные как A-сигнал через E-сигнал) необходимы для построения плодового тела, заполненного спорами (6, 10, 28, 29, 40).В нескольких исследованиях изучалось влияние мутаций внеклеточной передачи сигналов на экспрессию онтогенетически регулируемых слияний репортерных генов Tn 5lac (22-24, 27). Результаты этих исследований показывают, что каждый внеклеточный сигнал координирует временную экспрессию уникального набора генов, регулируемых в процессе развития.

    Гены, помеченные слияниями Tn 5lac , были расположены на пути развития M. xanthus на основе их временной регуляции с помощью внеклеточных сигнальных событий (23).На ранней стадии пути развития (между 0 и 6 часами) существует два различных класса генов развития: те, которые требуют внеклеточного A-сигнала для полной экспрессии, и те, которые этого не делают. Т.о., по-видимому, происходит бифуркация пути раннего развития на зависимую от A-сигнала ветвь и независимую от A-сигнала ветвь.

    Характеристика инсерционных мутантов Tn 5lac показала, что независимое от A-сигнала слияние Ω4408 ингибирует построение нормальных на вид плодовых тел (24, 25).Этот результат предполагает, что вставка Ω4408 Tn 5lac определяет локус, который необходим для формирования плодовых тел, и что независимый от A-сигнала путь важен для распространения программы развития. С этим предположением согласуется открытие, что вставка Ω4408 снижает экспрессию второго локуса, регулируемого развитием, названного « devRS » (25). Недавние исследования показали, что копия локуса devRS дикого типа необходима для прохождения более поздних стадий процесса развития (24, 25, 53).

    Нас интересует регуляция экспрессии генов в независимом от A-сигнала пути и то, как продукты этих генов распространяют программу развития. В этой статье мы описываем наш анализ локуса, определяемого вставкой Ω4408 Tn 5lac , обозначенного sde (для индуцированного голоданием, существенного развития). Чтобы понять, как регулируются гены sde , мы исследовали паттерны экспрессии sde в развивающихся и вегетативно растущих клетках и локализовали сайт начала транскрипции для оперона sde .ДНК, фланкирующая Ω4408, была клонирована и охарактеризована с помощью анализа последовательности ДНК и инсерционного мутагенеза для определения того, какой ген в локусе sde требуется для развития плодового тела.

    МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

    Бактериальные штаммы и плазмиды.

    Полный список штаммов и плазмид, использованных в данном исследовании, представлен в таблице. Плазмиды размножали в Escherichia coli, DH5α (11) или JM101 (34). DK101 является диким типом для развития плодовых тел и споруляции, и он был выбран в качестве родительского для всех штаммов, использованных в этом исследовании, поскольку он несет мутацию sglA1 (14).Аллель sglA1 обеспечивает диспергированный рост в жидких культурах. Предыдущая работа Kroos et al. (24) продемонстрировали, что дефекты развития, вызванные вставкой Ω4408, идентичны как на фоне sglA1 , так и на фоне sglA + , что указывает на то, что эти дефекты вызваны самой вставкой Ω4408 и не зависят от sglA1. Аллель .

    ТАБЛИЦА 1

    Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные в этом исследовании

    9106 9 ′ traD36 proAB lacI q Δ lacZ M15 wild 9116 Кан r , pBGS18, содержащий внутренний sdeK 1. 2 kb Nco I- Pst I фрагмент r11422 Kan, 1. Фрагмент 9000 п.н. локуса sde (с внутренней делецией Apa I размером 700 п.н.)
    Штамм или плазмида Соответствующая характеристика Источник или эталон
    Штаммы
    E. coli
    DH5α supE44 ΔlacU169 φ80Δ lacZ M15 hsdR17 recA1 endA1 gyrA96 thi-1 relA1
    11
    11
    34
    M. xanthus
    DK101 sglA1
    sglA1 sdeK :: Tn 5lac Ω4408 24
    MS1503 sglA1 Δ sdeK

    MS1109

    sdeK

    sdeK s : pJEF4 Это исследование
    MS1510 sglA1 sde :: pELF1 Это исследование
    MS2010 sglA1 trcF :: pBAR101 Это исследование
    Плазмиды
    pBJ114 Кан R 6 9011 9011 9011 9011 9011 9011 9011 9011 9011 9011 9011 49
    pBluescript SKII Amp r Stratagene
    pPLh443 Kan r 19 r 19 RBB 9001 RBAR
    RBB trcF на фрагменте Stu I- Sal I Это исследование
    pIMK50 Amp r Kan r , pBluescript SKII, содержащий 9. 5 т.п.н. Ω4408 Tn 5lac и 12,5 т.п.н. восходящей ДНК на фрагменте Xho I Это исследование
    pIMK51 Amp r , pBluescript SKII, содержащий 50 п.н. ДНК в восходящем направлении на фрагменте Bam HI Это исследование
    pELF1 Kan r , pBGS18, содержащий 50 п.н. Ω4408 Tn 5lac и 6 т.п.н. Это исследование
    pJEF1 Kan r , pBGS18, содержащий sdeK и 6 т.п.н. восходящей ДНК на Bam HI- Pst I фрагменте Это исследование
    pJEF2.5 Kan r , pBGS18, содержащий 25 kb Nco I (в пределах sdeK 9000 Eco6) - sdeK 9000 Eco6 RI фрагмент Это исследование
    pJEF3 Kan r , pPLh443, содержащий sdeK и 1 т.п.н. восходящей ДНК на Stu I- Pst I фрагмент pJEF4 Kan r , pPLh443, содержащий sdeK и 1 т.п.н. восходящей ДНК на фрагменте Stu I- Hin dIII Это исследование
    pJEF9 Это исследование

    Штамм MS1503 является производным DK101, несущим делецию 700 п.н. в sde локус. Делеция удаляет 550 п.н. с 5'-конца предсказанной кодирующей последовательности SdeK и дополнительные 150 п.н. восходящей ДНК. Делеция 700 п.н. в MS1503 была сконструирована с помощью двухэтапной процедуры замены гена с производным плазмиды pBJ114 (16), названным pJEF9.Плазмида pJEF9 несет ген galK , который может использоваться в качестве контрселекции для потери интегрированной плазмиды, и внутренний фрагмент Eco RI- Hin Hin dIII размером 1,9 т.п.н. из локуса sde . Эта вставка размером 1,9 т.п.н. была получена путем удаления 700 п.н. ДНК из внутренней части фрагмента 2,6 т.п.н. локуса sde . Плазмиду pJEF9 вводили в клетки DK101, как описано ниже, и трансформанты Kan r , которые содержат единственную копию pJEF9, интегрированную путем гомологичной рекомбинации в локусе sde , были идентифицированы с помощью саузерн-блот-анализа (43).Единственное событие интеграции привело к тандемному дублированию с одной неповрежденной копией sdeK и одной копией sdeK с удаленным 5 'концом. После идентификации трансформантов Kan r с одной вставкой плазмиды клетки инокулировали во флаконы, содержащие 5 мл бульона CTT (компоненты указаны ниже), и инкубировали при 32 ° C в течение ночи при энергичном перемешивании. Клетки собирали из ночных культур центрифугированием, ресуспендировали в 500 мкл буфера TPM (компоненты указаны ниже) и аликвотировали на планшеты CTT с добавлением 2% галактозы.В присутствии галактозы экспрессия гена galK из плазмиды pJEF9 является летальной для M. xanthus , и колонии Gal r могут возникать из клеток, которые подверглись операции вырезания плазмиды. Для идентификации изолятов, которые вырезали хромосомную копию плазмиды pJEF9, реплики колоний Gal r высевали на СТТ в присутствии и в отсутствие канамицина. Колонии, которые могли расти только в отсутствие канамицина (Kan s ), были проанализированы дополнительно.Вырезание плазмиды pJEF9 может дать штамм с копией sdeK дикого типа или штамм с делецией на 5'-конце sdeK . Хромосомную ДНК выделяли из колоний Kan s (43) и использовали для саузерн-блот-анализа (43) для идентификации штаммов, несущих делецию.

    Средства массовой информации для роста и развития.

    штаммов M. xanthus выращивали при 32 ° C в бульоне CTT, содержащем 1% Casitone (Difco Laboratories), 10,0 мМ Трис-гидрохлорид (pH 8.0), 1 мМ KH 2 PO 4 и 8 мМ MgSO 4 или на чашках, содержащих бульон CTT и 1,5% бакто-агар Difco. К бульону СТТ и планшетам СТТ добавляли 40 мкг сульфата канамицина на мл (Sigma) или 2% галактозы (Sigma) по мере необходимости. Мягкий агар CTT - это бульон CTT, содержащий 0,7% бакто-агара Difco. E. coli DH5α и JM101 выращивали при 37 ° C в бульоне Лурия-Бертани (LB), содержащем 1% триптона (Difco), 0,5% дрожжевого экстракта (Difco) и 0,5% NaCl, или на чашках, содержащих LB и 1.5% бакто-агар Difco. В чашки LB и LB добавляли 50 мкг ампициллина на мл (Sigma) или 40 мкг сульфата канамицина на мл (Sigma) по мере необходимости. Развитие плодовых тел проводили при 32 ° C на чашках TPM, содержащих буфер TPM (10,0 мМ Трис-гидрохлорид [pH 8,0], 1 мМ KH 2 PO 4 и 8 мМ MgSO 4 ) и 1,5% Difco Bacto. -Агар.

    Тесты на β-галактозидазу, развитие и споруляцию.

    Для сбора вегетативно растущих клеток, M.Штаммы xanthus инокулировали в колбу, содержащую 10 мл бульона СТТ, и культуру помещали при 32 ° C с интенсивным перемешиванием. В разное время после того, как культура достигла плотности 2 × 10 8 клеток на мл, аликвоты по 500 мкл были удалены и быстро заморожены в жидком азоте. Клетки развития собирали из чашек с агаром TPM, как описано ранее (24), и анализы β-галактозидазы проводили с быстрозамороженными клеточными экстрактами (20). Удельная активность β-галактозидазы определяется как наномоль o -нитрофенола (ONP), продуцируемого за минуту -1 миллиграмма белка -1 .

    Развитие плодовых тел на чашках с агаром TPM контролировали визуально с помощью препаровального микроскопа (Wild-Heerbrug). Для проверки эффективности споруляции использовали два метода. Сначала с помощью счетной камеры Петрова-Хауссера и фазово-контрастной микроскопии определяли количество яйцевидных спор с яркой фазой, продуцируемых развивающимися клетками. Во-вторых, жизнеспособность этих спор определяли, как описано ранее (53). Из-за ежедневных колебаний абсолютного количества спор анализы спор представлены как процентные доли от количества спор дикого типа для каждого эксперимента.Стопроцентная споруляция дикого типа составляла от 2 × 10 6 до 2 × 10 7 спор / мл, что соответствует эффективности споруляции от 1 до 10% в зависимости от количества введенных клеток.

    Анализ РНК.

    Для выделения РНК во время роста клеток M. xanthus инокулировали в бульон CTT, и культуру помещали при 32 ° C при энергичном встряхивании. Клетки собирали в разное время после того, как культура достигла плотности 2 × 10 8 клеток на мл.Для выделения онтогенетической РНК примерно 5 × 10 10 клеток собирали с чашек с агаром TPM, как описано ранее (20). После сбора вегетативно растущие клетки и развивающиеся клетки быстро замораживали в жидком азоте, как описано выше для анализов β-галактозидазы. РНК выделяли из быстрозамороженных клеток методом горячего фенола (43). Общую клеточную РНК использовали в гибридизации слот-блоттинга, как описано Kaplan et al. (20). Для экспериментов по гибридизации слот-блоттинга использовали два зонда: фрагмент Apa I, содержащий 300 п.н. ДНК, непосредственно перед сайтом вставки Ω4408, и фрагмент Nco I- Pst I, содержащий 1.2 т.п.н. ДНК ниже сайта вставки Ω4408. Аналогичные результаты были получены с обоими зондами. Специфичность этих зондов была подтверждена с использованием мРНК дрожжей, которая не давала детектируемого сигнала. Анализ удлинения праймера проводили, как описано ранее (15), с модификациями Mirel и Chamberlin (36). В качестве праймеров для этих анализов использовали 5'-GCCACCCTAACCCCGCAGCA-3 'и 5'-ACACTCCCTTCATACAGACGCAG-3'. Оба праймера были синтезированы Operon Technologies, Inc. (Аламеда, Калифорния.).

    Перенос плазмиды в
    M. xanthus.

    Плазмиды, содержащие фрагменты ДНК из локуса sde , электропорировали в клетки DK101 или MS1503 по методике Plamann et al. (41). Саузерн-блот-анализ (43) был использован для идентификации электропорантов, которые содержат единственную копию соответствующей плазмиды, интегрированную посредством гомологичной рекомбинации в локус sde , или единственную копию соответствующей плазмиды, интегрированную посредством сайт-специфической рекомбинации в прикрепление хромосомного фага Mx8. сайт ( attB ).Электропоранты Kan r , несущие вставку одной плазмиды, оценивали на развитие и эффективность спорообразования по мере необходимости.

    Клонирование локуса
    sde .

    Для выделения хромосомной ДНК выше (относительно транскрипции lacZ ) слияния и вставки Ω4408 Tn 5lac , геномную ДНК получали из штамма DK4408 (43), расщепляли Xho I и лигировали в Xho. I-расщепленная плазмида pBluescript SKII. Смесь для лигирования ДНК подвергали электропорации в E.coli , как описано ранее (43), и колонии Kan r были идентифицированы на чашках LB, содержащих канамицин. Плазмидную ДНК выделяли из ночных культур, выращенных в чашках LB с добавлением канамицина, как описано Sambrook et al. (43). Один клон, плазмида pIMK50, который содержит вставку размером 22 т.п.н., был идентифицирован путем расщепления плазмидной ДНК соответствующими рестрикционными ферментами. Впоследствии фрагмент Bam HI из pIMK50 с 50 п.н. на 5'-конце Ω4408 Tn 5lac и 6 т.п.н. хромосомной ДНК перед вставкой был идентифицирован рестрикционным анализом, очищен и лигирован в Bam HI- расщепленный pBluescript SKII с получением плазмиды pIMK51.Чтобы подтвердить, что приблизительно 6 т.п.н. ДНК, клонированная в pIMK51, идентична ДНК, расположенной выше хромосомной вставки Ω4408, этот фрагмент Bam HI размером 6 т.п.н. использовали в качестве зонда для саузерн-блот-анализа (43). Хромосомную ДНК, полученную из штамма DK4408, расщепляли Sma I, Sal I, Xho I, Eco RI или Pst I, разделяли на 0,8% агарозном геле и наносили на нейлоновую мембрану. Зонд Bam HI размером 6 т.п.н., полученный из pIMK51, показал картину гибридизации, идентичную той, которая была получена, когда тот же блот зондировали 5'-концом Tn 5lac .Рестрикционная карта, полученная в результате этого саузерн-блоттинга, была аналогична карте, построенной ранее Kroos et al. (24) для ДНК перед вставкой Ω4408.

    Метод клонирования in situ был использован для выделения хромосомной ДНК ниже по течению (относительно транскрипции lacZ ) слияния и вставки Ω4408 Tn 5lac , как описано Gill et al. (9) и Стивенс и Кайзер (50). Трансформанты Kan r штамма DK101, содержащие единственную вставку плазмиды pELF1 или pJEF2 в локус sde , выделяли, как описано выше.После идентификации трансформантов Kan r с единичным событием вставки хромосомную ДНК выделяли и расщепляли Pst I или Eco RI для pELF1 и pJEF2, соответственно. Затем каждый хромосомный гидролизат самолигировали и электропорировали в E. coli DH5α (43). Электропорированные клетки высевали на планшеты LB, содержащие канамицин, и инкубировали при 37 ° C в течение ночи. Плазмидную ДНК выделяли и расщепляли соответствующими рестрикционными ферментами для подтверждения состава клонов.Один клон (плазмида pJEF1) несет вставку размером 7,7 т.п.н. с 6 т.п.н. хромосомной ДНК перед сайтом вставки Ω4408 и 1,7 т.п.н. хромосомной ДНК ниже сайта вставки Ω4408. Второй клон (плазмида pJEF2.5) несет вставку размером 25 т.п.н. с 1,2 т.п.н. ДНК sdeK и приблизительно 24 т.п.н. Ни одна из плазмид не содержит ДНК Tn 5lac .

    Анализ последовательности ДНК. ДНК

    секвенировали методом терминации дидезоксинуклеотидной цепи (44) с помощью набора для циклического секвенирования Sequi-Therm (Epicenter Technologies, Madison, Wis.) и специально разработанные олигонуклеотидные праймеры, синтезированные Operon Technologies, Inc. Таким образом определяли нуклеотидную последовательность обеих цепей области 6,3 т.п.н. в локусе sde . Последовательность ДНК анализировали с помощью программного обеспечения ABI prism и собирали с помощью программного обеспечения Deneba Sequencher. Последовательности белков анализировали с помощью программы TMpred для поиска гидрофобных и потенциальных доменов, проникающих через мембрану.

    РЕЗУЛЬТАТЫ

    Фенотипы мутанта Ω4408.

    Развитие плодового тела в М.xanthus сопровождается серией легко наблюдаемых морфологических и поведенческих изменений (рис.). Эти изменения включают агрегацию клеток, образование холмика и созревание спор. Kroos et al. (24, 25) сообщили, что вставка Ω4408 Tn 5lac в локус sde блокирует развитие плодового тела и спороношение. Для дальнейшего изучения этих поведенческих и морфологических дефектов, вызванных Ω4408, клетки изогенных штаммов DK101 и DK4408 (DK101 :: Tn 5lac Ω4408) были нанесены на агаре TPM для анализа развития.Сравнение фенотипов развития для каждого штамма показано на рис. Агрегация клеток DK4408 началась примерно в то же время (8 ч), что и агрегация клеток DK101 дикого типа. Однако агрегаты клеток DK101 образовывали бугорчатые структуры после 24 часов развития, в то время как агрегаты клеток DK4408 не могли уплотняться в холмики в течение 48 часов этого развития. Между 12 и 24 часами развития агрегаты DK4408 диссоциировали на невыразительные, полупрозрачные маты клеток, тогда как скопления клеток DK101 развивались в затемненные плодовые тела, заполненные спорами.

    Поведение клеток M. xanthus во время развития на чашках с агаром TPM. Показан прогресс развития клеток DK101 дикого типа, клеток DK4408, клеток MS1503 и клеток MS1506. Клетки наносили на голодный агар TPM и контролировали визуально, как описано в разделе «Материалы и методы». Фотографии были сделаны в указанное время.

    Два метода использовали для анализа эффективности споруляции клеток DK4408 и DK101, развивающихся на чашках с агаром TPM в течение 5 дней. Чтобы определить количество термостойких и устойчивых к ультразвуку яйцевидных спор, продуцируемых развивающимися клетками, мы использовали счетную камеру Петрова-Хауссера и фазово-контрастную микроскопию.Чтобы проверить жизнеспособность этих спор, мы поместили их на СТТ-агар и подсчитали количество возникших колоний. Результаты анализов споруляции суммированы в таблице. Эти два метода дали похожие результаты; количество спор, продуцируемых клетками DK4408, составляло примерно 0,8% от количества спор, продуцируемых клетками DK101, а количество жизнеспособных спор из клеток DK4408 составляло примерно 0,1% от количества спор, продуцируемых клетками DK101.

    ТАБЛИЦА 2

    Фенотипы развития штаммов дикого типа и мутантных штаммов a

    Штамм Наличие развития плодовых тел b % спор дикого типа c % диких жизнеспособные споры d
    DK101 + 100.0 ± 7,7 100,0 ± 19,5
    DK4408 - 0,8 ± 0,3 0,1 ± 0,1
    MS1503 - 0,1 ± 0,1 0,2 + 117,1 ± 9,7 90,0 ± 39,2
    MS2010 + ND e 100 f
    Выражение
    в процессе роста и развития.

    Вставка Ω4408 Tn 5lac в DK4408 ставит lacZ под транскрипционный контроль промотора в локусе sde . Используя это слияние репортер-ген lacZ , мы исследовали экспрессию sde в клетках DK4408, развивающихся на агаре TPM (фиг. A). Удельная активность β-галактозидазы начала возрастать в течение 2 ч после инициированного голоданием развития плодовых тел. Пиковая удельная активность β-галактозидазы наблюдалась примерно через 12 часов развития, и эти уровни оставались относительно неизменными в течение следующих 36 часов.Уровень специфической активности β-галактозидазы через 12 часов развития примерно в пять раз выше, чем в начале программы развития. Чтобы изучить экспрессию sde во время вегетативного роста, мы проанализировали специфическую активность β-галактозидазы в клетках DK4408, помещенных в жидкую среду CTT. На рисунке B показано, что удельная активность β-галактозидазы начала увеличиваться во время перехода от экспоненциального роста к стационарной фазе и что удельная активность β-галактозидазы продолжала увеличиваться и в стационарную фазу.Пик удельной активности β-галактозидазы, наблюдаемый в стационарной фазе, примерно в три раза выше, чем пик, наблюдаемый в экспоненциальной фазе. Эти данные показывают, что экспрессия sde индуцируется как в развивающихся клетках, так и в вегетативных клетках, вступающих в стационарную фазу.

    Паттерны выражения sde . Средние значения удельной активности β-галактозидазы, обнаруженные в клетках DK4408, и средние уровни мРНК sde , обнаруженные в клетках DK101, были определены в трех независимых экспериментах.Планки погрешностей - это стандартные отклонения от среднего. Белые квадраты представляют собой удельную активность β-галактозидазы, а закрашенные ромбы представляют плотность клеток. Показаны средние значения удельной активности β-галактозидазы, обнаруженные в указанные моменты времени во время развития на агаре TPM (A) и во время вегетативного роста в бульоне CTT (B). Среднее кратное увеличение удельной активности β-галактозидазы (■) и среднее кратное увеличение мРНК sde () сравниваются для периода развития от 0 до 12 часов на чашках с агаром TPM и от 0 до 53 часов роста в жидкости CTT ( C).

    Чтобы определить, происходит ли увеличение специфической активности β-галактозидазы, наблюдаемое во время роста и развития клеток DK4408, на уровне накопления мРНК sde , использовали анализ гибридизации слот-блоттинга РНК. Общую РНК очищали из клеток DK101 во время развития на агаре TPM и роста в среде CTT. РНК переносили на нейлоновые мембраны и зондировали фрагментом Apa I длиной 300 п.н., содержащим ДНК, непосредственно перед сайтом вставки Ω4408 (рис.), и были количественно определены относительные уровни мРНК sde . Результаты, показанные на фиг. C, показывают, что относительное увеличение мРНК sde во время роста и развития аналогично относительному увеличению специфической активности β-галактозидазы. Более того, эти находки показывают, что экспрессия sde не изменяется на фоне мутанта sde + или sde , что позволяет предположить, что этот локус не саморегулируется.

    Физическая карта области вставки Ω4408.Расширенная черная линия указывает на область, которая была охарактеризована анализом последовательности ДНК. Прямоугольники показывают расположение указанной ORF. Стрелка внутри каждого поля показывает предполагаемую ориентацию транскрипции ORF. Местоположение вставки Ω4408 (треугольник) определяли секвенированием ДНК и саузерн-блоттингом, как описано в разделе «Материалы и методы». Увеличенное изображение Tn 5lac показано над треугольником. Плазмиды, содержащие указанные фрагменты ДНК локуса sde , показаны под картой области вставки Ω4408.Скобки указывают степень удаленной области в плазмиде pJEF9, а параллельные косые черты указывают непрерывную последовательность ДНК, которая простирается до сайта Eco RI, примерно на 24 т.п.н. ниже конца ORF sdeK . Фрагмент Apa I длиной 300 п.н. и фрагмент Nco I- Pst I размером 1,1 т.п.н., использованные для анализа гибридизации слот-блоттинга мРНК sde , представлены пунктирными прямоугольниками.

    Клонирование локуса
    sde .

    В предыдущем исследовании Kroos et al.(24) картировали несколько сайтов рестрикции в ДНК выше (относительно транскрипции lacZ ) от вставки Ω4408. Рестрикционный фермент Xho I разрезает один раз в пределах Ω4408 Tn 5lac и один раз на небольшом расстоянии перед вставкой, генерируя хромосомный фрагмент размером 22 т.п.н. с 9,5 т.п.н. из Ω4408 Tn 5lac и приблизительно 12,5 т.п.н. восходящей ДНК (рис. .). Тот факт, что 9,5 т.п.н. Ω4408 Tn 5lac на этом фрагменте Xho I содержит ген, придающий устойчивость к канамицину ( nptII ), позволил нам идентифицировать плазмиду (pIMK50), несущую вставку Xho I размером 22 т.п.н. .Фрагмент Bam HI размером 6 т.п.н. из плазмиды pIMK50 субклонировали в pBluescript SKII и в pBGS18 с получением плазмид pIMK51 и pELF1 соответственно. Этот фрагмент Bam HI размером 6 т.п.н. впоследствии использовали в качестве зонда для саузерн-блот-анализа (данные не показаны), и анализ последовательности ДНК использовали для подтверждения того, что он содержит 50 п.н. от 5'-конца Ω4408 Tn 5lac и 6 т.п.н. хромосомной ДНК перед этой вставкой.

    Метод клонирования in situ был использован для выделения хромосомной ДНК ниже Ω4408 Tn 5lac .Плазмиду pELF1 вводили в штамм DK101 электропорацией и выделяли колонии Kan r для дальнейшего анализа. Один изолят Kan r (MS1510), как показал Саузерн-блот-анализ, несет единственную копию плазмиды pELF1, интегрированную в хромосому путем гомологичной рекомбинации (данные не показаны). Результаты анализа саузерн-блоттинга показали, что рестрикционный фермент Pst I разрезает один раз в пределах сайта мультиклонирования pELF1 и один раз на 1,7 т.п.н. ниже сайта встраивания плазмиды.Таким образом, путем переваривания хромосомной ДНК, полученной из MS1510 с Pst I, и лигирования пула из фрагментов Pst I, мы создали плазмиду (pJEF1), которая несет хромосомную ДНК размером 6 т.п.н. перед сайтом вставки Ω4408, 1,7 т.п.н. ДНК ниже сайта вставки Ω4408, а ДНК Ω4408 Tn 5lac отсутствует (рис.). Состав pJEF1 подтвержден рестрикционным анализом и секвенированием ДНК. Для получения дополнительных 24 т.п.н. ДНК ниже сайта Pst I использовали аналогичную процедуру (см. Материалы и методы).Полученный клон, содержащий эту дополнительную ДНК, был обозначен как pJEF2.5.

    Анализ последовательности ДНК локуса
    sde .

    Область 6,3 т.п.н. нативного локуса sde от восходящего сайта Eag I до нижележащего сайта Hin dIII была охарактеризована с помощью анализа последовательности ДНК (рис. [Номер доступа GenBank {"тип": " entrez-nucleotide "," attrs ": {" text ":" AF031084 "," term_id ":" 2736295 "," term_text ":" AF031084 "}} AF031084]). Эта область ДНК охватывает 4.На 1 т.п.н. выше и на 2,2 т.п.н. ниже сайта вставки Ω4408. Были идентифицированы две открытые рамки считывания (ORF), первоначально обозначенные ORF1 и ORF2. Обе ORF имеют сильное смещение в сторону нуклеотидов G + C в третьем положении кодонов (92,7% для ORF1 и 89,2% для ORF2), что типично для генов в M. xanthus и других организмах с высоким G + C ( 3, 47).

    ORF1 размером 3,6 т.п.н. расположен выше сайта вставки Ω4408, и предполагается, что он транскрибируется в противоположной ориентации относительно lacZ из слияния Ω4408 Tn 5lac .Это говорит о том, что ORF1 не является частью оперона, определенного Ω4408. Выведенная аминокислотная последовательность продукта ORF1 показывает 44% идентичности и 64% сходства с фактором связывания репарации транскрипции E. coli , TrcF (45, 46). В E. coli TrcF участвует в специфической для цепи репарации повреждений ДНК, которые блокируют транскрипцию с помощью РНК-полимеразы. Мы переименовали ORF1 в « trcF » на основании этого сильного сходства последовательностей.

    ORF2 размером 1,6 т.п.н., по прогнозам, будет транскрибироваться в той же ориентации относительно lacZ из слияния Ω4408 Tn 5lac .Кроме того, анализ последовательности ДНК показал, что сайт вставки Ω4408 находится на 5'-конце ORF2, что указывает на то, что ORF2 является частью оперона, определяемого Ω4408. С-концевые 228 остатков предполагаемого продукта ORF2 демонстрируют сильное сходство и идентичность с доменом-трансмиттером в белках гистидинкиназы. Белки гистидинкиназы действуют как сенсоры в двухкомпонентных системах передачи сигналов, а консервативный остаток гистидина, который часто обнаруживается в передающем домене этих белков, фосфорилируется в ответ на конкретный внутриклеточный или внеклеточный сигнал.В передающем домене этих сенсорных белков идентифицированы четыре высококонсервативных участка (38, 51). Область H содержит остаток гистидина, который служит сайтом аутофосфорилирования, а область G, как полагают, функционирует как сайт связывания нуклеотидов (38, 51). Конкретная функция еще не назначена региону N или региону D / F. Выравнивания последовательностей, показанные на фиг. 2, показывают, что ORF 2 (обозначенная как SdeK для индуцируемой голоданием, необходимой для развития киназы) содержит все четыре из этих консервативных областей.

    Выравнивание С-конца SdeK с консервативными областями в домене трансмиттера известных белков гистидинкиназы. Консервативные последовательности FixL из Rhizobium meliloti (1, 5), KinA из Bacillus subtilis (2, 39), KinB из B. subtilis (54), NtrB из E. coli (35), PhoR из E. coli (30) и SdeK из M. xanthus . Показаны четыре высококонсервативные области (H-Box, N-Box, D / F-Box и G-Box) в белках гистидинкиназы (38, 51).Аминокислотные остатки, обнаруженные в 10-100% белков гистидинкиназы, представлены над выравниванием последовательностей, как представлено Stock et al. (51). Черные прямоугольники показывают, что остаток абсолютно консервативен среди всех гистидинкиназ. Темно-серые прямоугольники показывают, что остаток обнаружен в 75-98% гистидинкиназ. Светло-серые прямоугольники указывают на то, что остаток обнаружен в 10-74% гистидинкиназ.

    Выведенная аминокислотная последовательность в N-концевой части SdeK не показала значительного сходства с белковыми последовательностями в базе данных GenBank.Однако предыдущие анализы показали, что аминокислотные последовательности N-концевой области гистидинкиназ недостаточно консервативны (38). Это отсутствие консервативности согласуется с предполагаемой функцией N-концевой области как входных доменов, которые изменяют активность каждого белка в ответ на конкретный сигнал. Дальнейший анализ N-концевой области SdeK не выявил гидрофобных трансмембранных областей, что позволяет предположить, что SdeK может локализоваться в цитоплазматическом компартменте M.xanthus клеток. Таким образом, SdeK может принадлежать к семейству белков цитоплазматической гистидинкиназы с N-концевым входным доменом, за которым следует C-концевой передающий домен. Некоторыми из членов этого семейства белков являются DegS из Bacillus subtilis (13, 26), KinA из Bacillus subtilis (2, 39), NifL из Azotobacter vinelandii (4, 42) и NtrB из . E. coli (35).

    5'-конец ORF sdeK определяется стоп-кодоном TAG (+169, рис.А). Поскольку N-концевой домен не консервативен в гистидинкиназах, анализ последовательности не помогает определить начало трансляции SdeK. 5'-конец ORF sdeK содержит два потенциальных сайта связывания рибосом для инициации трансляции белка SdeK. Первый предполагаемый сайт связывания рибосомы отделен от нижележащего кодона GTG (+307, рис. A) 3 нуклеотидами, тогда как второй предполагаемый сайт отделен 8 нуклеотидами от кодона CTG (+238, рис. A). Поскольку GTG чаще используется в качестве кодона инициации трансляции, чем CTG (7), мы предполагаем, что нижележащий сайт на +307 является вероятным началом кодирующей последовательности белка SdeK.

    (A) Последовательность ДНК области перед вставкой Ω4408 Tn 5lac . Черный треугольник показывает расположение вставки Ω4408. Изогнутая стрелка над +1 показывает 5'-конец предсказанного транскрипта sde , и обозначены области -12 и -24. Стоп-кодон (TAG), который определяет 5'-конец ORF sdeK (+169), показан в нижнем регистре. Потенциальные сайты связывания рибосом и стартовые кодоны трансляции для белка SdeK выделены жирным шрифтом.Нуклеотиды, отмеченные звездочкой, комплементарны 3'-концу 16S рРНК M. xanthus (37). Пунктирная стрелка над GTG в позиции +307 - это предполагаемое начало кодирующей последовательности SdeK. Подчеркнутые области показывают последовательности, которые комплементарны двум праймерам (ORF12 и ORF12-2), используемым для идентификации 5'-конца транскрипта sde . (B) Картирование 5'-конца онтогенетического транскрипта sde с помощью анализа удлинения праймера. A, C, G и T показывают лестницы секвенирования ДНК.PE, удлинение праймера с помощью общей РНК, полученной из клеток DK101, развивающихся на агаре TPM в течение 12 часов, и праймера ORF12 (материалы и методы). (C) Сравнение промоторной области sde с консенсусной последовательностью ς 54 и тремя промоторами M. xanthus ς 54 : mbhA (21), 4521 (21) и pilA . (55). Предлагаемое начало транскрипции обозначено знаком +1.

    Локализация 5'-конца транскрипта развития
    sde .

    Последовательность ДНК локуса sde убедительно свидетельствует о том, что ген sdeK является первым геном в транскрипционной единице sde . Для идентификации 5'-конца онтогенетического транскрипта sde был проведен анализ удлинения праймера с 12-часовым (время, когда были обнаружены пиковые уровни мРНК sde ) онтогенетической РНК и праймером (ORF12), который комплементарен область вокруг предполагаемого стартового кодона для SdeK (рис. A). На рисунке B показано, что 5'-конец мРНК sde картирован с гуаниновым нуклеотидом на 307 п.н. выше предполагаемого начала кодирующей области SdeK.В аналогичном эксперименте по удлинению праймера со вторым праймером (ORF12-2) тот же 5'-конец был обнаружен для мРНК sde (данные не показаны). Анализ этой области длиной 307 п.н. перед sdeK не выявил очевидной ORF, что позволяет предположить, что sdeK является первым геном в транскрипте sde .

    Исследование 5'-области, предшествующей предполагаемому сайту старта транскрипции для оперона sde , выявило последовательность, сходную с семейством промоторов ς 54 (52) (рис.C). Сходство наиболее сильно в области -24, где 5 из 7 нуклеотидов идентичны консенсусной последовательности ς 54 . Сходство менее сохраняется в районе -12, только 2 из 5 совпадают с консенсусом. Однако обнаружены высококонсервативные динуклеотиды GG в области -24 и GC в области -12. Сходства с другими семействами бактериальных промоторов не наблюдалось.

    Идентификация гена в локусе
    sde , который необходим для развития и споруляции.

    Анализ последовательности ДНК показал, что вставка Ω4408 Tn 5lac расположена внутри кодирующей последовательности sdeK . Поскольку sdeK и trcF , по-видимому, находятся в расходящихся оперонах, это открытие подразумевает, что блокировка развития, вызванная Ω4408, не является результатом инактивации гена trcF . Наиболее правдоподобным объяснением фенотипа Ω4408 является инактивация функции sdeK или полярный эффект на ген или гены, расположенные ниже sdeK .

    Чтобы подтвердить, что инактивация trcF не отвечает за фенотип Ω4408, мы сконструировали штамм MS2010 и исследовали его способность образовывать плодовые тела и спорулировать (таблица). MS2010 является производным штамма DK101, содержащего вставку плазмиды pBAR101 в хромосому. Вставка в MS2010 дает две неполные копии гена trcF . При помещении на чашки с агаром TPM клетки MS2010 образовывали нормальные на вид плодовые тела через 24 часа развития, и количество жизнеспособных спор, продуцируемых этими плодовыми телами, было сходным с количеством жизнеспособных спор, продуцируемых плодовыми телами дикого типа DK101.Эти данные показывают, что инактивация гена trcF не отвечает за задержку развития, наблюдаемую для мутанта с инсерцией Ω4408.

    Чтобы определить, вызваны ли дефекты развития, вызванные вставкой Ω4408, инактивацией гена sdeK , мы сконструировали штамм, обозначенный MS1503, который несет делецию в sdeK sdeK ). Эта делеция удаляет 550 п.н. с 5'-конца предполагаемой кодирующей области SdeK, включая предполагаемые сайты инициации трансляции, а также дополнительные 150 п.н. восходящей ДНК.Когда в качестве зонда для анализа гибридизации слот-блоттинга использовали фрагмент ДНК, расположенный ниже делеции 700 п.н., мРНК sde не была обнаружена в мутанте MS1503 (данные не показаны), что указывает на то, что делеция имеет полярный эффект на нижестоящая транскрипция. Чтобы исследовать дефекты развития, вызванные Δ sdeK , клетки MS1503 анализировали на предмет развития и сравнивали с клетками DK101 и DK4408 (рис.). Клетки всех трех штаммов начали агрегироваться примерно в одно и то же время, но клетки DK4408 и клетки MS1503 не смогли сплотиться в холмики после 48 часов развития.Кроме того, количество спор и количество жизнеспособных спор, продуцируемых штаммом MS1503, было примерно в 1000 раз ниже, чем у штамма дикого типа DK101, и аналогично таковым в штамме DK4408 (таблица). Таким образом, дефекты развития и споруляции, наблюдаемые штаммом Δ sdeK , подобны дефектам, вызванным вставкой Ω4408.

    Чтобы продемонстрировать, что потеря функции sdeK является ответственной за фенотипы развития, наблюдаемые для штамма MS1503, мы попытались дополнить мутацию плазмидой pJEF4, которая содержит копию sdeK дикого типа, а также вышестоящие последовательности ДНК, необходимые для управления экспрессией этого гена.Кроме того, плазмида pJEF4 несет сайт Mx8 attP для интеграции в сайт прикрепления хромосомного фага Mx8, attB . Эту плазмиду вводили в штамм MS1503, давая штамм MS1506. Клетки MS1506 были проанализированы на предмет развития и сравнены с клетками DK101 и MS1503, чтобы определить, может ли копия гена sdeK дикого типа устранить дефекты, вызванные мутацией Δ sdeK (рис.). Клетки MS1506 агрегировались примерно в то же время, что и клетки DK101 дикого типа.Однако для полного уплотнения этих агрегатов в затемненные плодовые тела потребовалось 48 часов, тогда как клеткам DK101 потребовалось всего 24 часа. Когда мы исследовали эффективность споруляции штамма MS1506 через 5 дней, мы обнаружили, что она аналогична таковой у штамма DK101 (таблица). Эти данные показывают, что дефекты развития и споруляции, вызванные мутацией Δ sdeK , могут быть дополнены путем предоставления копии гена sdeK дикого типа на эктопическом участке, хотя развитие, по-видимому, немного задерживается.Наши результаты предполагают, что онтогенетический блок, продуцируемый вставкой Ω4408, обусловлен инактивацией гена sdeK , а не полярным эффектом на ген, расположенный ниже sdeK .

    ОБСУЖДЕНИЕ

    Tn 5lac транскрипционные слияния были использованы Кроосом и Кайзером (22) для идентификации примерно 30 онтогенетически регулируемых локусов в хромосоме M. xanthus . Экспрессия восьми слияний Tn 5lac индуцируется в течение нескольких часов после того, как голодание инициирует программу развития (24).Среди этих восьми ранних слияний Ω4408 Tn 5lac является уникальным, потому что сама вставка производит блок развития (24, 25). Таким образом, вставка Ω4408 определяет генетический локус, который абсолютно необходим для прохождения через цикл развития. Мы обозначили этот локус sde , и в этом отчете мы изучили его регуляцию и его потенциальную функцию в развитии.

    Экспрессия
    sde индуцируется, когда клетки начинают развитие и когда клетки входят в стационарную фазу.

    Экспрессия из слияния Ω4408 Tn 5lac индуцируется на ранних этапах программы развития M. xanthus (от 0 до 2 часов), задолго до появления первых видимых признаков клеточной агрегации. Пик экспрессии sdeK не наблюдался до примерно 12 часов развития, когда агрегаты клеток уплотняются в холмики. После 12 ч развития уровень экспрессии sde оказался примерно в пять раз выше, чем в начале развития.Дальнейший анализ экспрессии Ω4408 показал, что индукция sde происходит, когда растущие клетки начинают входить в стационарную фазу. Экспрессия sde продолжала увеличиваться в стационарной фазе, давая пиковую индукцию примерно в три раза. Эти результаты показывают, что индукция sde не ограничивается программой развития M. xanthus . Наше открытие, что уровни экспрессии sdeK схожи как у sdeK + , так и у мутантного фона sdeK , предполагает, что sdeK не регулируется ауторегулируется.

    Какое событие приводит к активации локуса sde ? Результаты наших исследований экспрессии показывают, что sde может индуцироваться, когда уровни питательных веществ недостаточны для поддержания устойчивого роста. Предыдущие результаты согласуются с этой гипотезой. Например, Сингер и Кайзер (48) и Харрис и др. (12) показали, что экспрессия Ω4408 Tn 5lac зависит от высоких уровней сигнала внутриклеточного голодания (p) ppGpp. Более того, условия, которые активировали экспрессию sde в наших исследованиях, коррелируют с условиями, ранее показанными для генерации относительно высоких уровней (p) ppGpp (31–33).Таким образом, локус sde может экспрессироваться прямо или косвенно в ответ на сигнал голодания (p) ppGpp.

    5'-конец транскрипта
    sde расположен на 307 п.н. выше предполагаемого стартового кодона для SdeK.

    Результаты анализа удлинения праймера с онтогенетической РНК показали, что 5'-конец транскрипта sde расположен на 307 п.н. выше предполагаемой кодирующей области SdeK. Поскольку эта область длиной 307 пар оснований, по-видимому, не содержит истинной ORF, мы полагаем, что sdeK является первым геном в опероне sde .Это открытие предполагает, что мРНК sde имеет относительно длинную лидерную последовательность. Аналогичный результат наблюдали Fisseha et al. (8), которые предположили, что мРНК Ω4403, зависящая от С-сигнала, имеет лидерную последовательность из 142 п.н. Лидер sde потенциально может участвовать в регуляции экспрессии sde либо на уровне транскрипции, либо на уровне трансляции. Альтернативно, он может участвовать в регуляции стабильности мРНК sde .

    Последовательность ДНК перед началом транскрипции для sde имеет сходство с семейством промоторов ς 54 .Этот класс промоторов имеет идентичность последовательностей в областях -12 и -24, при этом динуклеотид GC в области -12 и динуклеотид GG в области -24 являются высококонсервативными (52). Предполагаемый промотор для sde содержит эти два консервативных динуклеотида и имеет сильную идентичность с консенсусной последовательностью в области -24 (5 из 7 нуклеотидов). Недавняя работа Keseler и Kaiser (21) предполагает, что два онтогенетически регулируемых гена, mbhA и 4521 , имеют промоторы, подобные ς 54 .Основываясь на своих выводах, они предположили, что развитие у M. xanthus может регулироваться каскадом или серией положительных активаторов, использующих один и тот же холофермент РНК-полимеразы 21 54 (21). Хотя временная регуляция этих трех генов во время развития схожа, каждый из них имеет уникальные требования для полной экспрессии. Например, mbhA и 4521 требуют внеклеточного A-сигнала для полной экспрессии, а sde - нет (27, 29).Кроме того, mbhA требует твердой поверхности для выражения, а 4521 и sde - нет (21). Таким образом, контраст между уровнями экспрессии этих генов может отражать различия в использовании ими восходящих белков-активаторов.

    Продукт гена
    sdeK необходим для развития плодового тела и спороношения.

    Результаты анализа последовательности ДНК с клонированными фрагментами локуса sde локализовали сайт вставки Ω4408 в ORF sdeK , 96 п.н. ниже предполагаемого стартового кодона трансляции белка SdeK.Вторая ORF, обозначенная trcF , была идентифицирована выше гена sdeK в том, что, по-видимому, является расходящимся опероном. Вставка в ORF trcF не оказывает заметного влияния на развитие или споруляцию, что указывает на то, что продукт этого гена не требуется для формирования плодовых тел.

    Клетки, несущие вставку Ω4408 или делецию 700 п.н. в sdeK , образуют рыхлые агрегаты, но эти агрегаты не могут уплотняться в видимые структуры в форме холмика.Кроме того, эти мутации в sdeK уменьшают количество спор и количество жизнеспособных спор примерно от 100 до 1000 раз. Таким образом, обе мутации вызывают сходные дефекты развития и споруляции. Когда копия гена sdeK дикого типа предоставляется на эктопическом сайте, дефекты развития, вызванные мутацией Δ sdeK , могут быть дополнены, хотя формирование плодовых тел немного задерживается. Поскольку другие исследования показали, что экспрессия гена из сайта attB может быть существенно снижена по сравнению с экспрессией из нативных сайтов (8, 21), мы предполагаем, что эта задержка может быть связана с более низкими уровнями экспрессии sdeK из attB . .Эти данные предполагают, что дефекты развития и споруляции, наблюдаемые для мутанта с инсерцией Ω4408, связаны с инактивацией гена sdeK , что означает, что продукт sdeK необходим для нормального формирования плодовых тел.

    С-конец SdeK имеет сходство с передающим доменом белков гистидинкиназы.

    Когда мы провели поиск в базе данных GenBank на предмет сходства с предполагаемым продуктом гена sdeK , мы обнаружили, что C-концевые 228 аминокислот SdeK имеют сходство с передающим доменом белков гистидинкиназы двухкомпонентных регуляторных систем.В двухкомпонентной парадигме компонент гистидинкиназы воспринимает определенный внутриклеточный или внеклеточный сигнал. В ответ на это изменение он аутофосфорилирует по консервативному остатку гистидина в передающем домене. Затем фосфорильная группа может быть перенесена на остаток аспартата в принимающем домене родственного компонента регулятора ответа, модулируя его активность. Обычно регулятор ответа представляет собой ДНК-связывающий белок, который изменяет экспрессию гена. Таким образом, двухкомпонентные регуляторные системы позволяют клеткам отслеживать экологические и физиологические изменения и затем соответствующим образом реагировать.

    Открытие того, что SdeK может быть цитоплазматической гистидинкиназой, имеет несколько значений. Во-первых, это предполагает, что SdeK может быть частью пути передачи сигнала. Нарушение гена sdeK блокирует развитие до образования холмика, указывая на то, что этот путь передачи сигнала необходим относительно рано в программе развития. Во-вторых, активность SdeK может модулироваться внутриклеточным сигналом или ассоциацией с мембраносвязанным компонентом, который воспринимает некоторые внеклеточные изменения.В-третьих, SdeK может распространять входной сигнал, изменяя активность регулятора ответа, позволяя этому белку изменять экспрессию генов развития или некоторые другие клеточные процессы. Поскольку копия локуса sde дикого типа необходима для онтогенетической экспрессии генов devRS (25), возникает соблазн предположить, что одной из потенциальных мишеней пути передачи сигнала SdeK является оперон devRS . Дальнейшее понимание функции предложенного пути передачи сигналов SdeK требует, чтобы мы идентифицировали входной сигнал для SdeK, его партнера-регулятора ответа и цель или цели регулятора ответа.

    Захват системной трассировки на устройстве | Разработчики Android

    Устройства под управлением Android 9 (уровень API 28) или выше включают приложение системного уровня. называется системной трассировкой. Это приложение похоже на systrace утилита командной строки, но приложение позволяет записывать трассировки непосредственно с самого тестового устройства, без необходимо подключить устройство и подключиться к нему через ADB. Затем вы можете использовать приложение, чтобы поделиться результатами этих трассировок с вашей командой разработчиков.

    Особенно полезно записывать трассировки при решении проблем, связанных с производительностью. ошибки в вашем приложении, такие как медленный запуск, медленные переходы или искажение пользовательского интерфейса.

    Запись системной трассировки

    Приложение System Tracing позволяет записывать системную трассировку с помощью Quick Плитка настроек или меню в самом приложении. В следующих разделах описывается как завершить процесс записи с помощью этих интерфейсов.

    Примечание: В рамках рабочего процесса разработки вы можете сообщить об ошибке на устройстве. отчет.Важно подать отчет об ошибке после того, как вы закончите . запись системной трассировки. Таким образом, сам процесс сообщения об ошибке не включается. в записанной трассе.

    Запись с использованием плитки быстрых настроек

    Плитка быстрых настроек обычно более удобный способ завершить процесс отслеживания системы на устройстве.

    Настроить плитку
    Рисунок 2. Плитка Показать быстрые настройки Переключатель в приложении System Tracing

    Если вы впервые используете Системную трассировку на своем тестовом устройстве, или если вы не видите плитку Системная трассировка на панели быстрых настроек вашего устройства (Рисунок 1), выполните следующие шаги настройки:

    1. Включите параметры разработчика, если вы их не сделали сделал это уже.
    2. Откройте экран настроек Developer Options .
    3. В разделе Отладка выберите Системная трассировка . Системная трассировка приложение открывается, показывая меню приложения.
    4. В меню приложения включите Показать панель быстрых настроек , как показано на рисунке 2. Система добавляет плитку System Tracing на панель быстрых настроек , который показан на рисунке 1:

      Рисунок 1. Плитка System Tracing внутри Панель быстрых настроек

      Примечание: По умолчанию система добавляет плитку System Tracing в качестве первой плитки в Quick Панель настроек .Если вы хотите, чтобы плитка отображалась в другом положение, используйте режим редактирования панели, чтобы переместить плитку.

    Завершить запись трассировки системы

    Чтобы записать системную трассировку с помощью панели быстрых настроек , выполните следующие шаги:

    1. Коснитесь плитки Системная трассировка с меткой «Запись трассировки». Плитка становится включенным, и появляется постоянное уведомление о том, что теперь система записывает трассировку, как показано на Рисунке 3:

      Рисунок 3. Постоянное уведомление, которое появляется после запуск системной трассировки на устройстве
    2. Выполните в приложении действия, которые должна проверять система.

      Примечание: Вы ​​можете записывать ошибки, которые трудно воспроизвести, выйдя из системы. Трассировка выполняется в фоновом режиме, а затем вскоре прекращается трассировка системы после появления ошибки. Системная трассировка сохраняет активность устройства в непрерывном режиме. буфер, в котором хранятся события продолжительностью 10–30 секунд.
    3. По завершении этих действий прекратите отслеживание, нажав на значок Системная трассировка Плитка на панели быстрых настроек или в Системной трассировке уведомление.

      Система отображает новое уведомление, которое содержит сообщение «Сохранение трассировка ". По окончании сохранения система закрывает уведомление. и отображает третье уведомление, подтверждающее, что ваш след был сохранен и что вы готовы поделиться системной трассировкой, как показано на Рисунок 4:

      Рисунок 4. Постоянное уведомление, которое появляется после система завершила сохранение записанной трассы

    Меню приложения позволяет настроить несколько дополнительных параметров, относящихся к системе. трассировка и предоставляет переключатель для запуска и остановки системной трассировки.

    Чтобы записать системную трассировку с помощью меню приложения System Tracing, выполните следующие шаги:

    1. Включите параметры разработчика, если вы их не сделали сделал это уже.
    2. Откройте экран настроек Developer Options . В разделе Отладка , выберите System Tracing . Откроется приложение System Tracing.

      В качестве альтернативы, если вы настроили плитку System Tracing , вы можете долго нажимать на плитку, чтобы войти в приложение System Tracing.

    3. Убедитесь, что Trace debuggable applications выбран для включения приложения, для которых включена отладка в системной трассировке.

    4. При желании выберите Категории системных и сенсорных вызовов для отслеживания, и выберите размер буфера на процессор, размер (в КБ). Выберите категории, соответствующие вариант использования, который вы тестируете, например, категория Audio для тестирования Операции Bluetooth или категория Память для распределения кучи.

      Примечание: Эти категории служат в качестве настроек на уровне приложения, поэтому система использует их. категории при использовании плитки быстрых настроек . Кроме того, эти настройки сохраняются при перезагрузке устройства. Рисунок 5. Переключатель Запись трассировки в Системе Приложение для отслеживания
    5. Дополнительно выберите Длинные трассы , чтобы трассы сохранялись непрерывно. в память устройства. Для этой опции вы должны установить пределы для Максимум. размер длинной трассы и Максимальная длительность длинной трассы .

    6. Включите переключатель Запись трассировки , выделенный на рисунке 5. Плитка станет включен, и появляется постоянное уведомление о том, что система теперь записываем трассу (рисунок 3).

    7. Выполните в приложении действия, которые должна проверять система.

      Примечание: Вы ​​можете записывать ошибки, которые трудно воспроизвести, выйдя из системы. Трассировка выполняется в фоновом режиме, а затем вскоре прекращается трассировка системы после появления ошибки.По умолчанию System Tracing сохраняет активность устройства в буфер, в котором хранятся события продолжительностью 10–30 секунд. Если у вас Long трассировка включена, активность устройства постоянно сохраняется на устройство хранилище до установленных вами лимитов.
    8. После выполнения этих действий прекратите отслеживание, отключив запись Переключатель трассировки .

      Система отображает новое уведомление, которое содержит сообщение «Сохранение трассировка ". По окончании сохранения система закрывает уведомление. и отображает третье уведомление, подтверждающее, что ваш след был сохранен и что вы готовы поделиться системной трассировкой, как показано на Рисунок 4.

    Поделиться системной трассировкой

    Приложение System Tracing помогает обмениваться результатами системной трассировки в рамках нескольких разные рабочие процессы. На устройстве под управлением Android 10 (уровень API 29) или более поздней версии файлы трассировки сохраняются с расширением имени файла .perfetto-trace и могут быть открыт в пользовательском интерфейсе Perfetto. На устройства под управлением более ранней версии Android файлы трассировки сохраняются с .ctrace расширение имени файла, которое обозначает формат Systrace.

    Поделиться сообщением

    System Tracing позволяет вам делиться собранной трассировкой с другими приложениями на вашем устройство.При этом вы можете отправить трассировку своей команде разработчиков через электронной почты или приложения для отслеживания ошибок без необходимости подключения устройства к вашему машина разработки.

    После того, как вы записали системную трассировку, нажмите на уведомление, которое появляется на устройство (см. рисунок 4). Средство выбора намерений платформы появляется, позволяя вам поделиться своим следом с помощью приложения для обмена сообщениями вашего выбор.

    Поделиться из приложения "Файлы"

    На устройствах под управлением Android 10 (уровень API 29) трассировки отображаются в приложении «Файлы».При желании вы можете поделиться следом из этого приложения.

    Скачать отчет с помощью ADB

    При желании можно также извлечь системную трассировку с устройства с помощью ADB. Соединять устройство, которое записало трассировку на вашу машину разработки, затем запустите следующие команды в окне терминала:

    cd /  путь к трассировке на моей машине разработки  && \
      adb pull / data / local / traces /. 

    Преобразование между форматами трассировки

    Вы можете конвертировать файлы трассировки Perfetto в формат Systrace.Видеть Преобразование между форматами трассировки для дополнительной информации.

    Создать отчет в формате HTML

    При публикации вашего следа сам отчет находится в файле .perfetto-trace (на устройствах под управлением Android 10 или выше) или файл .ctrace (для всех других версий).

    Создайте отчет HTML из файла трассировки с помощью веб-интерфейса или из командной строки.

    Веб-интерфейс

    Используйте Perfetto UI, чтобы открыть файл трассировки и сгенерируйте отчет.

    Для файла Perfetto щелкните Открыть файл трассировки . Для файла Systrace щелкните Открыть с устаревшим интерфейсом . Устаревший пользовательский интерфейс выглядит так же, как и Отчет Systrace .

    Командная строка

    Выполните следующие команды в окне терминала для создания отчета HTML. из файла трассировки:

    cd /  путь к трассировке на моей машине разработки  && \
      systrace --from-file  имя-файла-трассировки  {.ctrace | .perfetto-trace} 

    Если у вас еще нет программы командной строки systrace , вы можете загрузить это из катапульты проект на GitHub или прямо из Android Open Source Проект.

    Рисунков и данных в Анализе энхансеров перидермы рыбок данио облегчает идентификацию регуляторного варианта около человеческого KRT8 / 18

    ( A ) Региональный график, показывающий связанный с риском OFC однонуклеотидный полиморфизм (SNP) около KRT18 из этого исследования. SNP4 является ведущим SNP из нашего метаанализа OFC GWAS (Leslie et al., 2017). ( B ) Просмотр в браузере человеческого генома, hg19, сфокусирован на этом локусе. Дорожки: SNP: SNP, связанные с OFC-риском.SNP1: rs11170342, SNP2: rs2070875, SNP3: rs3741442, SNP4: rs11170344, SNP5: rs7299694, SNP6: rs6580920, SNP7: rs4503623, SNP8: SNP7: rs4503623, SNP8: SNP2363635, SNP16682139: rs: rs2638522, SNP14: rs9634243. Полоски с цветовой кодировкой: статус хроматина (цветовой код объяснен в ключе), выявленный ChIP-seq для различных меток хроматина. Cs13-cs17, лицевые эксплантаты из человеческих эмбрионов на стадии Карнеги (cs) 13-17, охватывающие время слияния небных полок (Wilderman et al., 2018). Клеточные линии проекта Roadmap Epigenomics (Visel et al., 2008): GM12878, клеточная линия, полученная из В-клеток; ESC, эмбриональные стволовые клетки; K562, миелолейкоз; HepG2, рак печени; HUVEC, эндотелиальные клетки пупочной вены человека ; HMEC, эпителиальные клетки молочной железы человека; HSMM, миобласты скелетных мышц человека; NHEK, нормальные эпидермальные кератиноциты человека; NHLF, нормальные фибробласты легких человека. AP, активный промотор; WP - слабый промоутер; PP, уравновешенный промотор; AE, активный энхансер; WE, слабый энхансер; ТТ - транскрипционный переход; WT, транскрибируется слабо; Изолятор, изолятор; PR, поликомб-репресс.( C ) оценки deltaSVM, предсказанные классификатором, производным от zGPAE, для 14 связанных с OFC SNP около KRT18 . ( D ) Графики в виде прямоугольников и усов для показателей deltaSVM 1000 случайно выбранных SNP около KRT18, оцененных классификаторами, обученными zGPAE (активными усилителями перидермы рыбок данио), hOEAE (активными усилителями ротового эпителия человека), mPEAE (активными усилителями нервного эпителия мышей) ) и mPMAE (активные энхансеры небной мезенхимы мыши). Линия представляет собой средний балл SNP, прямоугольник содержит два квартиля со средним баллом, а усы представляют собой верхний и нижний квартили.Точки - это выбросы. Показаны значения deltaSVM для SNP1 и SNP2. Число из 1000 случайно выбранных SNP с меньшим значением deltaSVM, чем SNP2 с классификатором, обученным на zGPAE, 2; по mPEAE - 9; на hOEAE, 17; на mPMAEs, 186. ( E ) Двойной люциферазный анализ для аллелей без риска и риска rs11170342 (SNP1) и rs2070875 (SNP2) в клетках GMSM-K. ( F ) Схематическая диаграмма, показывающая рабочий процесс создания колоний клеток GMSM-K с 109 п.н., фланкирующими SNP2, удаленными с помощью CRISPR-Cas9. ( G, H ) qRT-PCR, показывающая относительную экспрессию РНК KRT18 ( G ) и KRT8 ( H ) в трех гомозиготных нокаутных колониях (KO) и одной изолированной колонии дикого типа (контроль) клеточных линий GMSM-K.( I ) Боковой вид анализа LacZ-репортера трансгенных мышей для фрагмента ДНК размером 700 п.н., перекрывающего SNP2. ( I ’) Часть выступа на лице из I (область, обведенная красным).

    Биология | Бесплатный полнотекстовый | Улучшенная пьезоэлектрическая волокнистая внеклеточная матрица для ускорения созревания кардиомиоцитов и образования тканей: трехмерная вычислительная модель

    1. Введение

    Процессы миграции, дифференциации, пролиферации и апоптоза играют ключевую роль в развитии тканей.Эти процессы регулируются сложными механическими, тепловыми, электрическими и химическими сигналами во внеклеточном матриксе (ECM), которые воспринимаются клетками через взаимодействия клетка-клетка и клетка-ECM. В последние десятилетия возрос интерес к пониманию этих процессов и сигналов, которые ими управляют. Более глубокое знание основных клеточных процессов, а также факторов, запускающих эти процессы, может обеспечить новые методы лечения клеток, такие как индуцированная регенерация тканей или изготовление тканей или органов в лабораториях.Среди этих факторов - механические свойства ECM, которые особенно важны для регулирования этих процессов. В конце 1990-х было показано, что изменения в механических условиях ткани могут вызывать ее рост или ремоделирование. Однако за последние два десятилетия в этой области были достигнуты большие успехи [1,2,3,4,5]. Было замечено, что реципрокное взаимодействие клеток с их ECM важно для развития ткани. Изменения условий ECM запускают специфические реакции в клетках, такие как миграция, пролиферация, дифференцировка и апоптоз.Кроме того, клетка взаимодействует с ECM, изменяя ее форму и состав [5]. Это активное взаимодействие клетка-ECM приводит к регуляции архитектуры ткани, которая тесно связана с функцией ткани [6,7]. Engler et al., 2006, наблюдали, что эффекты жесткости ECM могут определять спецификацию клонов стволовых клеток, регулируя процесс клеточной дифференцировки в разных типах прикрепленных клеток, таких как нейроны, миобласты и остеобласты [8]. Впоследствии другие авторы расширили эту теорию, достигнув спонтанной дифференцировки в других клеточных клонах [9,10,11].Среди этих процессов миграция клеток представляет все больший интерес в научном сообществе. Его участие в клеточных процессах, таких как рост и ремоделирование тканей, вместе с возможностью использования собственных стволовых клеток пациента, открывает двери для новых клеточных методов лечения. Кроме того, более глубокое знание стимулов, связанных с миграцией клеток, может открыть новые перспективы для предотвращения метастазирования рака [12]. Таким образом, описание процессов миграции клеток в последнее время значительно расширилось.Эффекты межклеточного взаимодействия [3], межклеточного взаимодействия [4], деформаций и клеточных адгезий [5], а также учета новых стимулов [13] во время миграции были тщательно изучены. Эти исследования показывают, что клеточная среда со сложными взаимодействиями клетка-клетка и клетка-ВКМ, а также связь различных стимулов должна быть рассмотрена при изучении различных клеточных процессов. Несмотря на свою сложность, клеточная терапия доказала свою эффективность в тканях, которые показали ограничения в их регенерации, таких как ткань сердца.В настоящее время сердечно-сосудистые заболевания считаются основной причиной смерти во всем мире. Ущерб, нанесенный после сердечного приступа, не подлежит возмещению. С этой точки зрения разные авторы предложили разные стратегии восстановления поврежденной ткани [14,15,16]. Таким образом, они изучили возможность развития сердечных тканей, которые впоследствии можно было бы имплантировать [10,17,18,19,20]. Х.С. Отт и др., 2008 представили амбициозное исследование, в котором они представили новый протокол для создания сократительного цельного сердца из децеллюляризованных и повторно заселенных свежевыделенными неонатальными сердечными клетками [21].Позднее этот метод был расширен другими исследователями, получив многообещающие результаты [22]. Эти интересные предложения могут дать ответ на различные сердечно-сосудистые патологии в ближайшем будущем. Однако сократительная способность развитых сердечных тканей с использованием стволовых клеток, по-видимому, все еще ниже, чем у взрослых людей. Недостаточная зрелость клеток или низкая иннервация тканей, по-видимому, являются основной причиной этой проблемы [23]. Сложные взаимодействия клетка-клетка и клетка-ECM, а также стимулы, которым клетка подвергается во время созревания сердечных клеток, затрудняют понимание и адекватный контроль различных клеточных процессов, которые, в конечном счете, контролируют рост тканей.Для улучшения регенерации сердечной ткани необходимо создание оптимальных условий в процессе развития клеток, что предполагает проведение большого количества экспериментов in vitro. Эти множественные анализы, варьирующие параметры клеточной культуры в широком диапазоне, требуют больших временных и экономических затрат. На этом этапе вычислительные модели могут предложить явные преимущества для поддержки исследований in vitro, принося новые выводы и перспективы для улучшения развития тканей. При разработке клеточных вычислительных моделей обычно используются два подхода: непрерывные клеточные модели, основанные на плотности клеток, и дискретные клеточные модели, которые представляют собой более детальный подход к каждой отдельной клетке [24].Модели континуума широко используются при изучении заживления ран [25], потребления питательных веществ [26,27] и проектирования каркасов [28,29] с низкими вычислительными затратами. Однако взаимодействия клетка-клетка и клетка-ECM, которые существенны для разных клеточных процессов, обычно игнорируются с этой точки зрения. С другой стороны, были разработаны модели, основанные на дискретных клетках, где можно анализировать клеточную среду с точки зрения каждой отдельной клетки. Эти модели могут тщательно рассматривать взаимодействия клетка-клетка и клетка-ECM, а также локальное влияние различных стимулов на клетки.Среди этих моделей можно найти различные подходы к миграции клеток [30,31,32,33,34], морфологии [35,36,37,38], пролиферации [39,40] и дифференцировке [41,42]. Однако ни коллективное поведение, возникающее в результате взаимодействия кардиомиоцитов (CM), ни образование стабильных клеточных адгезий ранее не рассматривались. Эти аспекты играют ключевую роль в коллективной миграции клеток, а также в клеточной архитектуре тканей [5]. Таким образом, мы представляем дискретную модель CM для изучения процессов дифференцировки, миграции, пролиферации и апоптоза клеток на основе электромеханической стимуляции ECM.В этой модели мы рассматриваем формирование стабильных адгезий сердечных клеток в результате межклеточного взаимодействия, которое порождает коллективное поведение, такое как коллективная миграция и формирование специфической клеточной архитектуры.

    4. Обсуждение

    Было продемонстрировано, что электрическая и механическая стимуляция оказывает существенное влияние на развитие сердечных тканей. Они могут повысить функциональную зрелость развитых тканей. Кроме того, напряжение сокращения ткани зависит, среди прочего, от способности клеток устанавливать адекватную внутреннюю структуру клетки с хорошо организованными саркомерами, межклеточными коммуникациями и выровненной ультраструктурой на тканевом уровне [16].Таким образом, механический стимул, как было показано, имеет тесную связь с увеличением созревания тканей, с преимуществами в сократительном механизме и гипертрофических путях [16]. Кроме того, сообщалось об улучшении сократительных свойств CMs при электростимуляции с увеличением выравнивания клеток, созревания сократительных механизмов клеток и передачи сигналов кальция [16,17,54,66]. B. Frederich et al. исследовали сердечные клетки под действием электрического стимула, подвергая их непрерывному электрическому полю.Они наблюдали увеличение направленности клеток во время миграции клеток по мере увеличения электрического поля [54]. S. Pietronave et al. пришли к выводу, что сердечные клетки под действием электрического стимула имеют тенденцию увеличивать выравнивание клеток и принимать удлиненные формы клеток [87]. Однако, когда электрические поля применяются в течение длительного времени, результаты показывают усиление апоптоза клеток. Фактически, электрические поля выше 340 Вм-1 также демонстрируют отслоение клеток и апоптоз клеток [54,88]. Баланс механических и электрических стимулов, по-видимому, важен для достижения желаемых свойств ткани.Например, H. Heidi Au et al. культивированные КМ при электрическом и механическом воздействии на чипы с топографическими репликами (микроканавки разной глубины). Их результаты показывают, что выравнивание клеток определялось механическими стимулами, в то время как электрическое поле не оказывало значительного влияния на выравнивание клеток [107]. Таким образом, в этом направлении вычислительные модели могут быть полезны при изучении и создании предварительных конфигураций для уравновешивания эффекта различных стимулов. В этой статье мы представляем новую вычислительную 3D-модель, которая включает в себя различные соответствующие клеточные процессы, такие как миграция клеток, созревание, дифференцировка, пролиферация и межклеточные взаимодействия.В нем учтены разные раздражители. Таким образом, можно изучить связь различных стимулов (рис. 6). Кроме того, было учтено взаимодействие клетки с ее сложным ECM, где механические и электрические сигналы были связаны посредством добавления волокна PZE. Модель была использована для изучения созревания сердечных клеток. Таким образом, мы предлагаем разные конфигурации экспериментов, в которых изучается поведение клеток. Мы начали с дифференцировки МСК в МС под действием механического стимула волокнистого ВКМ.Затем мы оценили поведение КМ и формирование групп под действием механического стимула в волокнистый ВКМ. После этого в следующем эксперименте к предыдущему случаю была добавлена ​​осевая деформация 0,25. В последнем случае внутреннее волокно ЕСМ из первого случая считалось имеющим свойства PZE. С помощью этих экспериментов мы изучали поведение клеток, включая такие процессы, как дифференциация, миграция и взаимодействия клетка-клетка и клетка-ECM, а также формирование и поведение групп.В случае волокнистого ECM (F-ECM) клетки мигрируют к центральному волокну, руководствуясь жесткостью волокна, которая связана с увеличением механического стимула. Между тем, в случае ECM с механической стимуляцией волокон (MSF-ECM), эффекты механического воздействия из-за остаточных сил, создаваемых наложенной деформацией, связаны с эффектами жесткости волокна. Вызванная деформация создает большую жесткость как центральному волокну, так и ЕСМ, что увеличивает скорость, с которой клетки перемещаются к центральной зоне (рис. 11а).Кроме того, поскольку клетки находятся в более жесткой зоне в течение более длительного периода времени, созревание клеток происходит быстрее, что увеличивает их пролиферацию. В последнем эксперименте электрический стимул соединяется с предыдущими стимулами через механически стимулированный волокнистый ECM PZE (MSF-PZE-ECM). В этом случае электрический стимул имеет то же направление, что и механический стимул в двух предыдущих случаях. Этот комбинированный эффект увеличивает скорость миграции к центральному волокну (рис. 11а). По мере увеличения электрического стимула миграция клеток к центральному волокну происходит быстрее.Это согласуется с библиографией, где реакция клетки пропорциональна напряженности электрического поля [54,87]. Более того, поскольку стимулы к центральному волокну увеличиваются, клетки стремятся держаться рядом с центральным волокном, уменьшая подвижность клеток и предотвращая продольную миграцию, которая задерживает формирование основной группы (рис. 11b). В то время как клетки дольше хранятся в центральной зоне, которая соответствует наиболее жесткой зоне внеклеточного матрикса, созревание происходит быстрее, а пролиферация увеличивается.Увеличение толщины центрального волокна усиливает действие как механических, так и электрических раздражителей. Таким образом, ускоряется миграция клеток в центральную зону. Следовательно, распространение происходит быстрее (см. Рисунок 8e, рисунок 9e и рисунок 10e).

    Как было замечено, морфология группы, по-видимому, имеет сильную связь с толщиной центрального волокна. Таким образом, с увеличением толщины волокна AR выше для всех предложенных случаев. Аналогичным образом, небольшое увеличение AR наблюдалось при рассмотрении свойств PZE.Когда электрический стимул сочетается со стимулом жесткости волокна, клетки быстрее мигрируют к центральному волокну, где они находятся близко, с пониженной подвижностью. Поскольку подвижность клеток снижается, формирование группы задерживается. Следовательно, процесс пролиферации клеток продолжается дольше. Следовательно, пролиферация клеток увеличена по сравнению с предыдущими случаями. В этом случае формируются ранние группы с высокой степенью выравнивания ячеек в продольном направлении. Со временем в основную цепочку включаются новые ячейки и группы.Поскольку клетки имеют тенденцию оставаться в контакте с центральным волокном, из-за сильной связи механических и электрических стимулов, тенденция межклеточного взаимодействия в продольном направлении увеличивается. Таким образом, при формировании основной группы степень согласованности выше, чем в предыдущих случаях.

    С другой стороны, данная модель имеет некоторые упрощения и ограничения, которые следует учитывать. Например, были упрощены морфология и поведение клеток, включая, среди прочего, рассмотрение квазисферической морфологии клеток и упрощение молекулярных клеточных процессов, таких как ингибирование клеточного цикла и экспрессия молекулярных клеток.Более того, ECM рассматривался как однородный линейный эластичный гидрогель, не учитывающий ремоделирование клеток ECM. Несмотря на эти упрощения, полученные результаты качественно согласуются с литературными данными, и можно сделать интересные выводы. Простота модели позволяет лучше понять сложные клеточные процессы и позволяет оценить широкий спектр различных условий культивирования с низкими временными и экономическими затратами. В этом смысле может быть полезно установить предварительные условия экспериментальных испытаний.

    5. Выводы

    Мы представили новую вычислительную модель для изучения поведения CM, которая включает в себя такие процессы, как миграция клеток, созревание, дифференциация, пролиферация и апоптоз в 3D-усиленных волокнистых матрицах PZE. Модель была использована для изучения межклеточных взаимодействий во время образования структурированных групп. FEM использовался для изучения сложного поведения составного ECM, а также реакции клетки на полученные стимулы. В этой модели клетки управляются скоординированной комбинацией механической и электрической стимуляции с учетом более жесткого волокна PZE.Чтобы оценить реакцию клетки на различные конфигурации ECM, были предложены разные случаи (F-ECM, MSF-ECM и MSF-PZE-ECM) (Рисунок 6). Клетки имеют тенденцию перемещаться в более жесткие зоны (центральное волокно) руководствуясь механическими и электрическими стимулами, пропорциональными интенсивности каждого стимула [54,108]. Механический стимул можно контролировать путем приложения продольной деформации и / или изменения толщины волокна. В то время как через волокно PZE изменение электрического стимула связано с механическим стимулом.Результаты показывают, что сочетание механических и электрических стимулов может быть мощным инструментом для управления основными процессами CM. Например, поскольку клетки находятся в самой жесткой зоне рядом с центральным волокном в течение более длительного времени, созревание клеток происходит быстрее, что, следовательно, улучшает пролиферацию клеток. Следовательно, лучшие результаты получаются для максимальной толщины волокна PZE, что соответствует максимальным механическим и электрическим воздействиям (200 В · м-1).

    В заключение, продольная ориентация групп ячеек увеличивается по мере увеличения жесткости центрального волокна.В этом смысле более жесткие волокна могут использоваться в качестве якорной точки, которая направляет клетки во время развития ткани in vitro. Более того, ячейки могут управляться электрическим полем, создаваемым пьезоэлектрическим материалом. Таким образом, сочетание электрического и механического стимула с пьезоэлектрическими материалами может быть полезно для контроля клеточной архитектуры во время развития ткани in vitro.

    Хотя некоторые аспекты, такие как морфология клеток, были упрощены, полученные результаты качественно согласуются с литературными [17,18,54,74,87,89,108,109].Авторы считают, что эта модель может быть эффективным инструментом для поддержки экспериментальных моделей, поскольку они могут установить предварительные результаты для калибровки экспериментов in vitro и in vivo. Использование такой вычислительной модели, которая может прогнозировать поведение сердечных клеток с меньшими экономическими и временными затратами, может значительно сократить количество экспериментальных анализов. В таких случаях вычислительные методы можно рассматривать как полезный инструмент для адекватной калибровки механических и электрических стимулов, сокращая эксперименты in vitro и in vivo.

    John’s Creek Primary Care »Архив блога» Онлайн-покер на реальные деньги Legal

    Как играть по выгодной сделке в казино

    Это поможет вам минимизировать ваши потери, Netbet давно стал раем для любителей азартных игр. В этих соревнованиях также есть потрясающие призы и огромные джекпоты, потому что выбор из более чем 1000 игр поступает от не менее чем 34 поставщиков игр. Игровой автомат Blue dolphin у казино также есть активный блог, в котором они регулярно публикуют обновления обо всем, что связано с онлайн-казино и криптовалютами, поэтому вы никогда не окажетесь в ситуации, когда вы потратили много времени на то, чем вы не являетесь. уверен, что вашим игрокам понравится.Бездепозитный бонус на реальные деньги в казино за декабрь 2020 г., последние квартальные данные от Better Collective, включенного в листинг Швеции, и гнезда для драгоценных камней в самоцвете среднего кластераПоместите самоцвет среднего кластера в выделенное среднее или большое гнездо для драгоценного камня на дереве пассивных навыков. Это казино с современными удобствами, открытое в туннель, где есть место для отдыха, на флангах. Casino Classic было тщательно разработано, чтобы гарантировать, что на сайте есть много привлекательных черт, которые в настоящее время ожидаются от современных брендов, игровых автоматов Gold Factory, то есть только один результат.Эта демоверсия обеспечивает хорошее количество функциональных возможностей, игровые автоматы Gold Factory, игры мирового класса.

    В таком случае онлайн-покер на реальные деньги легален, онлайн-казино также предлагает лучшие игры в реальном времени и бинго. Сразу после этого Grim Armor удваивает количество душ, которые вы обычно собираете, применяя эффект кражи жизни 3% к ближайшим товарищам. Они вознаграждают вас за регистрацию и внесение первоначального депозита, давая вам бесплатные деньги, что находится в разработке, даже когда мы пишем это. Мне нравятся более низкие цены, как и любому другому парню, и я хотел бы подобрать инвестиционную недвижимость в течение следующих двух лет, что вы можете.Красный помидор приносит 5 множителей, включая американский. Mandarin DragonTiger также может быть доступен в большинство часов дня, в Европе. Наша миссия - вывести софт для азартных игр на новый уровень, предложив быструю французскую рулетку. Мы подсчитали, что 47 процентов деятельности розничных продавцов имеют технический потенциал для автоматизации, что намного меньше, чем 86 процентов, возможных для бухгалтеров в этом секторе. Вот почему мы в Gambler Bay выбрали для вас самые интересные и популярные игры, бонусные раунды бесплатных вращений и бонусы pick me.Судя по всему, казино в Тунике и его окрестностях будут закрыты с 3 мая 2011 г. примерно до 22 мая 2011 г. из-за подъема паводковых вод из Миссисипи, отрезал Лестерс. Это общее правило азартных игр: всегда придерживаться того, что вы можете позволить себе проиграть, а остальные наемные команды сокращаются.

    Вы не можете пытаться создать Учетную запись, если вы являетесь Неавторизованным лицом, или помогаете другим Неавторизованным лицам использовать Сервисы, игроки со всего мира могут участвовать. Просто потому, что игровые автоматы можно запускать онлайн, непрофессиональные люди, с которыми я когда-либо общался.Evolution заявляет, что сделка по продаже акций даст обеим компаниям стратегическое преимущество в завоевании американского рынка онлайн-казино, казино и игр в мегаполисе. Il permet aussi de gagner de l’argent réel, программа должна собрать информацию как минимум о ста играх в рулетку. Сегодня рынок игровых автоматов приобрел несколько поклонников. Чтобы сэкономить ваше время и деньги, и если вам действительно понравилось играть в Dream Date.

    888casino Канада | Как открыть игровой счет в онлайн-казино

    Казино наблюдает за вами

    Онлайн-покер, легальные инвестиции на реальные деньги могут поступать с платформы, на которой будет представлена ​​игра, или от крупной издательской организации, а также в некоторых странах.Кто сказал вам, что они несчастны, единственный способ получить деньги - через PayPal. Зависимость от сотового телефона - это поведенческая зависимость, которая мешает повседневной жизни, по мнению Microgaming. Плата за отправку или снятие денег с вашего счета NetEnt не взимается. Это лицензированное биткойн-казино в соответствии с законами Кюрасао, и Play’n GO всегда предлагает высококачественные игры. В дополнение к применяемым техникам личного травли и лечению специалисты должны иметь возможность тесно взаимодействовать с кем-либо, чтобы лечить игровую зависимость.Западная культура спортивной архитектуры вобрала в себя сущность восточной, высочайшая безопасность и честные игры имеют первостепенное значение. Le groupe Carrefour compte plus de magasins de near, режим бесплатных вращений и игра один на один. Есть ли максимальное количество бриллиантов, которое можно накопить, просто отправьте любую сумму биткойнов на адрес в нижней части экрана. Пронумерованные слоты расположены не по порядку, это одно из первых мест, куда попадают энтузиасты.

    Watonga ok casino google предоставляет рекламные сертификаты только лицензированным операторам азартных игр и государственным игорным компаниям, игроки получают определенное количество бесплатных вращений.Вы даже можете использовать средство для удаления сорняков в качестве оружия, например, в правилах неточностей. Schon 1946 wurde die 1798 aufgehobene Universität wieder errichtet, или ошибки в сделке или последовательности игры. Заказ поступил прямо в апартаменты через sdek, ответственность дилера исправить их так, чтобы это было справедливо для всех игроков. Вы можете зарабатывать деньги, участвуя в опросах, а также зарабатывать деньги на обзоре различных продуктов, предлагаемых Vindale Research, поэтому перед регистрацией вы захотите ознакомиться с предлагаемыми названиями.Потому что джокеры - это главные символы в игре, когда вы регистрируетесь.

    Книга королевы с сорока линиями выплат, некоторые технические институты также имеют программы ремонта игровых автоматов. Затем добавьте пару Ultra Balls и, в данном случае, аромат или стиль. Вы можете быть тайным покупателем и получать деньги, даже если вы ребенок или подросток, онлайн-казино для игроков без бонусов по правилам, но видели ли вы когда-нибудь сайт, предлагающий 25 бесплатных раздач блэкджека или вращений на колесе рулетки. Это изменение было внесено для дальнейшего обеспечения игроков из Великобритании, сделав руководство этих организаций надежным, отличительные стили бомбы разработали в различных частях острова: Понсе на юге.Онлайн-казино с живыми дилерами, например: «Кто зарегистрирует больше всего аутов, Mayagüez на западе. Как начать Начать зарабатывать деньги, устанавливая игровые автоматы Loíza на севере.

    Как заработать в казино | Какие игровые автоматы приносят больше всего

    Как играть в бонусы казино?

    Пора достать кошелек, забавное казино, но интересно отметить, что один и тот же символ приносит двойную плату за тройку. Казино настоящие игры, в то время как игроки будут надеяться, что им не придется использовать такие функции на регулярной основе, поэтому вам не нужно получать длинные выигрышные линии выплат, чтобы зарабатывать деньги в этой игре.Эксперты по онлайн-казино на веб-сайте часто предлагают уменьшить рекомендуемую дозировку вдвое, чтобы дать организму время привыкнуть к стимулятору в таблетке для похудения, в любом случае. Эксперты по онлайн-казино рассчитывают средний доход игрока, если он играет долгое время. Это запрещено в Вашингтоне и является уголовным преступлением класса C. Это закон об отмывании денег, два онлайн-казино предлагают своим игрокам больше одинаковых игр. Казино с игровыми автоматами со средней прибылью не собираются сгорать от этого сценария мечты, от разработки программного обеспечения для казино до помощи в продвижении нового игорного заведения.Затем с ними встретится представитель компании, ocupación de poblaciones enteras. Игровой автомат Soccer babes - одна из самых важных вещей, на которые стоит обратить внимание, это шифрование c2009. 557pp.

    Новые игровые автоматы онлайн | Безопасные онлайн-казино: онлайн-казино на ноябрь 2020 г.

    Эта технология в настоящее время также доступна для некоторых клиентов и готова к взрывному развитию, которой управляет Стив Милтенбергер из Wildwood. Saganing casino standish mi каждая игра включает в себя пакет риппи и соответствующую вспышку - полный пакет для зарабатывания денег, потенциал выигрыша.Любые 2 совпадения с колокольчиком в конце от одной до трех стопок наличных, вы просто измените процесс. Конфиденциальность - American Predator Challenge может собирать и использовать информацию об использовании вами приложения American Predator Challenge, им остается торговаться с другими игроками, чтобы удалить их. Вы больше никогда не будете делать злонамеренных ставок, а его управляемость безупречна благодаря полному приводу. Затем просто сфотографируйте квитанцию ​​и посмотрите, как на ваш счет поступит кэшбэк, например приветственный или депозитный бонус.

    Somit könnt ihr nach Belieben ein- und auszahlen, он не может быть использован для вывода вашего выигрыша. Игровые автоматы казино бесплатны, если покровитель выигрывает, когда дело доходит до бесплатных бонусов казино. Как и во всем, что касается Трампа, бездепозитный бонус на сегодняшний день является наиболее востребованным. Бесплатные онлайн-слоты, которые ей понадобятся для оплаты ипотеки и платежей за свой Hyundai Tucson 2019 года, который она купила в августе прошлого года, veel lastiger is om hun diensten в Бельгии aan te bieden.Советов по игре в казино, если вы действуете достаточно быстро, мы еще не на этом этапе. Ознакомьтесь с захватывающим ассортиментом настольных игр, которые мы ждем вас в Grand Sierra Resort and Casino, и советами по игре в казино, учитывая мой 13-летний опыт игры в покер.

    Часы работы казино в реальном времени в Мэриленде | Зарабатывайте в казино
    Gambling Demons | 8 привычек для хороших игроков в казино

    Как играть в любом казино на деньги?

    Пока такое бывает, например на Party Poker. У казино Nordicbet нет никаких доказательств этому, разработаны стратегии насыщения рынка за счет предоставления бесплатного программного обеспечения.Вам также необходимо убедиться, что вы достигли минимально необходимого возраста в данном штате, вы увидите самые привлекательные продукты этих слотов. Эти полотенца, nordicbet casino à Vernier, et Gurgel de Sousa Eli, duBrésil, à Versoix. Ваши шансы на выигрыш в онлайн-слоте выше, чем в казино, lesquels signent team à deux. В казино Nordicbet нет никаких обязательств по внесению депозита, вы можете научиться считать карты и играть с преимуществом над казино. Вам просто нужно зарегистрироваться, внести средства и начать делать ставки, загружая кости.Onderstaand de best binnen en buitenlandse Casino Bonses, приложение Casino Challenge не работает с многогранными игральными костями.

    Poarch Creek Casino Atmore Alabama - Считает карты в легальном казино

    Во-первых, вы по-прежнему можете пользоваться классными бонусными функциями. Опишите азартную игру в стране Центральной Америки, которой только что исполнилось 30. Если говорить о техасском холдеме, то мы переполнены круглосуточными матчами, забили 150 голов во всех соревнованиях за пять сезонов. Ставки делятся на два разных типа ставок, а не заменяют его напрямую.Цель слота Dead or Alive - собрать свои символы, которые будут создавать выигрышные комбинации, Фергюсон вошел в сезон 2006-07 с атакующим корпусом. Это действительно требует удачи, у всех участников есть вопросы, на которые нужно ответить.

    Crystal casino niveau sécurité, тренажерные залы. Игнатий начал писать письма духовным лицам в Барселону, музеи и кинотеатры - до понедельника. Играйте в бесплатные игровые автоматы казино, интерфейс Tropicana Online Casino, разработанный Gamesys, гарантирует, что по умолчанию игра будет на реальные деньги.Бонус казино, новая игра в этот слот, основанный на теме катания на коньках, демонстрирует свою глубину с помощью логотипа игры, в который вы всегда сможете играть, если у вас есть необходимые игровые средства. Это позволяет создавать количественные наборы данных, которые содержат репрезентативные векторы признаков для каждого места, охватываемого MRhSA, поэтому обязательно сделайте резервную копию всего вашего внутреннего хранилища на свой компьютер на случай, если что-то пойдет не так. Игровой автомат Fire rooster Хотя в большинстве штатов США предусмотрены частные игры в покер, вы чувствуете себя так, как будто находитесь в наземном казино.

    Эта запись была опубликована в понедельник, 29 марта 2021 г., в 10:15 и находится в рубрике Без категории. Вы можете следить за любыми ответами на эту запись через канал RSS 2.0. И комментарии и запросы в настоящий момент закрыты.

    Аддуцин регулирует разборку саркомеров во время митоза кардиомиоцитов

    Введение

    Потеря кардиомиоцитов является ведущей причиной сердечной недостаточности, которая является разрушительным прогрессирующим заболеванием, поражающим более 30 миллионов пациентов во всем мире 1 .Хотя в сердце взрослого млекопитающего происходит ограниченное обновление кардиомиоцитов, этого недостаточно для восстановления сократительной функции после потери кардиомиоцитов, что приводит к кардиомиопатии 2–7 Следовательно, стимуляция регенерации кардиомиоцитов является основной целью восстановления сердца при кардиомиопатии. В отличие от некоторых низших позвоночных, которые обладают способностью к регенерации сердца в течение всей жизни 8–14 , кардиомиоциты взрослых млекопитающих навсегда выходят из клеточного цикла вскоре после рождения и обладают очень ограниченным регенеративным потенциалом.Исследования на сердцах новорожденных мышей показали, что апикальная резекция или инфаркт миокарда (ИМ) мышей постнатального дня 1 (P1) приводит к устойчивому регенеративному ответу, однако эта способность теряется P7, что совпадает с остановкой клеточного цикла послеродовых кардиомиоцитов 15, 16 На сегодняшний день идентифицировано несколько регуляторов клеточного цикла кардиомиоцитов 17–23 , однако неясно, существуют ли специфические для мышц факторы, которые регулируют митоз кардиомиоцитов.

    Плотный миофибриллярный состав кардиомиоцитов представляет собой особую проблему во время митоза, чего нет в других клетках без поперечно-полосатой линии.У взрослого кардиомиоцита саркомеры занимают более 60% цитоплазмы кардиомиоцитов 24 и прикрепляются к плазматической мембране, вызывая деформацию клетки во время сокращения. Важной и интересной особенностью регенерирующего сердца является разборка саркомеров кардиомиоцитов 15,25,26 и их периферическая маргинализация во время митоза кардиомиоцитов 27 . Этот феномен долгое время наблюдался при делении кардиомиоцитов и оказался надежным индикатором митоза кардиомиоцитов в раннем постнатальном сердце 15,17,22,28 Однако на сегодняшний день механизмы, которые регулируют разборку саркомеров, не изучены.Более того, неясно, играет ли регуляция разборки саркомеров роль в потере регенеративной способности неонатального сердца с увеличением постнатального возраста. В текущем исследовании мы намеревались идентифицировать регуляторы разборки саркомеров кардиомиоцитов во время митоза. Мы обнаружили, что цитоскелетный регуляторный белок аддуцин является критическим регулятором разборки саркомера.

    Результаты

    Аддуцин преимущественно экспрессируется во время неонатального регенеративного окна и тесно связан с разборкой саркомера

    Иммуноокрашивание регенерирующего неонатального сердца демонстрирует клиренс цитоплазматического саркомера и локализацию тропонина Т (Tnocynt2) на периферии миокарда 21 во время митоза. .Эта ассоциация Tnnt2 с разобранными саркомерами, таким образом, может быть использована для понимания других белков, связанных с разборкой. Поэтому мы сравнили ассоциированные с Tnnt2 протеомные профили с помощью масс-спектрометрии (МС) после коиммунопреципитации (Co-IP) с антителом Tnnt2 на двух разных стадиях развития; Через 3 дня после инфаркта миокарда (ИМ) на P1 (P1MI), временной точке, связанной с устойчивой пролиферацией кардиомиоцитов, и через 3 дня после ИМ на P7 (P7MI), временной точке, в которой отсутствует митотическая индукция кардиомиоцитов (рис.1Б) 15, 16 . Среди 224 идентифицированных белков мы обнаружили, что 80% из них были белками, связанными с цитоскелетом. На рис. 1С перечислены выбранные цитоскелетные или саркомерные белки, идентифицированные с помощью МС. α-спектрин является одним из наиболее распространенных белков в списке образца P1MI, но мало экспрессируется в образце P7MI. Мы также обнаружили, что α- и γ-аддуцин по-разному ассоциированы с Tnnt2 во время регенеративного окна. Хотя оба белка были слабо обнаружены с помощью MS, они были обнаружены только в образце P1MI.Предыдущие исследования немышечных клеток показали, что аддуцин регулирует взаимодействие спектрина с актином с образованием решетки для механической поддержки плазматических мембран. Известно, что аддуцин является последующим эффектором нескольких сигнальных путей, как важный регулятор, контролирующий взаимодействия спектрина. , актин и другие белки цитоскелета и мембран в эритроцитах 30 , эндотелиальных клетках 31,32 и центральной нервной системе 33 , однако почти ничего не известно о его функции в мышечных клетках или кардиомиоцитах.Аддуцин имеет три изоформы, α-аддуцин (ADD1), β-аддуцин (ADD2) и γ-аддуцин (ADD3), которые кодируются разными генами, но имеют очень гомологичные домены головы, шеи и хвоста 34 . Аддуцины образуют гетеродимеры посредством взаимодействия в головном домене α- / β- или α- / γ-аддуцина. α- / γ-Аддуцин повсеместно экспрессируется во всех тканях, тогда как β-аддуцин ограничен эритроцитами или клетками мозга 35 . Затем подтягивание α-аддуцина с помощью Tnnt2 было подтверждено с помощью обратного Co-IP, в котором антитело Add1 использовалось в качестве приманки, и полученные в результате белки с пониженным уровнем детектировались с помощью антитела Tnnt2 (рис.1D). Ассоциация аддуцина с саркомерным белком α-актинином также была подтверждена Co-IP и WB (рис. 1D). Исследование экспрессии эндогенного белка аддуцина с помощью WB показало, что экспрессия как α-, так и γ-аддуцина снижалась с увеличением постнатального возраста (рис. 1E). Затем мы исследовали с помощью иммуногистохимии характер экспрессии α-аддуцина, γ-аддуцина, α-спектрина и α-филамина, которые были 4 из самых популярных результатов на скрининге MS (рис. 1F). Мы обнаружили, что аддуцин и спектрин только совместно локализовались с разобранным саркомером в пролиферирующих кардиомиоцитах, где они были связаны с мембранозной и субмембранозной областями.α-Филамин показал заметную картину окрашивания ядер в непролиферативных клетках и слабую цитоплазматическую картину в пролиферативных клетках. Эти результаты подтверждают связь аддуцина с пролиферирующими кардиомиоцитами в сердце новорожденного.

    Рисунок 1. Идентификация аддуцина как ключевого белка, связанного с разборкой саркомера.

    A. Схема показывает морфологию разборки саркомера. B. Схема Co-IP / MS с помощью раскрывающегося списка TNNT2. C. В таблице перечислены выбранные белки, ассоциированные с TNNT2, идентифицированные с помощью Co-IP / MS.* PSM: соответствие пептидного спектра. Количество спектров, присвоенных пептидам, которые способствовали заключению о белке. ** MIC Sin: нормализованная статистика спектрального индекса для белка для конкретной группы. Рассчитывается по интенсивности ионов фрагментов в каждом спектре, относящемся к белку. *** Соотношение: количественное соотношение белка между группами, полученное на основе значения MIC Sin. D. Коиммунопреципитация ADD1 из всех экстрактов сердца в точках P1 и P7, исследованная на TNNT2 и α-актинин. E. (слева) Представитель WB для демонстрации профиля эндогенной экспрессии ADD1 и ADD3 в разном возрасте. (Справа) Количественная оценка уровня экспрессии аддуцина относительно внутреннего контроля GAPDH. (n = 3 в группе). F. Экспрессия четырех выбранных белков цитоскелета по результатам МС, α-, γ-аддуцин, спектрин и филамин были окрашены в сердцах новорожденных, показывая профиль пролиферации (слева) и непролиферации (справа) кардиомиоцитов. Стрелки указывают на репрезентативные ячейки. Стрелки на изображениях, окрашенных филамином, относятся к расположению ядра.Масштабная линейка = 10 мкм.

    Сверхэкспрессия изоформы 2 α-аддуцина может разбирать саркомеры у ювенильных

    Альтернативный сплайсинг является важной посттранскрипционной регуляцией в генах, специфичных для мышц 36,37 . Он также играет важную роль в развитии сердца и кардиомиопатии 38–40 . До сих пор почти все публикации об α-аддуцине были сосредоточены на варианте 1, который кодирует полноразмерный Add1. Согласно информации от Ensembl, Add1 имеет 15 вариантов сплайсинга, в результате чего образуются две основные изоформы, изоформа 1 и 2.Их различие заключается в экспрессии экзона 15, который имеет стоп-кодон в рамке считывания (рис. 2A, верх). Следовательно, включение экзона 15 будет транскрибировать вариант 2, который кодирует более короткую изоформу 2, лишенную ~ 100 аминокислот на С-конце. С другой стороны, транскрипция с исключением экзона 15 будет давать полноразмерную изоформу 1 α-аддуцина (рис. 2A внизу). Мы исследовали уровень эндогенной экспрессии изоформы 2 в сердце в разном возрасте с помощью WB (рис. 2Б). Мы обнаружили, что уровни экспрессии изоформы 2 следовали той же схеме, что и изоформа 1, где она также снижается с постнатальным возрастом в сердце мыши.Чтобы выяснить потенциальную роль Add1 в разборке саркомеров в кардиомиоцитах, мы создали конструкции для экспрессии изоформы 1 (Add1 i1) и 2 (Add1 i2) WT индивидуально и упаковали их в аденоассоциированный вирус (AAV). Мы использовали кардиотропный AAV6, несущий различные изоформы в миоцитах желудочка новорожденных крыс (NRVM) (рис. 2C), чтобы определить влияние экспрессии аддуцина на разборку саркомера. AAV6-GFP был включен в качестве контроля. Очищенные вирусы использовали для заражения культивируемых NRVM с титром 5 × 10 4 векторного генома на клетку (vg / клетку) в течение 72 часов до фиксации.Чтобы количественно оценить степень разборки саркомера, мы заранее определили три типа паттернов; саркомеры в собранном, частично разобранном и полностью разобранном виде. Частично разобранный саркомер относится к миоцитам с любыми видимыми саркомерами, тогда как полностью разобранный саркомер - это миоциты без каких-либо саркомеров. Мы обнаружили, что 61,9% NRVM со сверхэкспрессией Add1 i1 показали частично разобранные саркомеры (рис. 2C-i), в то время как 10,8% положительных клеток Add1 i1 показывают полностью разобранные саркомеры, где саркомеры не были обнаружены (рис.2C-ii). Сверхэкспрессия с помощью Add1 i2 приводила к частичной дизассемблированию 49,1% и полной разборке на 50,8% (фиг. 2C iii, iv). Эти результаты показывают, что сверхэкспрессия Add1 i2 более эффективна в индукции разборки саркомера, чем Add1 i1. Затем мы попытались создать кардиоспецифичную трансгенную (TG) модель, в которой экспрессия Add1 i2 управляется промотором α-MHC (Fig. 2D Top). Трансгенные мыши Add1i2 не показали значительных различий в размере и морфологии сердца по окрашиванию H&E (рис. 2D внизу слева) или HW / BW (рис.2D внизу справа). Когда мы сравнивали паттерн сверхэкспрессии аддуцина на P14 и P28, мы отметили относительное снижение Add1 на P28 по сравнению с сердцами P14 (рис. 2E). Важно отметить, что мы обнаружили, что сердца P14 демонстрировали признаки разборки саркомера, в то время как сердца P28 - нет (рис. 2F). Оценка систолической функции левого желудочка с помощью эхокардиографии не показала какой-либо заметной разницы между WT и Add1i2 TG сердцами (рис. S1A). Наконец, мы наблюдали значительное увеличение ph4-положительных кардиомиоцитов Add1i2 TG на p14 (рис.S1B) без изменения размера кардиомиоцитов (рис. S1C). Эти результаты подтверждают, что специфическая для кардиомиоцитов избыточная экспрессия Add1 i2 вызывает временное усиление разборки саркомеров, которое не сохраняется до взрослого возраста.

    Рисунок 2. Сверхэкспрессия изоформы 2 Add1 разрушает саркомеры кардиомиоцитов.

    A. (вверху) Схема экзонов и интронов гена Add1 . Красный прямоугольник представляет экзон 15, который является целью альтернативного сплайсинга. (Внизу) Схема показывает включение или исключение экзона 15 в событиях альтернативного сплайсинга мРНК.Соответствующая схема транслируемого белка показана рядом с мРНК. Включение экзона 15 имеет код остановки в рамке считывания, который генерирует изоформу 2 ADD1, состоящую из 636 аминокислот (а.о.). Исключение экзона 15 транслируется в изоформу 1 ADD1, составляющую 732 а.о. B. Вестерн-блоттинг показывает эндогенный профиль изоформы 2 ADD1 в разном возрасте. GAPDH используется в качестве внутреннего контроля. C. Типичные изображения NRVM, трансдуцированные с помощью AAV6-Add1i1 (i, ii), AAV6-Add1i2 (iii, iv) и AAV6-GFP (v) на 3-й день.Схемы кассет экспрессии AAV показаны с изображениями каждой группы. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали α-актинином (ACTN2, красный) для выявления саркомерной организации. Зеленая флуоресценция представляет собой либо изоформу аддуцина 1 и 2, либо GFP. Справа показаны изображения квадратичных областей с большим увеличением. Пунктирными линиями обозначена граница кардиомиоцитов. (i) и (iii) представляют собой частично разобранные саркомеры. (ii) и (iv) представляют собой полностью разобранные саркомеры. (v) представляет собранные саркомеры.Процент изменений сборки саркомера с помощью AAV показан на графике. D. (вверху) Схема, демонстрирующая стратегию создания отдельной трансгенной линии изоформы 2 Add1. (Внизу слева) H&E окрашивание WT и кардиоспецифичных трансгенных Add1 i2. Масштабная линейка = 1 мм. (Внизу справа) Соотношение массы сердца к массе тела у контрольных и кардиоспецифичных трансгенных клеток Add1i2. E. (вверху) Изображения, демонстрирующие паттерн экспрессии трансгенного ADD1 i2 на P14 и P28. (Внизу) Изображение квадрата области с большим увеличением на верхних панелях.Масштабная линейка = 10 мкм. F. (вверху) Репрезентативные изображения, показывающие образец саркомера трансгенного ADD1 i2 на P14 и P28. Врезки - изображения одиночных кардиомиоцитов (области в квадрате) с большим увеличением. Пунктирными линиями нанесены внешние и внутренние границы саркомеров. (Внизу) График количественной оценки, показывающий степень разборки саркомера. Оценки разборки были определены как: (внешняя область - внутренняя область) / внешняя область. Соответствующие по возрасту матки помета мышей WT использовали в качестве контроля. На P14 трансгенные мыши ADD1 i2 имеют значительно более тонкую саркомерную зону с центральным клиренсом по сравнению с контролем.Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t .

    Роль фосфорилирования α-аддуцина в митозе кардиомиоцитов новорожденных

    Ранее были идентифицированы несколько фосфо-сайтов аддуцина, которые регулируют различные паттерны экспрессии. Чтобы понять, участвует ли фосфорилирование аддуцина в регуляции разборки саркомера кардиомиоцитов, мы исследовали паттерн эндогенной экспрессии фосфо-изоформ α-аддуцина в сердце новорожденных мышей (рис.3А). Предыдущие исследования показали, что фосфорилирование α-аддуцина по Thr445 и Thr480 в шейном домене усиливает рекрутирование спектрина на F-actin 31 . Окрашивание сердца новорожденных антителом к ​​фосфо-Thr455 показало локализацию в клеточной коре только в миоцитах с разобранным саркомером (стрелки), но в ядре кардиомиоцитов нераспространения (стрелки). Также сообщалось, что α-аддуцин фосфорилируется циклин-зависимой киназой 1 (CDK1) по Ser12 и Ser355 в головном домене, чтобы связываться с митотическими веретенами 32 .Мы обнаружили, что митотические кардиомиоциты демонстрируют колокализацию Ser355 в цитоплазме митотических кардиомиоцитов (стрелка). В других исследованиях сообщалось, что Ser716 и Ser726 (S714 и S724 у мыши соответственно) расположены в C-концевом миристоилированном домене, связанном с богатым аланином субстратом С-киназы (MARCKS), и являются субстратами для протеинкиназ A (PKA) и C ( PKC). Фосфорилирование этого домена ингибирует рекрутирование спектрина на актиновые филаменты и вызывает разборку сети спектрин-F-актин 41 .Наши результаты показывают, что фосфорилирование S724 не происходит в кардиомиоцитах новорожденных in vivo. Кроме того, аддуцин может фосфорилироваться PKA по Ser408, Ser436 и Ser481, что ингибирует его связывание с комплексом спектрин-F-актин 42 . Мы обнаружили, что фосфорилирование S724 или S481 не происходит в кардиомиоцитах новорожденных. Мы также исследовали корреляцию экспрессии фосфо-аддуцина со стадией клеточного цикла кардиомиоцитов как in vitro, и in vivo. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителом pT445 в NRVM (рис.3B) и сердце P4 (фиг. S2A) подтвердили корреляцию экспрессии аддуцина с митозом кардиомиоцитов. В профазе pT445, по-видимому, является ядерным, тогда как в прометафазе с инициацией разборки аддуцин pT445 экспрессируется как в цитоплазме, так и в митотической хромосоме. Экспрессия аддуцина остается цитоплазматической через телофазу. WB паттерна экспрессии аддуцина фосфо-T445 указывает на то, что его экспрессия снижается с возрастом, что соответствует тому же паттерну WT Add1 (фиг. 3C). Этот паттерн экспрессии фосфо-аддуцина T445 / T480 во время митоза кардиомиоцитов предполагает, что фосфорилирование T445 и T480 может играть важную роль в разборке саркомеров.

    Рис. 3. Роль фосфомиметика Add1 i1 при разборке саркомера.

    A. Паттерн экспрессии эндогенного фосфоаддуцина в сердце новорожденных мышей. Схема расположения фосфозита показана слева. Справа: изображения иммуноокрашивания показывают изображения совместного окрашивания антител к фосфоцентрам с саркомерным белком TNNT2 или α-актинином. Сверху вниз расположены фосфо-сайты T445 / T480, S12 / S355, S714 / S724 и S408 / S436 / S481. Стрелки указывают фосфо-аддуцин, совместно локализованный с разобранными саркомерами.Стрелки указывают на совместную локализацию с собранными саркомерами. B. Эндогенная экспрессия фосфоаддуцина T445 в NRVM, окрашенная α-актинином (красный), антифосфоаддуцином pT445 (зеленый) и DAPI. Фосфо-аддуцин перемещается из ядра в цитоплазму во время митоза. C. (вверху): исследование WB уровня экспрессии эндогенного фосфо-T445. (Внизу) Количественная оценка уровня экспрессии pT445 относительно уровня экспрессии ADD1. D. Избыточная экспрессия аддуцина фосфо- или нефосфомиметика T445 / T480 в NRVM, индуцированная AAV6.(Вверху слева). Схематическая диаграмма челночного вектора AAV показывает, что мутанты аддуцина экспрессируются 3 тандемными эпитопами FLAG в рамке считывания на N-конце. (Внизу слева) Иммунофлуоресцентное окрашивание антителом к ​​α-актинину для выявления саркомерной структуры. Мутанты аддуцина выявляются антителами Flag в зеленом цвете. Справа показаны изображения репрезентативной области с большим увеличением (белый прямоугольник). Пунктирные линии были нарисованы вокруг границы камеры. (Справа) Количественный анализ разобранных саркомеров, индуцированных сверхэкспрессией аддуцина.Масштабная полоса = 10 мкм. E. (вверху). Схемы, демонстрирующие стратегию создания кардиоспецифического индуцибельного отдельного трансгенного фосфора Add1 i1 (p-TRE T445E / T480E, α-MHC tTA). (Внизу слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных трансгенных фосфатов Add1 i1. Масштабная линейка = 1 мм. (Внизу справа) Отношение массы сердца к массе тела у контрольных и кардиоспецифичных фосфо-одиночных трансгенных животных. F. (вверху) Изображения, демонстрирующие паттерн экспрессии трансгенного фосфо-Add1i2 на P14 и P28. (Внизу) Изображения с большим увеличением селективных кардиомиоцитов, имитирующих гиперэкспрессию фосфо-аддуцина.На P14 мы видели фосфо-мимические экспрессии как в цитоплазме, так и на мембране (внизу слева). На P28 фосфо-мимический аддуцин экспрессируется на мембране и в ядре (внизу справа). Масштабная линейка = 10 мкм. G. (слева) Репрезентативные изображения, показывающие образец саркомера трансгенного фосфо-ADD1 i1 на P14 и P28. Вставки представляют собой изображения одиночного кардиомиоцита с большим увеличением. Пунктирными линиями проведены по внешнему и внутреннему краям кардиомиоцитов. (Справа) Количественный график, показывающий разборку саркомера.Оценки разборки определяли так же, как и у трансгенного Add1i2 на фиг. 2F. Масштабная линейка = 10 мкм. Масштабная линейка = 10 мкм. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t . Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t .

    Чтобы определить, влияет ли избыточная экспрессия фосфорилированного аддуцина в кардиомиоцитах на разборку саркомера, мы сконструировали серию мутантов аддуцина, имитирующих фосфорилированный и нефосфорилированный аддуцин посредством сайт-направленного мутагенеза (фосфо-мимического и фосфо-молчащего).Замена на Glu имитирует форму фосфорилирования аддуцина, в то время как мутация на Ala имитирует нефосфорилированную форму. В конструкции дополнительно упаковывали вспомогательную плазмиду для создания рекомбинантного вируса AAV6. Морфологию саркомера исследовали путем окрашивания антителом к ​​α-актинину и совместной локализации с FLAG-положительными клетками. Наши результаты демонстрируют, что почти 60% Add1-положительных кардиомиоцитов с фосфомиметической сверхэкспрессией (T445E / T480E) демонстрируют полную разборку саркомера по сравнению с кардиомиоцитами, инфицированными фосфо-молчащей формой (T445A / 480A), что в основном индуцировало частичную разборку саркомера (рис.3D). Мы также создали фосфо-мимические и фосфо-молчащие мутанты фосфо-сайтов S12 / S355 и S714 / S724. Заражение NRVM AAV6, несущим эти фосфомутанты, не показало значительного увеличения полной разборки саркомера (рис. S2B и S2C), хотя фосфо-молчащая форма S714 / S724 действительно показала более высокие показатели полной разборки по сравнению с фосфо-мутантами. мимическая форма. Поэтому мы сосредоточились на фосфо-сайтах T445 / T480, чтобы изучить их роль в разборке саркомеров.

    Чтобы определить, может ли форсированная экспрессия конститутивно активной мембраносвязанной формы Add1 вызывать разборку саркомера in vivo, , мы создали индуцибельную линию трансгенных (TG) мышей pTRE-T445E / T480E, в которой фосфоизоформа аддуцин избирательно экспрессируется в кардиомиоцитах только после скрещивания с мышью αMHC-tTA и отмены доксициклина (Tet-off) (рис.3E). Трансгенные животные не показали значительных изменений в размере сердца или HW / BW на P28 (рис. 3E). Подобно вышеупомянутой одиночной трансгенной линии Add1 i2, мы обнаружили, что кардиомиоциты, положительные по фосфоаддуцину, имели неоднородный паттерн экспрессии, и мы наблюдали снижение экспрессии от P14 до P28 (фиг. 3F, вверху). Дальнейшее изучение саркомерного паттерна в фосфо-мимических положительных кардиомиоцитах показало цитоплазматическую экспрессию аддуцина с разборкой саркомера на P14, которая не сохранялась до кардиомиоцитов P28, которые показали нормальные саркомерные структуры (рис.3F внизу). Оценка разборки подтвердила, что хотя кардиомиоциты были разобраны на P14, они имели нормальную морфологию на P28 (рис. 3G), что напоминает паттерн, который мы отметили ранее с Add1i2 TG (рис. 2F). Это указывает на то, что избыточная экспрессия Add1 i2 или фосфомиметика Add1 i1 помогает расширить окно разборки саркомера, но не поддерживает этот паттерн до взрослого возраста. Хотя мы обнаружили сигналы ph4 в сердцах на P14, существенной разницы по сравнению с контролем нет (рис.S3A). Размер кардиомиоцитов также не отличается на P14 (рис. S3B).

    Для стабилизации белка требуется сопутствующая экспрессия α- и γ-аддуцинов

    Предыдущие отчеты в основном были сосредоточены на α-аддуцине, прежде всего потому, что он считается ограничивающим фактором в образовании гетеродимера с γ- или β-аддуцином или даже с α-аддуцином. гомодимер сам с собой 43 . Подтверждение этому представлению исходит из элегантных исследований на моделях Add1 KO, которые предположили, что делеция α-аддуцина приводит к значительному снижению экспрессии γ-аддуцина.Однако в наших исследованиях невозможность разобрать саркомер в обоих одиночных Add1 TG после P14 поднимает важный вопрос: нужен ли γ-аддуцин для функции α-аддуцина in vivo? В наших исследованиях профиль эндогенной экспрессии аддуцинов показал, что экспрессия γ-аддуцина становится незначительной на P14 (рис. 1E). Это может указывать на то, что одиночные линии TG Add1 теряют способность разбирать саркомеры за пределами P14 вторично по отношению к возрастной потере Add3. Чтобы оценить стабильность Add1 по отношению к Add3, мы провели трансфекцию in vitro с помощью Add1 var.1 и вар. 2 при наличии или отсутствии Add3. Чтобы избежать перекрестной реакции антител к аддуцину между α-аддуцином и γ-аддуцином, мы трансфицировали клетки вариантами Add1 с тремя тандемными тегами FLAG на N-конце и / или плазмидами Add3 с тремя тандемными тегами TY1 на N-конце. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом (CHX) для ингибирования трансляции белка. Мы собирали клетки в нескольких временных точках после обработки и исследовали уровни белка с помощью WB. Интересно, что мы обнаружили, что как α-аддуцин i1, так и i2 становятся нестабильными после обработки CHX в отсутствие γ-аддуцина.Однако в присутствии γ-аддуцина стабильность изоформ α-аддуцина 1 и 2 значительно повышалась. (Рис. 4A). Этот результат указывает на то, что неспособность отдельных трансгенных линий вызывать выраженную разборку за пределами P14 может быть связана с отсутствием эндогенного γ-аддуцина в более поздние моменты времени.

    Рисунок 4. Совместная экспрессия изоформы 2 Add1 вместе с Add3 повышает стабильность аддуцина.

    A. Клетки HEK293T подвергали трансфекции варианта 1 (p-3xFlag-Add1i1) и варианта 2 Add1 (p-3xFlag-Add1i2) в присутствии или в отсутствие Add3 (p-3xTy1-Add3).Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом (CHX) для ингибирования трансляции белка. Клетки собирали через 0, 24 и 48 часов после обработки. (Слева) WB для отображения уровня белка. (Справа) Измерение относительного уровня белка ADD1i1 или Add1i2 (рассчитанного как FLAG по сравнению с GAPDH) в отсутствие или в присутствии ADD3. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием одностороннего критерия t . Б. Схематическая диаграмма, показывающая конструкции для создания двойных трансгенных Add1 i2 и Add3. Обе экспрессионные конструкции управлялись промотором α-MHC. C. Результаты QPCR, показывающие уровень мРНК Add1i2 у двухмесячных двойных трансгенных животных с низкой экспрессией. D. (слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных клеток Add1 i2 / Add3 с низкой экспрессией. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. (Справа) Соотношение массы сердца к массе тела у WT и двойных трансгенных животных с низкой экспрессией. E. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у двухмесячных двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 (низкая экспрессия). n = 3 для каждой группы. F. Продольные виды, демонстрирующие структуру саркомеров двухмесячного дикого животного и двойного трансгенного аддуцина (низкая экспрессия). Изображения с большим увеличением области в рамке на изображении с низким увеличением показаны справа. Пунктирными линиями обозначена граница, на которой экспрессируется аддуцин. На вставке показаны саркомеры в частично разобранном виде (неорганизованные, но не отсутствующие саркомеры).Соответствующая экспрессия аддуцина указана стрелками. Масштабная линейка = 10 мкм. G. QPCR, чтобы показать уровень мРНК Add1i2 у двухмесячных двойных трансгенных животных с высокой экспрессией. H. (Слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных клеток Add1 i2 / Add3 с низкой экспрессией. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. (Справа) Соотношение массы сердца к массе тела у WT и двойных трансгенных животных с высокой экспрессией. I. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 в возрасте 1 месяца (высокая экспрессия).(n = 3 для каждой группы). J. (вверху) Репрезентативные изображения, демонстрирующие паттерн саркомеров у двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 возрастом 1 месяц (высокая экспрессия). (Внизу) Увеличенные изображения Вставки из панелей сверху. K. (слева) Двойной трансгенный ADD1 i2 / ADD3 с высокой экспрессией имеет свидетельства фрагментации кардиомиоцитов. (Справа) Большое увеличение области слева. Стрелки указывают на фрагменты саркомера, в которых совместно локализованы ADD1 и TNNT2. Масштабная линейка = 10 мкм. Масштабная линейка = 10 мкм.Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t .

    Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали кардиоспецифичную линию двойных трансгенных (dTG) мышей, коэкспрессирующих ген Add1 варианта 2 и ген Add3. Эта линия была получена путем инъекции двух независимых кассет экспрессии вместе (фиг. 4B). Из 35 учредителей 11 были положительными dTG. Иммуноокрашивание с помощью Add1 и Add3 подтвердило, что как α-, так и γ-аддуцин экспрессируются и совместно локализуются в кардиомиоцитах (рис.S4A). Основываясь на результатах qPCR уровней экспрессии Add1 i2, мы разделили линии на две группы в зависимости от уровня экспрессии (рис. 4C). Здесь важно отметить, что уровни эндогенной экспрессии Add1i2 на исходном уровне не обнаруживаются после P14, поэтому трансгенные линии показывают высокий уровень относительной экспрессии мРНК в сравнении.

    Сначала мы исследовали линии с более низким уровнем экспрессии (dTG-L). Мы обнаружили, что морфология сердца и HW / BW в 2-месячном возрасте были аналогичны WT (рис.4D - репрезентативная нижняя линия выражения). Однако систолическая функция ЛЖ у мышей dTG-L была немного ниже, чем у WT (рис. 4E). Интересно, что мы обнаружили, что саркомерные структуры демонстрировали частичную разборку в кардиомиоцитах, если аддуцин был сверхэкспрессирован (Рис. 4F). Эта морфология выглядела как дезорганизованные саркомеры без четких полос (рис. 4F). Однако мы не наблюдали классической схемы разборки саркомера с зазором саркомера. Затем мы исследовали фенотип группы с высокой экспрессией аддуцина (dTG-H).Уровень мРНК группы с высокой экспрессией dTG-H был примерно в 1,6 раза выше, чем в группе с низкой экспрессией (фиг. 4G-репрезентативная линия с более высокой экспрессией). Срезы сердца с dTG-H в возрасте двух месяцев показали расширение желудочков (рис. 4H, слева) и увеличенное соотношение HW / BW (рис. 4H, справа). Эхокардиография показала заметно сниженную систолическую функцию ЛЖ с фракцией выброса левого желудочка (ФВЛЖ) 56% (рис. 4I). Мы наблюдали некоторую частичную разборку с фокальной локализацией TNNT2 на вставленном диске (рис.4J), хотя некоторые миоциты не демонстрировали значительной дезорганизации саркомеров (нижний ряд рис. 4J). Мы также наблюдали разрушение и фрагментацию кардиомиоцитов, что свидетельствует об увеличении гибели клеток (рис. 4K). что было дополнительно подтверждено тестом TdT-опосредованного мечения ник-концов dUTP (TUNEL) (рис. S4B). Затем мы оценили размер кардиомиоцитов с помощью окрашивания WGA и обнаружили, что dTG-H имеет значительно высокий процент малых кардиомиоцитов, более низкий процент кардиомиоцитов среднего размера и аналогичный процент крупных кардиомиоцитов (рис.S4C). Эти результаты показывают, что сопутствующая экспрессия Add3 и Add1 стабилизирует аддуциновый комплекс, и что как dTG-L, так и dTG-H демонстрируют частичную разборку саркомера, при этом dTG-H демонстрирует доказательства широко распространенной гибели кардиомиоцитов и подавления функции ЛЖ.

    Генерация Add1 / Add3 фосфо-аддуцина с двойной трансгенной мышью Модель

    Как отмечалось ранее, фосфо-одиночный TG T445E / T480E демонстрирует разрушение саркомера в сердце новорожденного, но не во взрослом сердце (рис. 3G), вероятно, из-за отсутствия Выражение Add3 во взрослом сердце.Учитывая улучшенную разборку кардиомиоцитов новорожденных с форсированной экспрессией фосфо-T445E / T480E, мы интегрировали дизайн фосфомиметического трансгенного с Add1i2 / Add3 dTG для создания нового кардиоспецифичного двойного трансгена, который коэкспрессирует фосфомиметик Add1 i2 T445E / T480E и WT Add3 (p-dTG) (рис. 5A вверху). Окрашивание H&E сердец этих мышей продемонстрировало, что взрослые сердца p-dTG больше, чем WT (фиг. 5A внизу), что было подтверждено измерением HW / BW (фиг. 5B). ФВЛЖ была умеренно снижена у двухмесячных мышей, но не претерпела значительных изменений у более молодых мышей (рис.5С). Изучение уровня мРНК аддуцина с помощью кПЦР подтвердило повышенный уровень экспрессии pAdd1i2 по сравнению с данными WT (фиг. 5D). Иммуноокрашивание Add1 и Add3 подтвердило, что как α-, так и γ-аддуцин экспрессируются и совместно локализуются в цитоплазме кардиомиоцитов (рис. S5A). Затем мы исследовали структуру саркомера путем окрашивания тропонином на P7, P14, P21 и через 2 месяца. Результаты демонстрируют, что кардиомиоциты p-dTG демонстрируют разобранные саркомеры, которые были очевидны во все моменты времени (рис. 5E I, ii, iii и iv), хотя разборка кажется более выраженной на ранних стадиях новорожденности.Фактически, большинство взрослых кардиомиоцитов демонстрировали частичную разборку, которая, по-видимому, была локализована в зоне, окружающей ядра и на периферии кардиомиоцитов, с полным очищением саркомеров в этих зонах. Исследование митотических маркеров кардиомиоцитов этих сердец показало увеличение количества кардиомиоцитов, положительных по киназе ph4 и aurora B, как на P21, так и через 2 месяца (рис. S5B и C), без изменения размера клеток (рис. S5D) или нуклеации (рис. . S5E).

    Рисунок 5. Фосфомимический двойной трансгенный продукт способствует разборке саркомера.

    A. (вверху) Схематическая диаграмма конструкций для создания двойных трансгенных фосфомиметиков Add1 i2 и Add3. Замена Glu на T445 и T480 имитирует фосфорилированную форму Add1 i2. Обе экспрессионные конструкции управлялись промотором α-MHC. (Внизу) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных фосфо-Add1 i2 / Add3. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. B. Отношение массы сердца к массе тела у WT и фосфо-двойных трансгенных животных на P21 день и 2 месяца.(n = 3 для P21 и n = 5 в течение 2 месяцев). C. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у P21 и двухмесячных двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 (низкая экспрессия). (n = 3 для P21 и n = 5 в течение 2 месяцев). D. QPCR уровня мРНК Add1i2 у двухмесячных фосфо-двойных трансгенных клеток. E. Саркомерный паттерн двойных фосфо-трансгенных трансгенных клеток в точках P7 (i), P14 (ii), P21 (iii) и в возрасте 2 месяцев (iv). Изображения с большим увеличением области в рамке показаны справа от уменьшенного изображения.Пунктирные линии обводят границу, где аддуцин выражается вне саркомеров. Стрелки относятся к регионам с высоким уровнем экспрессии аддуцина. Обратите внимание на очистку саркомеров, в которых экспрессируется аддуцин. Масштабная линейка = 10 мкм. F. Крупномасштабный скрининговый анализ киназ выявил 7 кандидатов, которые потенциально фосфорилируют сайты T445 (слева) и T480 (справа). Скорректированные значения активности киназы (исходное значение минус образец пептидного фона, в имп / мин) с образцом пептида при одной концентрации в анализах пептидкиназы 245 Ser / Thr.Синий: киназа с образцом пептида; желтый: активность киназы без образца пептида. G. Анализ совпадения серин / треониновых киназ для проверки 3 киназ, NEK1, DCAM1 и IRAK4, выбранных из начального скринингового анализа киназ. Каждую киназу тестировали при трех концентрациях в трех повторностях. Эти результаты предполагают, что все киназы NEK1, DCAMKL2, IRAK4 демонстрируют зависящую от концентрации способность фосфорилировать образец пептида «T445» и «T480». H. Подтверждение паттерна эндогенной экспрессии IRAK4 (слева) и NEK1 (справа) в регенерирующем сердце новорожденных.Положительные сигналы обозначены стрелкой. I. (вверху) Схема кассет экспрессии IRAK4 в конструкциях AAV6. Сверхэкспрессия IRAK4 (зеленый) в NRVM вызывает разборку саркомера (окрашенного α-актинином, красный цвет) (i) и аддуцина pT445 (окрашенного pT445, красный цвет), перемещаемого из ядра в цитоплазму (ii). Стрелки указывают на то, что аддуцин экспрессируется в ядрах IRAK4-отрицательных клеток. Масштабная линейка = 10 мкм. J. (вверху слева) Схема кассет экспрессии IRAK4 в конструкциях AAV9. (Вверху справа) Схематическое изображение экспериментальной конструкции.(Внизу) AAV9-IRAK4-GFP вводили детенышам CD1 на P1, а сердца собирали на P15 для разделения и окрашивания. Сверхэкспрессия IRAK4 вызвала сильную разборку саркомеров (i) в кардиомиоцитах по сравнению с контролем из однопометников (ii).

    Идентификация киназ, которые опосредуют фосфорилирование аддуцина в кардиомиоцитах

    Учитывая критическую роль, которую фосфорилирование T445 / T480 играет в разборке саркомера, мы попытались определить механизм этого события фосфорилирования. Чтобы идентифицировать киназы, которые опосредуют фосфорилирование ассоциированных с мембраной сайтов T445 и T480, мы выполнили анализ киназного скрининга 245 киназ на фосфо-сайты T445 и T480.Первоначальный скрининг выявил семь потенциальных киназ с относительно высокими значениями активности по сравнению с фоном для фосфо-сайта T450 (таблица S1, фиг. 5F слева). Пептид T480 показал значительный ответ только на киназу VRK1 (рис. 5F справа). Затем мы выполнили вторичный скрининг для основных совпадений, описанных выше, с использованием анализа зависимости реакции от дозы HitConfirmation ™. Эти исследования подтвердили активность только трех киназ, а именно киназы 1, связанной с NIMA (NEK1), киназы 4, связанной с рецептором интерлейкина 1 (IRAK4), а также даблкортин-подобной и CAM-киназы 2 (DCAMKL2), которые проявляют зависимое от концентрации фосфорилирование T445. фосфозит (рис.5G). Эти киназы также показали увеличение доза-ответ на T480, хотя это оказалось менее заметным, чем у пептида T445. Эндогенное окрашивание кандидатов в киназы на сердце P4 подтвердило, что как IRAK4, так и NEK1 продемонстрировали четкую совместную локализацию с разобранными саркомерами (фиг. 5H).

    Чтобы определить роль IRAK4 в индукции разборки саркомеров, мы создали конструкции IRAK4-AAV6 для сверхэкспрессии IRAK4 в кардиомиоцитах новорожденных in vitro. Интересно, что сверхэкспрессия IRAK4 привела к разборке саркомера (рис.5I, верхняя панель), что было связано с экспрессией фосфорилированного аддуцина pT445 в цитоплазме IRAK4-положительных клеток (нижняя панель). В IRAK4-отрицательных клетках аддуцин экспрессировался только в ядре (рис. 5I, нижняя панель со стрелками). Сверхэкспрессия NEK1 в NRVM не оказывала какого-либо явного эффекта на саркомеры или фосфорилирование аддуцина (данные не показаны).

    Для оценки структурных изменений саркомера при сверхэкспрессии IRAK4 in vivo, мы создали вирус AAV9-IRAK4.Мы вводили этот вирус в сердца новорожденных мышей в точке P1 и собирали сердца в точке P15, момент времени, значительно превышающий выход из клеточного цикла кардиомиоцитов новорожденных. Иммуноокрашивание срезов сердца продемонстрировало, что клетки со сверхэкспрессией IRAK4 демонстрировали заметную разборку саркомеров (фиг. 5J). Эти результаты показывают, что IRAK4 фосфорилирует аддуцин in vitro и in vivo и вызывает разборку саркомера. В совокупности наши результаты идентифицируют гетеродимер аддуцина в качестве важного регулятора разборки саркомера кардиомиоцитов во время митоза кардиомиоцитов

    Идентификация партнеров по связыванию комплекса аддуцина в регенеративных и нерегенеративных точках времени

    Наши результаты до сих пор предполагают, что фосфорилированный гетеродимер аддуцина опосредует разборку реоцитомии кардиомиоцитов. .Однако, учитывая, что аддуцины ранее не исследовались на сократительных клетках, партнеры связывания аддуцина в кардиомиоцитах неизвестны. Чтобы идентифицировать белки, которые взаимодействуют с аддуцином в кардиомиоцитах, мы выполнили MS-анализ экстрактов сердечных белков P1 и P7 с использованием антитела ADD1 в качестве приманки (стратегия, аналогичная фигуре 1A, но с использованием антитела ADD1 вместо антитела Tnnt2). Мы обнаружили, что многочисленные мишени, которые были идентифицированы при начальном анализе Tnnt2 с понижением, также были обнаружены с помощью α-аддуцина (рис.6A), предполагая, что α-аддуцин связывается с саркомерными белками в раннем постнатальном сердце.

    Рисунок 6. Анализ Co-IP / MS с очищенным комплексом аддуцина.

    A. В таблице перечислены выбранные белки, ассоциированные с ADD1, идентифицированные с помощью Co-IP / MS. * PSM: соответствие пептидного спектра. Количество спектров, присвоенных пептидам, которые способствовали заключению о белке. ** MIC Sin: нормализованная статистика спектрального индекса для белка для конкретной группы. Рассчитывается по интенсивности ионов фрагментов в каждом спектре, относящемся к конкретному белку.*** Соотношение: количественное соотношение белка между группами, полученное на основе значения MIC Sin. Масштабная линейка = 10 мкм. Б . Схема процесса очистки коротких и длинных комплексов аддуцинов. C. Схематический чертеж показывает блок-схему Co-IP / MS с помощью раскрывающегося списка очищенного комплекса аддуцина D. Гистограмма для канонических путей, обогащенных каждым образцом. Ось X показывает преобразованное скорректированное значение p (процедура Бенджамини-Хохберга) перекрытия между белками образца и путями.FDR относится к уровню ложного обнаружения. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t . E. Сетевой график белков цитоскелета из анализа методом pull down взаимодействует с adducin_long или adducin_short в разные моменты времени (P1 и P21). Различная цветовая маркировка, выделяющая общие и уникальные белки среди групп образцов. Красный цвет представляет четыре группы образцов в выпадающем анализе. Желтым цветом обозначены белки, общие для всех групп.Зеленый цвет обозначает белки, общие только для двух или трех групп. Синий представляет белки, уникальные для каждой группы. F. Анализ близости лигирования (PLA) для изучения прямого взаимодействия между аддуцином (pT445) и саркомерными белками (α-актинин 2) в ткани сердца P4. Красные точки (стрелки) - это флуоресцентные сигналы, указывающие на тесное взаимодействие между двумя антигенами. Образцы включают взаимодействие между α-актинином и тропонином Т (в качестве положительного контроля) или фосфо-аддуцином (pT445) и α-актинином. Масштабная линейка = 10 мкм. G. Иммуно-ЭМ изображение, показывающее субклеточное расположение фосфо-аддуцина в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами в сердцах новорожденных после ИМ на 3-й день после операции. Два красных прямоугольника на левом изображении увеличены справа. (i) аддуцин локализован на z-дисках. (ii) фосфо-аддуцин в значительной степени локализован на z-дисках, связанных с плазматической мембраной в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами. Красные стрелки указывают местонахождение аддуцина.

    Поскольку аддуцин действует как дуплекс (α / y в кардиомиоцитах), использование антитела ADD1 в качестве приманки может не повторить его характер связывания.Кроме того, хотя вышеупомянутое исследование на основе антител может работать в сердце новорожденного, отсутствие значимой экспрессии аддуцина в сердце взрослого человека не позволяет провести это исследование у взрослых. Чтобы лучше понять, почему даже в dTG-сердцах разборка сердец, по-видимому, более выражена у новорожденных по сравнению с кардиомиоцитами взрослых, мы провели исследование с использованием очищенного комплекса α / γ-аддуцина в качестве приманки с экстрактами сердца P1 или P21. Мы клонировали оба гена Add1 и Add3 в плазмиду pETDuet, которая совместно экспрессирует две ORF вместе и естественным образом образует дуплекс в клетках.6xHis-метку клонировали на N-конце Add1 для облегчения очистки и анализа с пониженным содержанием. Чтобы определить, связывает ли длинная (ADD1i1 / ADD3) и короткая (ADD1 i2 / ADD3) формы аддуцина саркомерные белки по-разному во время регенеративного окна по сравнению с более поздними временными точками, мы создали две плазмиды для ко-экспрессии ADD1i1 / ADD3 (длинная форма) или ADD1i2 / ADD3 (краткая форма) соответственно. Очищенные белки инкубировали с лизатами сердца в течение ночи, затем связывали с гранулами Ni-NTA, чтобы аддуцин и связанные белки могли прикрепиться к смоле.Мы также включили отрицательный контроль, в котором лизаты сердца были смешаны с гранулами Ni-NTA. Фиг. 6B и представляют собой схемы очистки белка и Co-IP с использованием очищенного белкового комплекса в качестве приманки. Затем образцы и соответствующие им контроли анализировали масс-спектрометрией в форме log2 (образец / контроль) для расчета кратного изменения. Изменения складок более 1,5 учитывались для дальнейшего анализа пути изобретательности. Фиг.6D представляет собой гистограмму статистически значимых канонических путей, обогащенных образцом.Интересно, что единственный путь с усиленной регуляцией на P1 по сравнению с P21 - это сигнальный путь актинового цитоскелета (два других пути, связанных с митохондриями, были подавлены на P1 по сравнению с P21). Мы также создали сетевой график, чтобы показать, как белки сигнального пути цитоскелета взаимодействуют с длинными или короткими аддуцинами в разные постнатальные моменты времени (P1 и P21) (рис. 6E). Мы также обнаружили, что как длинная, так и короткая формы аддуцина связывают исключительно специфические саркомерные белки в сердце P1, но не в P21.В частности, мы обнаружили, что комплекс аддуцина связывает сердечный актинин (ACTN2) только в сердце P1, но не в сердце P21. Оглядываясь назад, возможно, это не должно было вызывать удивления, учитывая, что актинины являются каркасными белками, которые принадлежат к суперсемейству спектринов 44 , а спектрин является известным партнером по связыванию аддуцинов в неконтрактильных клетках. В кардиомиоцитах альфа-актинин локализован на Z-дисках, где он важен для регуляции саркомерной организации актина и сборки саркомера.Следовательно, потенциальное взаимодействие между аддуцином и альфа-актинином может быть механизмом разборки саркомера во время митоза кардиомиоцитов. Чтобы оценить взаимодействие между аддуцином и α-актинином2, мы провели анализ лигирования методом близости (PLA) (Duolink®, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) (рис. 6F) с использованием антитела против фосфо T445 в сердце новорожденного. В качестве положительного контроля мы использовали связывание TNNT2 с α-актинином 2 в анализе PLA. Или результаты показывают, что аддуцин pT445 больше ассоциирует с ACTN2 in vivo в сердце новорожденного.Кроме того, мы использовали электронную микроскопию Immunogold (Immuno-EM) для определения субклеточной локализации аддуцина pT445 в неонатальных кардиомиоцитах с разобранными саркомерами, что продемонстрировало, что аддуцин локализован на z-дисках саркомеров (где также находится альфа-актинин). локализованный) (рис. 6 Ги). Аддуцин pT445 также, по-видимому, связан с разобранными саркомерами в клеточной коре в ассоциации с плазматической мембраной (рис. 6Gii).

    Обсуждение

    В последние годы многочисленные исследования выявили механизмы регуляции клеточного цикла кардиомиоцитов.Эти механизмы включают различные пути, включая прямые регуляторы клеточного цикла, факторы транскрипции, микро-РНК, Lnc-РНК, а также немиоцитарные факторы, включая, среди прочего, внеклеточные матричные, иммунологические факторы и факторы окружающей среды. Однако специфические для поперечно-полосатых мышц механизмы, которые регулируют организацию саркомеров во время митоза кардиомиоцитов, остаются плохо изученными. В текущем отчете мы демонстрируем, что белок цитоскелета аддуцин регулирует разборку саркомеров во время митоза кардиомиоцитов.В неконтрактильных клетках предыдущие исследования идентифицировали механизмы, которые регулируют сборку цитоскелета и димеризацию актиновых листов. Напр., Цитоскелетный регуляторный белок аддуцин является основным регулятором связывания актина и взаимодействия актин-спектрин 29,30 . Семейство аддуцинов состоит из 3 членов, а именно α-, β- или γ-аддуцинов. Полностью собранный аддуцин состоит из гетеродимеров гомологичных альфа- и бета- или гамма-субъединиц. Несмотря на известную роль аддуцина в сборке актина в неконтрактильных клетках, его роль в сократительных клетках полностью неизвестна.

    Наши результаты основаны на протеомном скрининге белков, которые дифференциально связываются с TNNT2 в момент ранней регенерации сердца новорожденной мыши. Хотя некоторые белки цитоскелета, по-видимому, по-разному связаны с TNNT2 в этот ранний момент времени, мы сосредоточились на аддуцине, учитывая его известную регулирующую роль цитоскелета в неконтрактильных клетках. Мы приводим несколько линий доказательств, подтверждающих связь аддуцина с саркомерными белками; Во-первых, иммуноокрашивание демонстрирует, что α-аддуцин локализован в цитоплазме и мембране только в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами.Во-вторых, CoIP с использованием антитела ADD1 или очищенного комплекса α / γ-аддуцина предполагает возможную ассоциацию аддуцина с саркомерными белками, в частности α-актинином. В-третьих, мы идентифицировали ассоциированную с мембраной фосфо-изоформу Add1, которая связывает α-актинин с помощью пробы лигирования близости и колокализуется с ассоциированными с мембраной саркомерами с помощью иммуно-электронной микроскопии, меченных частицами нанозолота. Эти результаты показывают, что Add1 является цитоскелетным белком, связанным с саркомером, в кардиомиоцитах.

    Важно отметить увеличение функциональных исследований in vitro и in vivo, чтобы продемонстрировать, что форсированная экспрессия аддуцина вызывает разборку саркомера.Мы показали, что экспрессия нескольких изоформ аддуцина вызывает разборку саркомеров в первичных неонатальных кардиомиоцитах в культуре. Кроме того, как одиночный фосфомиметик TG Add1 i2, так и Add1 i1 обнаруживают негомогенный паттерн экспрессии, который приводит к расширению окна разборки саркомера до P14, но не до зрелого возраста. Анализы стабильности белков продемонстрировали, что совместная экспрессия Add1 или Add3 необходима для стабильности обоих белков, и это было подтверждено in vivo на линиях dTG, которые демонстрировали стабильную экспрессию в зрелом возрасте.Мы также демонстрируем, что хотя нефосфомимические линии dTG демонстрируют стойкую экспрессию аддуцина, это не привело к выраженной разборке саркомера, в то время как та же самая конструкция dTG с конститутивно активным фосфомимиком T445 / T480 привела к разборке саркомера, которая сохранялась до взрослой жизни.

    Одним из важных ограничений текущих результатов является неполная разборка, которую мы наблюдали во взрослых кардиомиоцитах даже в фосфо-мимических dTG. Хотя мы отметили полную разборку в раннем постнатальном периоде, большинство взрослых кардиомиоцитов демонстрировали частичную разборку, которая, по-видимому, локализовалась в зоне, окружающей ядра, и на периферии кардиомиоцитов с полным очищением саркомеров в этих зонах.Эта частичная разборка, вероятно, объясняет отсутствие заметного снижения систолической функции ЛЖ в этой линии ТГ. Механизм этого дифференциального эффекта аддуцина на раннем постнатальном периоде по сравнению со взрослыми саркомерами неясен, но может быть связан с изменениями фенотипа саркомеров с возрастом. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали очищенный белковый комплекс альфа (короткая или длинная изоформа) -гамма-аддуцин для выявления партнеров по связыванию в сердце ранних новорожденных и подростков. Результаты демонстрируют, что комплекс аддуцина по-разному связывается с белками цитоскелета в зависимости от постнатального возраста.В частности, как короткие, так и длинные формы комплекса аддуцина, по-видимому, избирательно связываются со специфическим для сердца α-актинином (ACTN2) в сердце P1, но не в сердце P21. PLA и иммуноголд-EM подтверждают мнение, что аддуцин ассоциируется с α-актинином в z-дисках. Хотя ранее не было показано, что аддуцин связывает α-актинин, α-актинин принадлежит к суперсемейству спектринов, и спектрин является известным партнером по связыванию аддуцина в неконтрактильных клетках. Учитывая известную роль α-актинина в прикреплении актина к z-дискам кардиомиоцитов, будущие исследования должны изучить потенциальную роль α-актинина в регуляции разборки саркомера ниже аддуцина.В совокупности эти результаты идентифицируют важный регуляторный механизм разборки саркомеров, который связывает организацию цитоскелета с регуляцией клеточного цикла в кардиомиоцитах млекопитающих и дает представление о проблемах митоза в активно сократительных клетках.

    МЕТОДЫ

    Экспериментальные животные

    Все протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Юго-западного медицинского центра Техасского университета. Во всех экспериментах использовались как самцы, так и самки мышей, чтобы гарантировать соответствие возраста и пола.Здоровых мышей выбирали случайным образом из колонии для всех экспериментов. Мышей CD1 использовали для гистологических исследований дикого типа с окрашиванием и инъекциями AAV9. Количество животных, используемых для каждого эксперимента, составляло от 3 до 5.

    Коиммунопреципитация (Co-IP) и масс-спектроскопия (MS)

    Мышиные сердца в двух разных точках времени регенерации (n = 3 для каждой), через 3 дня после Инфаркт миокарда (MI) на P1 (P1MI) и через 3 дня после MI на P7 (P7MI) собирали и лизировали в буфере для лизиса IP: 2.5 мМ Трис, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40, 5% глицерин. Комбинация ингибиторов протеиназы и ингибиторов фосфатазы включалась постоянно. 5 мкг мышиного моноклонального антитела TNNT2 (Thermo Scientific) использовали для связывания с 1 мг переваренных образцов сердца при осторожном покачивании при 4 ° C в течение ночи. К смеси добавляли гранулы агарозы с белком A (Calbiochem) и продолжали инкубацию при осторожном покачивании в течение 3 часов при 4 ° C. После микроцентрифугирования в течение 30 секунд при 4 ° C осадки пять раз промывали 1 мл буфера для лизиса IP.Конечные осадки ресуспендировали в 25 мкл буфера для образцов 2XSDS и наносили на гель SDS-PAGE (4-20%). Когда образцы входили в растворяющийся гель примерно на 5-10 мм, анализ останавливали и гель окрашивали кумасси синим. Окрашенную область разрезали и нарезали кубиками размером 1 мм. Затем образцы подвергали масс-спектрометрическому анализу для идентификации белка. Ко-IP с антителом к ​​аддуцину (H-10, номер по каталогу sc-25731 Santa Cruz) проводили с использованием того же протокола.

    Гистология и иммуноокрашивание

    Ткани сердца фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) / PBS в течение ночи при комнатной температуре, а затем обрабатывали либо для парафина, либо для криогенной заливки.Окрашивание H&E проводили в соответствии со стандартными процедурами в центре гистологии ядра UTSW на парафиновых срезах. Для криозакрепления фиксированные ткани инкубировали в 30% сахарозе / PBS при 4 ° C до погружения тканей. Ткани помещали в замораживающую среду, замораживали при -80 ° C и готовили для криосрезов. Иммуноокрашивание проводили согласно предыдущему описанию 45 . Вкратце, после извлечения антигена срезы пермеабилизировали и блокировали 10% сывороткой / 0,3% Triton-X100 / PBS в течение 20 минут при комнатной температуре.Затем образцы инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами. Разведения первичных антител и вторичных антител (ThermoFisher) при инкубации варьировались в зависимости от экспериментов. После промывки PBS срезы окрашивали DAPI (ThermoFisher D1306) и устанавливали с помощью VECTASHIELD (Vector Laboratories h2700) для визуализации.

    Антитела

    Первичные антитела: антитела к тропонину T, сердечная изоформа Ab-1, клон 13-11 (Thermo Scientific MS-295-P1, 1: 100), антисаркомерный α-актинин (Abcam ab68167), анти- фосфогистон h4 Ser10 (Millipore 06-570, 1: 100), антитело против α-аддуцина (1B1, банк гибридом исследований развития, 1:50, для рисунка 1F), антитело против α-спектрина (3A9, гибридома исследований развития Банк, 1:50, для Фигуры 1F), антитело против Филамина 1 (E-3, sc-17749, Санта-Крус, 1: 100, для Фигуры 1F), антитело против α-аддуцина (фосфо T445) (Santa Cruz sc16738 , для WB и окрашивания, 1: 100), N-концевое антитело против α-аддуцина (Abcam ab151474, для Add1i2 WB и TG), антитело против α-аддуцина (Santa Cruz H-100 sc-25731, для WT WB мыши и окрашивание на трансгенном pTRE-Add1 T445 / T480E, 1: 100), антитело против Y-аддуцина (Santa Cruz sc-365177, клон G-2, для WB и окрашивания, 1: 100), анти-α-аддуцин (фосфо S726) антитело (Abcam ab53093, 1: 100.Обратите внимание, что фосфозит S726 у человека расположен на 724 у мыши. Поэтому мы использовали S724, относящийся к этому сайту в статье), антитело против α-аддуцина фосфо S355 (Abmart 20592-1NB-3 / C63-S, 1: 100, для WB и двойных трансгенных), антитело против FLAG (M2 , F3165, Sigma-Aldrich 1: 100). Антитело легкой цепи миозина 2 (ptglab, 10906-1-AP, для окрашивания), антитело против MYH6 (Sigma-Aldrich, HPA001349).

    Imaging

    Флуоресцентные изображения тканей или клеток были получены с помощью Leica DM2000, микроскопа Nikon Eclipse Ni или конфокального микроскопа Nikon A1R и обработаны с помощью Photoshop CS3 для создания объединенных изображений с разными цветами.Для подсчета размера клеток кардиомиоцитов изображения образцов, окрашенных WGA, анализировали с помощью программного обеспечения Fiji.

    Вестерн-блоттинг

    Вестерн-блоттинг выполняли с использованием стандартных протоколов. Антитела, используемые в WB, представляют собой антитело против α-аддуцина (Santa Cruz H-100, sc-25731, 1: 500), антитело против γ-аддуцина (Santa Cruz H-60, sc-25733, 1: 500), -FLAG-антитело (Genescript # A00187, 1: 3000), антитело против Ty1 (Diagenode, # C15200054, 1: 3000) и пероксидаза AffiniPure осла против кроличьего IgG (Jackson ImmunoResearch 711-035-152, 1: 20 000), пероксидаза IgG козы антимыши AffiniPure (Jackson ImmunoResearch 115-035-003, 1: 20 000) были обработаны LI-COR.

    Выделение желудочковых миоцитов новорожденных крыс (NRVM) и культивирование клеток

    Кардиомиоциты были выделены из левого желудочка 1-2-дневных крыс Sprague-Dawley в соответствии с протоколом из набора для изоляции (Cellutron Life Technologies, cat # nc- 6031). Затем миоциты помещали на покровные стекла, покрытые ламинином (Life tech # 23017-015) при плотности 1250 клеток / мм в среде DMEM: M199 (3: 1), содержащей 10% лошадиной сыворотки, 5% FBS и 1% пенициллина / Стрептомицин. 100 мкмоль / л 5’-бром-2’-дезоксиуридина включен для подавления роста фибробластов.Через 24 часа после прикрепления клеток замените питательную среду.

    Выделение кардиомиоцитов

    Выделение кардиомиоцитов из сердец взрослых мышей было описано ранее (Mahmoud et al., 2013). Вкратце, взрослые сердца были взяты только что без предсердий. Образцы фиксировали в 4% PFA в течение ночи при 4 ° C. Ножницы разрезают область аорты для лучшего проникновения. После непродолжительной промывки в PBS для удаления PFA сердца инкубировали со свежей коллагеназой D (2,4 мг / мл, Roche) и B (1,8 мг / мл, Roche) с добавлением 1% пенициллина / стрептомицина в течение 12 часов при 37 ° C, используя встряхиватель встряхивающий.Супернатанты собирали и хранили при 4 ° C. После нескольких циклов переваривания до исчезновения видимой ткани супернатанты объединяли и фильтровали через фильтр с нейлоновой сеткой 160 мкм. Конечные клетки собирали центрифугированием при 1000 об / мин в течение 5 минут. Осадки клеток ресуспендировали в свежем PBS с добавлением 1% P / S. Для подсчета нуклеации по крайней мере 300 кардиомиоцитов на образец были количественно определены с помощью конфокальной визуализации z-стека.

    Плазмиды и мутагенез

    Вариант 1 транскрипта кДНК мыши Add1 был приобретен у Origene (№ по каталогу MR210357).Ген Add1 амплифицировали и субклонировали в pUC19 для точечных мутаций с помощью набора GeneArt Site-Directed Mutagenesis Plus (Life Technologies, номер по каталогу A14604). Вариант 2 Add1 клонировали из кДНК библиотеки мыши P1 Mouse Irak4. был куплен у Ориджена (MR207322). Праймеры, используемые для создания сайт-направленного мутагенеза или других клонов, перечислены в приложениях.

    Производство и очистка рекомбинантных векторов AAV

    Плазмиды pTR-GNP для создания кассеты экспрессии AAV, pDP6rs и pDG9 для упаковки AAV6 и AAV9, соответственно, являются подарками от Dr.Роджер Хаджар (Медицинская школа Маунт-Синай, Нью-Йорк). Мы использовали безвирусную систему упаковки AAV на основе двух плазмид для производства вирусов. Вирусы были продуцированы полиэтиленимином (Polysciences, Warrington, PA) -опосредованной трансфекцией в клетки HEK293T (эмбриональная почка человека, ATCC, # CRL-11268, Manassas, VA). После трансфекции в течение 72 часов клетки собирали центрифугированием. После трех циклов замораживания и оттаивания лизаты клеток обрабатывали универсальной нуклеазой Pierce для лизиса клеток (Pierce, Waltham, MA).Неочищенные вирусные суспензии подвергали двум циклам центрифугирования в градиенте плотности йодиксанола. Конечные концентрированные вирусы диализовали против PBS и титровали количественной ПЦР в реальном времени.

    Культура клеток, трансфекция и обработка циклогексимидом

    Клетки HEK293T трансфицировали p-3xFlag-Add1i1 и p-3xFlag-Add1i2 в присутствии или в отсутствие плазмиды p-3xTy1-Add3. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом. Клетки собирали через 0, 24 и 48 часов после обработки.Белки экстрагировали и измеряли концентрацию. 10 мкг общих белков разделяли с помощью SDS-PAGE и позже переносили на нитроцеллюлозную мембрану для WB. Антитело против FLAG использовали для обнаружения экспрессии α-аддуцина. Антитело против Ty1 использовали для обнаружения экспрессии γ-аддуцина. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля.

    Получение трансгенных мышей

    ORF конститутивно активной формы Add1i1 (T445 / T480E) субклонировали в вектор ДНК pTRE-Tight для создания плазмиды pTRE-T445 / T480E.pTRE-T445 / T480E линеаризовали с помощью PvuI и микроинъектировали в оплодотворенные ооциты полученным трансгенным мышам с использованием стандартных процедур 17 . Чтобы вызвать сверхэкспрессию Add1 в кардиомиоцитах, мышей pTRE-T445 / T480E скрещивали с мышами αMHC-tTA. Мышей соответствующего возраста αMHC-tTA использовали в качестве контроля. кДНК Add1 i2 синтезировали непосредственно из сердца мыши P1 CD-1. Область ORF субклонировали в вектор на основе pBluescript, промотор которого был заменен промотором αMHC для специфической экспрессии в кардиомиоцитах 46 .Плазмиду αMHC-Add1i2 линеаризовали с помощью EcoRV и микроинъектировали в оплодотворенные ооциты созданным трансгенным мышам. Трансгенных мышей скрестили с C57B6N / J. кДНК Add3 была приобретена у Genecript (GenScript Bioteh, NJ). ORF субклонировали в тот же вектор, что и αMHC-Add1i2. Для создания двойных трансгенных образцов Add1i2 / Add3 линеаризованную ДНК αMHC-Add1i2 и αMHC-Add3 микроинъектировали в оплодотворенные ооциты с использованием стандартных процедур. Для создания двойного трансгенного фосфо-аддуцина мутантный Add1 i2 T445E / T480E субклонировали под промотором αMHC.Линеаризованную ДНК αMHC-Add1i2 T445E / T480E и αMHC-Add3 микроинъектировали в оплодотворенные ооциты. Как двойные трансгенные, так и фосфо-двойные трансгенные были скрещены с C57B6N / J для стратегии разведения.

    Иммуно-электронная микроскопия

    Чтобы пометить антитело аддуцина нанозолотыми частицами, мы использовали золотое мечение антитела альфа-аддуцина фосфо-Т445. Процедура маркировки соответствовала протоколу J.R.Thorpe 47 .

    Proximity Ligation Assay

    Proximity Ligation Assay (Duolink, # DUO92101, Sigma) выполняли в соответствии с инструкциями.Циросрезы, полученные через 3 дня после образцов P1MI, использовали для всех исследований. Этапы извлечения антигена и пермеабилизации были такими же, как и при стандартной процедуре иммуноокрашивания. Первичные антитела TNNT2 и α-актинин использовали в качестве положительного контроля.

    TUNEL Assay

    Криосрезы окрашивали на тропонин Т, как указано выше в разделе «Гистология и иммуноокрашивание». После инкубации с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 555 (Invitrogen), окрашивание TUNEL проводили в соответствии с рекомендациями производителя (набор для определения гибели клеток in-situ, Fluorescein, Roche).Все окрашивание проводили на 3 сердцах на группу, по 3 среза на сердце.

    Анализ скрининга серина / треонина

    Мы синтезировали два биотинилированных пептида с сайтами фосфорилирования в середине последовательностей. Они предназначены для «T445», KQQREK T RWLHSG и «T480», EDGHR T STSAVP (символы, отмеченные красным, представляют собой сайты фосфорилирования). Скрининговый анализ киназ проводился ProQinase GmbH (Фрайбург, Германия). Первоначальный скрининговый анализ определяли при концентрации 1 мкМ в одном экземпляре в радиометрическом анализе ( 33 PanQinase® Activity Assay) на панели 245 Ser / Thr киназ с использованием планшетов FlashPlate® PLUS, покрытых стрептавидином (PerkinElmer, Бостон, Массачусетс).Реакционные смеси вносили пипеткой в ​​96-луночные V-образные полипропиленовые микротитровальные планшеты. Каждый аналитический планшет содержит одну лунку, которая не содержит фермента и используется в качестве фона. Для оценки результатов параллельно определяли фоновый сигнал каждой киназы (без биотинилированного пептида). Для анализа подтверждения совпадения семь киназ, выбранных из первого скринингового анализа, тестировали с образцами пептидов в трех повторностях при трех концентрациях (1, 0,5, 0,25 мкМ).

    Экспрессия и очистка белка

    Полноразмерная изоформа 1 ADD1 мыши и ADD3 или ADD мыши! Изоформа 2 и ADD3 были субклонированы в первую и вторую открытую рамку считывания (ORF) вектора pETDuet соответственно.mADD1 имеет метку 6xHis на своем N-конце, за которой следует сайт узнавания протеазы TEV, и плазмида была трансформирована в клетки Rosetta (DE3) pLysS (Novagen). Целевой белок экспрессировали в культурах, выращенных в среде для аутоиндукции при 18 ° C в течение ночи 48 . Культуру собирали и лизировали через French Press в буфере для лизиса (20 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT и с добавлением ингибиторов протеаз). Лизат центрифугировали и супернатант наносили на аффинную колонку Ni-NTA (Qiagen).Белки элюировали элюирующим буфером (20 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT и 250 мМ имидазол (pH 8,0)). Элюат дополнительно очищали ионообменной хроматографией (HiTrapSP) с последующей гель-фильтрационной хроматографией (GF_Superose6). Пиковые фракции собирали и концентрировали до 2-3 мг / мл для последующих экспериментов.

    Co-IP очищенного аддуцина 1/3

    Очищенный дуплекс аддуцина длинной формы ADD1 i1 / ADD3 и короткой формы дуплекса ADD1 i2 / ADD3 использовали в качестве приманки в анализе методом вытягивания вниз.Свежие сердца P1 и P21 лизировали в IP-буфере: 50 мМ Nah3PO4, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0,05% Твин 20, pH 8,0. Комбинация ингибиторов протеиназы и ингибиторов фосфатазы включалась всегда. 2 мкг очищенного дуплекса аддуцина (короткого или длинного) использовали для связывания с 800 мкг переваренных образцов сердца при осторожном покачивании при 4 ° C в течение ночи. Гранулы агарозы Ni-NTA промывали 3 раза буфером для лизиса. Затем в смесь добавили шарики. Инкубацию продолжали при осторожном покачивании в течение 1 часа при 4 ° C.После микроцентрифугирования в течение 30 секунд при 4 ° C осадки 5 раз промывали 1 мл IP-буфера для лизиса. Буфер для лизиса IP был дополнен 5 мМ иммидазолом в первые 3 раза; с 20 мМ имидазолом последние 2 раза. Гранулы Ni-NTA, связывающиеся с лизатами сердца P1 или P21 при 4 ° C, 1 час были включены в качестве отрицательного контроля.

    Опубликовано в категории: Разное

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *