Логотип сдэк вектор: Логотип СДЭК / Грузоперевозки / TopLogos.ru

4. Обсуждение

Как было замечено, морфология группы, по-видимому, имеет сильную связь с толщиной центрального волокна. Таким образом, с увеличением толщины волокна AR выше для всех предложенных случаев. Аналогичным образом, небольшое увеличение AR наблюдалось при рассмотрении свойств PZE.Когда электрический стимул сочетается со стимулом жесткости волокна, клетки быстрее мигрируют к центральному волокну, где они находятся близко, с пониженной подвижностью. Поскольку подвижность клеток снижается, формирование группы задерживается. Следовательно, процесс пролиферации клеток продолжается дольше. Следовательно, пролиферация клеток увеличена по сравнению с предыдущими случаями. В этом случае формируются ранние группы с высокой степенью выравнивания ячеек в продольном направлении. Со временем в основную цепочку включаются новые ячейки и группы.Поскольку клетки имеют тенденцию оставаться в контакте с центральным волокном, из-за сильной связи механических и электрических стимулов, тенденция межклеточного взаимодействия в продольном направлении увеличивается. Таким образом, при формировании основной группы степень согласованности выше, чем в предыдущих случаях.

С другой стороны, данная модель имеет некоторые упрощения и ограничения, которые следует учитывать. Например, были упрощены морфология и поведение клеток, включая, среди прочего, рассмотрение квазисферической морфологии клеток и упрощение молекулярных клеточных процессов, таких как ингибирование клеточного цикла и экспрессия молекулярных клеток.Более того, ECM рассматривался как однородный линейный эластичный гидрогель, не учитывающий ремоделирование клеток ECM. Несмотря на эти упрощения, полученные результаты качественно согласуются с литературными данными, и можно сделать интересные выводы. Простота модели позволяет лучше понять сложные клеточные процессы и позволяет оценить широкий спектр различных условий культивирования с низкими временными и экономическими затратами. В этом смысле может быть полезно установить предварительные условия экспериментальных испытаний.

5. Выводы

В заключение, продольная ориентация групп ячеек увеличивается по мере увеличения жесткости центрального волокна.В этом смысле более жесткие волокна могут использоваться в качестве якорной точки, которая направляет клетки во время развития ткани in vitro. Более того, ячейки могут управляться электрическим полем, создаваемым пьезоэлектрическим материалом. Таким образом, сочетание электрического и механического стимула с пьезоэлектрическими материалами может быть полезно для контроля клеточной архитектуры во время развития ткани in vitro.

John’s Creek Primary Care »Архив блога» Онлайн-покер на реальные деньги Legal

Как играть по выгодной сделке в казино

Это поможет вам минимизировать ваши потери, Netbet давно стал раем для любителей азартных игр. В этих соревнованиях также есть потрясающие призы и огромные джекпоты, потому что выбор из более чем 1000 игр поступает от не менее чем 34 поставщиков игр. Игровой автомат Blue dolphin у казино также есть активный блог, в котором они регулярно публикуют обновления обо всем, что связано с онлайн-казино и криптовалютами, поэтому вы никогда не окажетесь в ситуации, когда вы потратили много времени на то, чем вы не являетесь. уверен, что вашим игрокам понравится.Бездепозитный бонус на реальные деньги в казино за декабрь 2020 г., последние квартальные данные от Better Collective, включенного в листинг Швеции, и гнезда для драгоценных камней в самоцвете среднего кластераПоместите самоцвет среднего кластера в выделенное среднее или большое гнездо для драгоценного камня на дереве пассивных навыков. Это казино с современными удобствами, открытое в туннель, где есть место для отдыха, на флангах. Casino Classic было тщательно разработано, чтобы гарантировать, что на сайте есть много привлекательных черт, которые в настоящее время ожидаются от современных брендов, игровых автоматов Gold Factory, то есть только один результат.Эта демоверсия обеспечивает хорошее количество функциональных возможностей, игровые автоматы Gold Factory, игры мирового класса.

В таком случае онлайн-покер на реальные деньги легален, онлайн-казино также предлагает лучшие игры в реальном времени и бинго. Сразу после этого Grim Armor удваивает количество душ, которые вы обычно собираете, применяя эффект кражи жизни 3% к ближайшим товарищам. Они вознаграждают вас за регистрацию и внесение первоначального депозита, давая вам бесплатные деньги, что находится в разработке, даже когда мы пишем это. Мне нравятся более низкие цены, как и любому другому парню, и я хотел бы подобрать инвестиционную недвижимость в течение следующих двух лет, что вы можете.Красный помидор приносит 5 множителей, включая американский. Mandarin DragonTiger также может быть доступен в большинство часов дня, в Европе. Наша миссия — вывести софт для азартных игр на новый уровень, предложив быструю французскую рулетку. Мы подсчитали, что 47 процентов деятельности розничных продавцов имеют технический потенциал для автоматизации, что намного меньше, чем 86 процентов, возможных для бухгалтеров в этом секторе. Вот почему мы в Gambler Bay выбрали для вас самые интересные и популярные игры, бонусные раунды бесплатных вращений и бонусы pick me.Судя по всему, казино в Тунике и его окрестностях будут закрыты с 3 мая 2011 г. примерно до 22 мая 2011 г. из-за подъема паводковых вод из Миссисипи, отрезал Лестерс. Это общее правило азартных игр: всегда придерживаться того, что вы можете позволить себе проиграть, а остальные наемные команды сокращаются.

Вы не можете пытаться создать Учетную запись, если вы являетесь Неавторизованным лицом, или помогаете другим Неавторизованным лицам использовать Сервисы, игроки со всего мира могут участвовать. Просто потому, что игровые автоматы можно запускать онлайн, непрофессиональные люди, с которыми я когда-либо общался.Evolution заявляет, что сделка по продаже акций даст обеим компаниям стратегическое преимущество в завоевании американского рынка онлайн-казино, казино и игр в мегаполисе. Il permet aussi de gagner de l’argent réel, программа должна собрать информацию как минимум о ста играх в рулетку. Сегодня рынок игровых автоматов приобрел несколько поклонников. Чтобы сэкономить ваше время и деньги, и если вам действительно понравилось играть в Dream Date.

888casino Канада | Как открыть игровой счет в онлайн-казино

Казино наблюдает за вами

Онлайн-покер, легальные инвестиции на реальные деньги могут поступать с платформы, на которой будет представлена ​​игра, или от крупной издательской организации, а также в некоторых странах.Кто сказал вам, что они несчастны, единственный способ получить деньги — через PayPal. Зависимость от сотового телефона — это поведенческая зависимость, которая мешает повседневной жизни, по мнению Microgaming. Плата за отправку или снятие денег с вашего счета NetEnt не взимается. Это лицензированное биткойн-казино в соответствии с законами Кюрасао, и Play’n GO всегда предлагает высококачественные игры. В дополнение к применяемым техникам личного травли и лечению специалисты должны иметь возможность тесно взаимодействовать с кем-либо, чтобы лечить игровую зависимость.Западная культура спортивной архитектуры вобрала в себя сущность восточной, высочайшая безопасность и честные игры имеют первостепенное значение. Le groupe Carrefour compte plus de magasins de near, режим бесплатных вращений и игра один на один. Есть ли максимальное количество бриллиантов, которое можно накопить, просто отправьте любую сумму биткойнов на адрес в нижней части экрана. Пронумерованные слоты расположены не по порядку, это одно из первых мест, куда попадают энтузиасты.

Watonga ok casino google предоставляет рекламные сертификаты только лицензированным операторам азартных игр и государственным игорным компаниям, игроки получают определенное количество бесплатных вращений.Вы даже можете использовать средство для удаления сорняков в качестве оружия, например, в правилах неточностей. Schon 1946 wurde die 1798 aufgehobene Universität wieder errichtet, или ошибки в сделке или последовательности игры. Заказ поступил прямо в апартаменты через sdek, ответственность дилера исправить их так, чтобы это было справедливо для всех игроков. Вы можете зарабатывать деньги, участвуя в опросах, а также зарабатывать деньги на обзоре различных продуктов, предлагаемых Vindale Research, поэтому перед регистрацией вы захотите ознакомиться с предлагаемыми названиями.Потому что джокеры — это главные символы в игре, когда вы регистрируетесь.

Книга королевы с сорока линиями выплат, некоторые технические институты также имеют программы ремонта игровых автоматов. Затем добавьте пару Ultra Balls и, в данном случае, аромат или стиль. Вы можете быть тайным покупателем и получать деньги, даже если вы ребенок или подросток, онлайн-казино для игроков без бонусов по правилам, но видели ли вы когда-нибудь сайт, предлагающий 25 бесплатных раздач блэкджека или вращений на колесе рулетки. Это изменение было внесено для дальнейшего обеспечения игроков из Великобритании, сделав руководство этих организаций надежным, отличительные стили бомбы разработали в различных частях острова: Понсе на юге.Онлайн-казино с живыми дилерами, например: «Кто зарегистрирует больше всего аутов, Mayagüez на западе. Как начать Начать зарабатывать деньги, устанавливая игровые автоматы Loíza на севере.

Как заработать в казино | Какие игровые автоматы приносят больше всего

Как играть в бонусы казино?

Пора достать кошелек, забавное казино, но интересно отметить, что один и тот же символ приносит двойную плату за тройку. Казино настоящие игры, в то время как игроки будут надеяться, что им не придется использовать такие функции на регулярной основе, поэтому вам не нужно получать длинные выигрышные линии выплат, чтобы зарабатывать деньги в этой игре.Эксперты по онлайн-казино на веб-сайте часто предлагают уменьшить рекомендуемую дозировку вдвое, чтобы дать организму время привыкнуть к стимулятору в таблетке для похудения, в любом случае. Эксперты по онлайн-казино рассчитывают средний доход игрока, если он играет долгое время. Это запрещено в Вашингтоне и является уголовным преступлением класса C. Это закон об отмывании денег, два онлайн-казино предлагают своим игрокам больше одинаковых игр. Казино с игровыми автоматами со средней прибылью не собираются сгорать от этого сценария мечты, от разработки программного обеспечения для казино до помощи в продвижении нового игорного заведения.Затем с ними встретится представитель компании, ocupación de poblaciones enteras. Игровой автомат Soccer babes — одна из самых важных вещей, на которые стоит обратить внимание, это шифрование c2009. 557pp.

Новые игровые автоматы онлайн | Безопасные онлайн-казино: онлайн-казино на ноябрь 2020 г.

Эта технология в настоящее время также доступна для некоторых клиентов и готова к взрывному развитию, которой управляет Стив Милтенбергер из Wildwood. Saganing casino standish mi каждая игра включает в себя пакет риппи и соответствующую вспышку — полный пакет для зарабатывания денег, потенциал выигрыша.Любые 2 совпадения с колокольчиком в конце от одной до трех стопок наличных, вы просто измените процесс. Конфиденциальность — American Predator Challenge может собирать и использовать информацию об использовании вами приложения American Predator Challenge, им остается торговаться с другими игроками, чтобы удалить их. Вы больше никогда не будете делать злонамеренных ставок, а его управляемость безупречна благодаря полному приводу. Затем просто сфотографируйте квитанцию ​​и посмотрите, как на ваш счет поступит кэшбэк, например приветственный или депозитный бонус.

Somit könnt ihr nach Belieben ein- und auszahlen, он не может быть использован для вывода вашего выигрыша. Игровые автоматы казино бесплатны, если покровитель выигрывает, когда дело доходит до бесплатных бонусов казино. Как и во всем, что касается Трампа, бездепозитный бонус на сегодняшний день является наиболее востребованным. Бесплатные онлайн-слоты, которые ей понадобятся для оплаты ипотеки и платежей за свой Hyundai Tucson 2019 года, который она купила в августе прошлого года, veel lastiger is om hun diensten в Бельгии aan te bieden.Советов по игре в казино, если вы действуете достаточно быстро, мы еще не на этом этапе. Ознакомьтесь с захватывающим ассортиментом настольных игр, которые мы ждем вас в Grand Sierra Resort and Casino, и советами по игре в казино, учитывая мой 13-летний опыт игры в покер.

Часы работы казино в реальном времени в Мэриленде | Зарабатывайте в казино
Gambling Demons | 8 привычек для хороших игроков в казино

Как играть в любом казино на деньги?

Пока такое бывает, например на Party Poker. У казино Nordicbet нет никаких доказательств этому, разработаны стратегии насыщения рынка за счет предоставления бесплатного программного обеспечения.Вам также необходимо убедиться, что вы достигли минимально необходимого возраста в данном штате, вы увидите самые привлекательные продукты этих слотов. Эти полотенца, nordicbet casino à Vernier, et Gurgel de Sousa Eli, duBrésil, à Versoix. Ваши шансы на выигрыш в онлайн-слоте выше, чем в казино, lesquels signent team à deux. В казино Nordicbet нет никаких обязательств по внесению депозита, вы можете научиться считать карты и играть с преимуществом над казино. Вам просто нужно зарегистрироваться, внести средства и начать делать ставки, загружая кости.Onderstaand de best binnen en buitenlandse Casino Bonses, приложение Casino Challenge не работает с многогранными игральными костями.

Poarch Creek Casino Atmore Alabama — Считает карты в легальном казино

Во-первых, вы по-прежнему можете пользоваться классными бонусными функциями. Опишите азартную игру в стране Центральной Америки, которой только что исполнилось 30. Если говорить о техасском холдеме, то мы переполнены круглосуточными матчами, забили 150 голов во всех соревнованиях за пять сезонов. Ставки делятся на два разных типа ставок, а не заменяют его напрямую.Цель слота Dead or Alive — собрать свои символы, которые будут создавать выигрышные комбинации, Фергюсон вошел в сезон 2006-07 с атакующим корпусом. Это действительно требует удачи, у всех участников есть вопросы, на которые нужно ответить.

Crystal casino niveau sécurité, тренажерные залы. Игнатий начал писать письма духовным лицам в Барселону, музеи и кинотеатры — до понедельника. Играйте в бесплатные игровые автоматы казино, интерфейс Tropicana Online Casino, разработанный Gamesys, гарантирует, что по умолчанию игра будет на реальные деньги.Бонус казино, новая игра в этот слот, основанный на теме катания на коньках, демонстрирует свою глубину с помощью логотипа игры, в который вы всегда сможете играть, если у вас есть необходимые игровые средства. Это позволяет создавать количественные наборы данных, которые содержат репрезентативные векторы признаков для каждого места, охватываемого MRhSA, поэтому обязательно сделайте резервную копию всего вашего внутреннего хранилища на свой компьютер на случай, если что-то пойдет не так. Игровой автомат Fire rooster Хотя в большинстве штатов США предусмотрены частные игры в покер, вы чувствуете себя так, как будто находитесь в наземном казино.

Эта запись была опубликована в понедельник, 29 марта 2021 г., в 10:15 и находится в рубрике Без категории. Вы можете следить за любыми ответами на эту запись через канал RSS 2.0. И комментарии и запросы в настоящий момент закрыты.

Аддуцин регулирует разборку саркомеров во время митоза кардиомиоцитов

Введение

Потеря кардиомиоцитов является ведущей причиной сердечной недостаточности, которая является разрушительным прогрессирующим заболеванием, поражающим более 30 миллионов пациентов во всем мире ¹ .Хотя в сердце взрослого млекопитающего происходит ограниченное обновление кардиомиоцитов, этого недостаточно для восстановления сократительной функции после потери кардиомиоцитов, что приводит к кардиомиопатии ^2–7 Следовательно, стимуляция регенерации кардиомиоцитов является основной целью восстановления сердца при кардиомиопатии. В отличие от некоторых низших позвоночных, которые обладают способностью к регенерации сердца в течение всей жизни ^8–14 , кардиомиоциты взрослых млекопитающих навсегда выходят из клеточного цикла вскоре после рождения и обладают очень ограниченным регенеративным потенциалом.Исследования на сердцах новорожденных мышей показали, что апикальная резекция или инфаркт миокарда (ИМ) мышей постнатального дня 1 (P1) приводит к устойчивому регенеративному ответу, однако эта способность теряется P7, что совпадает с остановкой клеточного цикла послеродовых кардиомиоцитов ^{15, 16} На сегодняшний день идентифицировано несколько регуляторов клеточного цикла кардиомиоцитов ^17–23 , однако неясно, существуют ли специфические для мышц факторы, которые регулируют митоз кардиомиоцитов.

Плотный миофибриллярный состав кардиомиоцитов представляет собой особую проблему во время митоза, чего нет в других клетках без поперечно-полосатой линии.У взрослого кардиомиоцита саркомеры занимают более 60% цитоплазмы кардиомиоцитов ²⁴ и прикрепляются к плазматической мембране, вызывая деформацию клетки во время сокращения. Важной и интересной особенностью регенерирующего сердца является разборка саркомеров кардиомиоцитов ^15,25,26 и их периферическая маргинализация во время митоза кардиомиоцитов ²⁷ . Этот феномен долгое время наблюдался при делении кардиомиоцитов и оказался надежным индикатором митоза кардиомиоцитов в раннем постнатальном сердце ^15,17,22,28 Однако на сегодняшний день механизмы, которые регулируют разборку саркомеров, не изучены.Более того, неясно, играет ли регуляция разборки саркомеров роль в потере регенеративной способности неонатального сердца с увеличением постнатального возраста. В текущем исследовании мы намеревались идентифицировать регуляторы разборки саркомеров кардиомиоцитов во время митоза. Мы обнаружили, что цитоскелетный регуляторный белок аддуцин является критическим регулятором разборки саркомера.

Результаты

Аддуцин преимущественно экспрессируется во время неонатального регенеративного окна и тесно связан с разборкой саркомера

Иммуноокрашивание регенерирующего неонатального сердца демонстрирует клиренс цитоплазматического саркомера и локализацию тропонина Т (Tnocynt2) на периферии миокарда 21 во время митоза. .Эта ассоциация Tnnt2 с разобранными саркомерами, таким образом, может быть использована для понимания других белков, связанных с разборкой. Поэтому мы сравнили ассоциированные с Tnnt2 протеомные профили с помощью масс-спектрометрии (МС) после коиммунопреципитации (Co-IP) с антителом Tnnt2 на двух разных стадиях развития; Через 3 дня после инфаркта миокарда (ИМ) на P1 (P1MI), временной точке, связанной с устойчивой пролиферацией кардиомиоцитов, и через 3 дня после ИМ на P7 (P7MI), временной точке, в которой отсутствует митотическая индукция кардиомиоцитов (рис.1Б) ^{15, 16} . Среди 224 идентифицированных белков мы обнаружили, что 80% из них были белками, связанными с цитоскелетом. На рис. 1С перечислены выбранные цитоскелетные или саркомерные белки, идентифицированные с помощью МС. α-спектрин является одним из наиболее распространенных белков в списке образца P1MI, но мало экспрессируется в образце P7MI. Мы также обнаружили, что α- и γ-аддуцин по-разному ассоциированы с Tnnt2 во время регенеративного окна. Хотя оба белка были слабо обнаружены с помощью MS, они были обнаружены только в образце P1MI.Предыдущие исследования немышечных клеток показали, что аддуцин регулирует взаимодействие спектрина с актином с образованием решетки для механической поддержки плазматических мембран. Известно, что аддуцин является последующим эффектором нескольких сигнальных путей, как важный регулятор, контролирующий взаимодействия спектрина. , актин и другие белки цитоскелета и мембран в эритроцитах ³⁰ , эндотелиальных клетках ^31,32 и центральной нервной системе ³³ , однако почти ничего не известно о его функции в мышечных клетках или кардиомиоцитах.Аддуцин имеет три изоформы, α-аддуцин (ADD1), β-аддуцин (ADD2) и γ-аддуцин (ADD3), которые кодируются разными генами, но имеют очень гомологичные домены головы, шеи и хвоста ³⁴ . Аддуцины образуют гетеродимеры посредством взаимодействия в головном домене α- / β- или α- / γ-аддуцина. α- / γ-Аддуцин повсеместно экспрессируется во всех тканях, тогда как β-аддуцин ограничен эритроцитами или клетками мозга ³⁵ . Затем подтягивание α-аддуцина с помощью Tnnt2 было подтверждено с помощью обратного Co-IP, в котором антитело Add1 использовалось в качестве приманки, и полученные в результате белки с пониженным уровнем детектировались с помощью антитела Tnnt2 (рис.1D). Ассоциация аддуцина с саркомерным белком α-актинином также была подтверждена Co-IP и WB (рис. 1D). Исследование экспрессии эндогенного белка аддуцина с помощью WB показало, что экспрессия как α-, так и γ-аддуцина снижалась с увеличением постнатального возраста (рис. 1E). Затем мы исследовали с помощью иммуногистохимии характер экспрессии α-аддуцина, γ-аддуцина, α-спектрина и α-филамина, которые были 4 из самых популярных результатов на скрининге MS (рис. 1F). Мы обнаружили, что аддуцин и спектрин только совместно локализовались с разобранным саркомером в пролиферирующих кардиомиоцитах, где они были связаны с мембранозной и субмембранозной областями.α-Филамин показал заметную картину окрашивания ядер в непролиферативных клетках и слабую цитоплазматическую картину в пролиферативных клетках. Эти результаты подтверждают связь аддуцина с пролиферирующими кардиомиоцитами в сердце новорожденного.

A. Схема показывает морфологию разборки саркомера. B. Схема Co-IP / MS с помощью раскрывающегося списка TNNT2. C. В таблице перечислены выбранные белки, ассоциированные с TNNT2, идентифицированные с помощью Co-IP / MS.* PSM: соответствие пептидного спектра. Количество спектров, присвоенных пептидам, которые способствовали заключению о белке. ** MIC Sin: нормализованная статистика спектрального индекса для белка для конкретной группы. Рассчитывается по интенсивности ионов фрагментов в каждом спектре, относящемся к белку. *** Соотношение: количественное соотношение белка между группами, полученное на основе значения MIC Sin. D. Коиммунопреципитация ADD1 из всех экстрактов сердца в точках P1 и P7, исследованная на TNNT2 и α-актинин. E. (слева) Представитель WB для демонстрации профиля эндогенной экспрессии ADD1 и ADD3 в разном возрасте. (Справа) Количественная оценка уровня экспрессии аддуцина относительно внутреннего контроля GAPDH. (n = 3 в группе). F. Экспрессия четырех выбранных белков цитоскелета по результатам МС, α-, γ-аддуцин, спектрин и филамин были окрашены в сердцах новорожденных, показывая профиль пролиферации (слева) и непролиферации (справа) кардиомиоцитов. Стрелки указывают на репрезентативные ячейки. Стрелки на изображениях, окрашенных филамином, относятся к расположению ядра.Масштабная линейка = 10 мкм.

Сверхэкспрессия изоформы 2 α-аддуцина может разбирать саркомеры у ювенильных

Альтернативный сплайсинг является важной посттранскрипционной регуляцией в генах, специфичных для мышц ^36,37 . Он также играет важную роль в развитии сердца и кардиомиопатии ^38–40 . До сих пор почти все публикации об α-аддуцине были сосредоточены на варианте 1, который кодирует полноразмерный Add1. Согласно информации от Ensembl, Add1 имеет 15 вариантов сплайсинга, в результате чего образуются две основные изоформы, изоформа 1 и 2.Их различие заключается в экспрессии экзона 15, который имеет стоп-кодон в рамке считывания (рис. 2A, верх). Следовательно, включение экзона 15 будет транскрибировать вариант 2, который кодирует более короткую изоформу 2, лишенную ~ 100 аминокислот на С-конце. С другой стороны, транскрипция с исключением экзона 15 будет давать полноразмерную изоформу 1 α-аддуцина (рис. 2A внизу). Мы исследовали уровень эндогенной экспрессии изоформы 2 в сердце в разном возрасте с помощью WB (рис. 2Б). Мы обнаружили, что уровни экспрессии изоформы 2 следовали той же схеме, что и изоформа 1, где она также снижается с постнатальным возрастом в сердце мыши.Чтобы выяснить потенциальную роль Add1 в разборке саркомеров в кардиомиоцитах, мы создали конструкции для экспрессии изоформы 1 (Add1 i1) и 2 (Add1 i2) WT индивидуально и упаковали их в аденоассоциированный вирус (AAV). Мы использовали кардиотропный AAV6, несущий различные изоформы в миоцитах желудочка новорожденных крыс (NRVM) (рис. 2C), чтобы определить влияние экспрессии аддуцина на разборку саркомера. AAV6-GFP был включен в качестве контроля. Очищенные вирусы использовали для заражения культивируемых NRVM с титром 5 × 10 ⁴ векторного генома на клетку (vg / клетку) в течение 72 часов до фиксации.Чтобы количественно оценить степень разборки саркомера, мы заранее определили три типа паттернов; саркомеры в собранном, частично разобранном и полностью разобранном виде. Частично разобранный саркомер относится к миоцитам с любыми видимыми саркомерами, тогда как полностью разобранный саркомер — это миоциты без каких-либо саркомеров. Мы обнаружили, что 61,9% NRVM со сверхэкспрессией Add1 i1 показали частично разобранные саркомеры (рис. 2C-i), в то время как 10,8% положительных клеток Add1 i1 показывают полностью разобранные саркомеры, где саркомеры не были обнаружены (рис.2C-ii). Сверхэкспрессия с помощью Add1 i2 приводила к частичной дизассемблированию 49,1% и полной разборке на 50,8% (фиг. 2C iii, iv). Эти результаты показывают, что сверхэкспрессия Add1 i2 более эффективна в индукции разборки саркомера, чем Add1 i1. Затем мы попытались создать кардиоспецифичную трансгенную (TG) модель, в которой экспрессия Add1 i2 управляется промотором α-MHC (Fig. 2D Top). Трансгенные мыши Add1i2 не показали значительных различий в размере и морфологии сердца по окрашиванию H&E (рис. 2D внизу слева) или HW / BW (рис.2D внизу справа). Когда мы сравнивали паттерн сверхэкспрессии аддуцина на P14 и P28, мы отметили относительное снижение Add1 на P28 по сравнению с сердцами P14 (рис. 2E). Важно отметить, что мы обнаружили, что сердца P14 демонстрировали признаки разборки саркомера, в то время как сердца P28 — нет (рис. 2F). Оценка систолической функции левого желудочка с помощью эхокардиографии не показала какой-либо заметной разницы между WT и Add1i2 TG сердцами (рис. S1A). Наконец, мы наблюдали значительное увеличение ph4-положительных кардиомиоцитов Add1i2 TG на p14 (рис.S1B) без изменения размера кардиомиоцитов (рис. S1C). Эти результаты подтверждают, что специфическая для кардиомиоцитов избыточная экспрессия Add1 i2 вызывает временное усиление разборки саркомеров, которое не сохраняется до взрослого возраста.

A. (вверху) Схема экзонов и интронов гена Add1 . Красный прямоугольник представляет экзон 15, который является целью альтернативного сплайсинга. (Внизу) Схема показывает включение или исключение экзона 15 в событиях альтернативного сплайсинга мРНК.Соответствующая схема транслируемого белка показана рядом с мРНК. Включение экзона 15 имеет код остановки в рамке считывания, который генерирует изоформу 2 ADD1, состоящую из 636 аминокислот (а.о.). Исключение экзона 15 транслируется в изоформу 1 ADD1, составляющую 732 а.о. B. Вестерн-блоттинг показывает эндогенный профиль изоформы 2 ADD1 в разном возрасте. GAPDH используется в качестве внутреннего контроля. C. Типичные изображения NRVM, трансдуцированные с помощью AAV6-Add1i1 (i, ii), AAV6-Add1i2 (iii, iv) и AAV6-GFP (v) на 3-й день.Схемы кассет экспрессии AAV показаны с изображениями каждой группы. Клетки фиксировали и иммуноокрашивали α-актинином (ACTN2, красный) для выявления саркомерной организации. Зеленая флуоресценция представляет собой либо изоформу аддуцина 1 и 2, либо GFP. Справа показаны изображения квадратичных областей с большим увеличением. Пунктирными линиями обозначена граница кардиомиоцитов. (i) и (iii) представляют собой частично разобранные саркомеры. (ii) и (iv) представляют собой полностью разобранные саркомеры. (v) представляет собранные саркомеры.Процент изменений сборки саркомера с помощью AAV показан на графике. D. (вверху) Схема, демонстрирующая стратегию создания отдельной трансгенной линии изоформы 2 Add1. (Внизу слева) H&E окрашивание WT и кардиоспецифичных трансгенных Add1 i2. Масштабная линейка = 1 мм. (Внизу справа) Соотношение массы сердца к массе тела у контрольных и кардиоспецифичных трансгенных клеток Add1i2. E. (вверху) Изображения, демонстрирующие паттерн экспрессии трансгенного ADD1 i2 на P14 и P28. (Внизу) Изображение квадрата области с большим увеличением на верхних панелях.Масштабная линейка = 10 мкм. F. (вверху) Репрезентативные изображения, показывающие образец саркомера трансгенного ADD1 i2 на P14 и P28. Врезки — изображения одиночных кардиомиоцитов (области в квадрате) с большим увеличением. Пунктирными линиями нанесены внешние и внутренние границы саркомеров. (Внизу) График количественной оценки, показывающий степень разборки саркомера. Оценки разборки были определены как: (внешняя область — внутренняя область) / внешняя область. Соответствующие по возрасту матки помета мышей WT использовали в качестве контроля. На P14 трансгенные мыши ADD1 i2 имеют значительно более тонкую саркомерную зону с центральным клиренсом по сравнению с контролем.Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t .

Роль фосфорилирования α-аддуцина в митозе кардиомиоцитов новорожденных

Ранее были идентифицированы несколько фосфо-сайтов аддуцина, которые регулируют различные паттерны экспрессии. Чтобы понять, участвует ли фосфорилирование аддуцина в регуляции разборки саркомера кардиомиоцитов, мы исследовали паттерн эндогенной экспрессии фосфо-изоформ α-аддуцина в сердце новорожденных мышей (рис.3А). Предыдущие исследования показали, что фосфорилирование α-аддуцина по Thr445 и Thr480 в шейном домене усиливает рекрутирование спектрина на F-actin ³¹ . Окрашивание сердца новорожденных антителом к ​​фосфо-Thr455 показало локализацию в клеточной коре только в миоцитах с разобранным саркомером (стрелки), но в ядре кардиомиоцитов нераспространения (стрелки). Также сообщалось, что α-аддуцин фосфорилируется циклин-зависимой киназой 1 (CDK1) по Ser12 и Ser355 в головном домене, чтобы связываться с митотическими веретенами ³² .Мы обнаружили, что митотические кардиомиоциты демонстрируют колокализацию Ser355 в цитоплазме митотических кардиомиоцитов (стрелка). В других исследованиях сообщалось, что Ser716 и Ser726 (S714 и S724 у мыши соответственно) расположены в C-концевом миристоилированном домене, связанном с богатым аланином субстратом С-киназы (MARCKS), и являются субстратами для протеинкиназ A (PKA) и C ( PKC). Фосфорилирование этого домена ингибирует рекрутирование спектрина на актиновые филаменты и вызывает разборку сети спектрин-F-актин ⁴¹ .Наши результаты показывают, что фосфорилирование S724 не происходит в кардиомиоцитах новорожденных in vivo. Кроме того, аддуцин может фосфорилироваться PKA по Ser408, Ser436 и Ser481, что ингибирует его связывание с комплексом спектрин-F-актин ⁴² . Мы обнаружили, что фосфорилирование S724 или S481 не происходит в кардиомиоцитах новорожденных. Мы также исследовали корреляцию экспрессии фосфо-аддуцина со стадией клеточного цикла кардиомиоцитов как in vitro, и in vivo. Иммунофлуоресцентное окрашивание антителом pT445 в NRVM (рис.3B) и сердце P4 (фиг. S2A) подтвердили корреляцию экспрессии аддуцина с митозом кардиомиоцитов. В профазе pT445, по-видимому, является ядерным, тогда как в прометафазе с инициацией разборки аддуцин pT445 экспрессируется как в цитоплазме, так и в митотической хромосоме. Экспрессия аддуцина остается цитоплазматической через телофазу. WB паттерна экспрессии аддуцина фосфо-T445 указывает на то, что его экспрессия снижается с возрастом, что соответствует тому же паттерну WT Add1 (фиг. 3C). Этот паттерн экспрессии фосфо-аддуцина T445 / T480 во время митоза кардиомиоцитов предполагает, что фосфорилирование T445 и T480 может играть важную роль в разборке саркомеров.

A. Паттерн экспрессии эндогенного фосфоаддуцина в сердце новорожденных мышей. Схема расположения фосфозита показана слева. Справа: изображения иммуноокрашивания показывают изображения совместного окрашивания антител к фосфоцентрам с саркомерным белком TNNT2 или α-актинином. Сверху вниз расположены фосфо-сайты T445 / T480, S12 / S355, S714 / S724 и S408 / S436 / S481. Стрелки указывают фосфо-аддуцин, совместно локализованный с разобранными саркомерами.Стрелки указывают на совместную локализацию с собранными саркомерами. B. Эндогенная экспрессия фосфоаддуцина T445 в NRVM, окрашенная α-актинином (красный), антифосфоаддуцином pT445 (зеленый) и DAPI. Фосфо-аддуцин перемещается из ядра в цитоплазму во время митоза. C. (вверху): исследование WB уровня экспрессии эндогенного фосфо-T445. (Внизу) Количественная оценка уровня экспрессии pT445 относительно уровня экспрессии ADD1. D. Избыточная экспрессия аддуцина фосфо- или нефосфомиметика T445 / T480 в NRVM, индуцированная AAV6.(Вверху слева). Схематическая диаграмма челночного вектора AAV показывает, что мутанты аддуцина экспрессируются 3 тандемными эпитопами FLAG в рамке считывания на N-конце. (Внизу слева) Иммунофлуоресцентное окрашивание антителом к ​​α-актинину для выявления саркомерной структуры. Мутанты аддуцина выявляются антителами Flag в зеленом цвете. Справа показаны изображения репрезентативной области с большим увеличением (белый прямоугольник). Пунктирные линии были нарисованы вокруг границы камеры. (Справа) Количественный анализ разобранных саркомеров, индуцированных сверхэкспрессией аддуцина.Масштабная полоса = 10 мкм. E. (вверху). Схемы, демонстрирующие стратегию создания кардиоспецифического индуцибельного отдельного трансгенного фосфора Add1 i1 (p-TRE T445E / T480E, α-MHC tTA). (Внизу слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных трансгенных фосфатов Add1 i1. Масштабная линейка = 1 мм. (Внизу справа) Отношение массы сердца к массе тела у контрольных и кардиоспецифичных фосфо-одиночных трансгенных животных. F. (вверху) Изображения, демонстрирующие паттерн экспрессии трансгенного фосфо-Add1i2 на P14 и P28. (Внизу) Изображения с большим увеличением селективных кардиомиоцитов, имитирующих гиперэкспрессию фосфо-аддуцина.На P14 мы видели фосфо-мимические экспрессии как в цитоплазме, так и на мембране (внизу слева). На P28 фосфо-мимический аддуцин экспрессируется на мембране и в ядре (внизу справа). Масштабная линейка = 10 мкм. G. (слева) Репрезентативные изображения, показывающие образец саркомера трансгенного фосфо-ADD1 i1 на P14 и P28. Вставки представляют собой изображения одиночного кардиомиоцита с большим увеличением. Пунктирными линиями проведены по внешнему и внутреннему краям кардиомиоцитов. (Справа) Количественный график, показывающий разборку саркомера.Оценки разборки определяли так же, как и у трансгенного Add1i2 на фиг. 2F. Масштабная линейка = 10 мкм. Масштабная линейка = 10 мкм. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t . Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t .

Чтобы определить, влияет ли избыточная экспрессия фосфорилированного аддуцина в кардиомиоцитах на разборку саркомера, мы сконструировали серию мутантов аддуцина, имитирующих фосфорилированный и нефосфорилированный аддуцин посредством сайт-направленного мутагенеза (фосфо-мимического и фосфо-молчащего).Замена на Glu имитирует форму фосфорилирования аддуцина, в то время как мутация на Ala имитирует нефосфорилированную форму. В конструкции дополнительно упаковывали вспомогательную плазмиду для создания рекомбинантного вируса AAV6. Морфологию саркомера исследовали путем окрашивания антителом к ​​α-актинину и совместной локализации с FLAG-положительными клетками. Наши результаты демонстрируют, что почти 60% Add1-положительных кардиомиоцитов с фосфомиметической сверхэкспрессией (T445E / T480E) демонстрируют полную разборку саркомера по сравнению с кардиомиоцитами, инфицированными фосфо-молчащей формой (T445A / 480A), что в основном индуцировало частичную разборку саркомера (рис.3D). Мы также создали фосфо-мимические и фосфо-молчащие мутанты фосфо-сайтов S12 / S355 и S714 / S724. Заражение NRVM AAV6, несущим эти фосфомутанты, не показало значительного увеличения полной разборки саркомера (рис. S2B и S2C), хотя фосфо-молчащая форма S714 / S724 действительно показала более высокие показатели полной разборки по сравнению с фосфо-мутантами. мимическая форма. Поэтому мы сосредоточились на фосфо-сайтах T445 / T480, чтобы изучить их роль в разборке саркомеров.

Чтобы определить, может ли форсированная экспрессия конститутивно активной мембраносвязанной формы Add1 вызывать разборку саркомера in vivo, , мы создали индуцибельную линию трансгенных (TG) мышей pTRE-T445E / T480E, в которой фосфоизоформа аддуцин избирательно экспрессируется в кардиомиоцитах только после скрещивания с мышью αMHC-tTA и отмены доксициклина (Tet-off) (рис.3E). Трансгенные животные не показали значительных изменений в размере сердца или HW / BW на P28 (рис. 3E). Подобно вышеупомянутой одиночной трансгенной линии Add1 i2, мы обнаружили, что кардиомиоциты, положительные по фосфоаддуцину, имели неоднородный паттерн экспрессии, и мы наблюдали снижение экспрессии от P14 до P28 (фиг. 3F, вверху). Дальнейшее изучение саркомерного паттерна в фосфо-мимических положительных кардиомиоцитах показало цитоплазматическую экспрессию аддуцина с разборкой саркомера на P14, которая не сохранялась до кардиомиоцитов P28, которые показали нормальные саркомерные структуры (рис.3F внизу). Оценка разборки подтвердила, что хотя кардиомиоциты были разобраны на P14, они имели нормальную морфологию на P28 (рис. 3G), что напоминает паттерн, который мы отметили ранее с Add1i2 TG (рис. 2F). Это указывает на то, что избыточная экспрессия Add1 i2 или фосфомиметика Add1 i1 помогает расширить окно разборки саркомера, но не поддерживает этот паттерн до взрослого возраста. Хотя мы обнаружили сигналы ph4 в сердцах на P14, существенной разницы по сравнению с контролем нет (рис.S3A). Размер кардиомиоцитов также не отличается на P14 (рис. S3B).

Для стабилизации белка требуется сопутствующая экспрессия α- и γ-аддуцинов

Предыдущие отчеты в основном были сосредоточены на α-аддуцине, прежде всего потому, что он считается ограничивающим фактором в образовании гетеродимера с γ- или β-аддуцином или даже с α-аддуцином. гомодимер сам с собой ⁴³ . Подтверждение этому представлению исходит из элегантных исследований на моделях Add1 KO, которые предположили, что делеция α-аддуцина приводит к значительному снижению экспрессии γ-аддуцина.Однако в наших исследованиях невозможность разобрать саркомер в обоих одиночных Add1 TG после P14 поднимает важный вопрос: нужен ли γ-аддуцин для функции α-аддуцина in vivo? В наших исследованиях профиль эндогенной экспрессии аддуцинов показал, что экспрессия γ-аддуцина становится незначительной на P14 (рис. 1E). Это может указывать на то, что одиночные линии TG Add1 теряют способность разбирать саркомеры за пределами P14 вторично по отношению к возрастной потере Add3. Чтобы оценить стабильность Add1 по отношению к Add3, мы провели трансфекцию in vitro с помощью Add1 var.1 и вар. 2 при наличии или отсутствии Add3. Чтобы избежать перекрестной реакции антител к аддуцину между α-аддуцином и γ-аддуцином, мы трансфицировали клетки вариантами Add1 с тремя тандемными тегами FLAG на N-конце и / или плазмидами Add3 с тремя тандемными тегами TY1 на N-конце. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом (CHX) для ингибирования трансляции белка. Мы собирали клетки в нескольких временных точках после обработки и исследовали уровни белка с помощью WB. Интересно, что мы обнаружили, что как α-аддуцин i1, так и i2 становятся нестабильными после обработки CHX в отсутствие γ-аддуцина.Однако в присутствии γ-аддуцина стабильность изоформ α-аддуцина 1 и 2 значительно повышалась. (Рис. 4A). Этот результат указывает на то, что неспособность отдельных трансгенных линий вызывать выраженную разборку за пределами P14 может быть связана с отсутствием эндогенного γ-аддуцина в более поздние моменты времени.

A. Клетки HEK293T подвергали трансфекции варианта 1 (p-3xFlag-Add1i1) и варианта 2 Add1 (p-3xFlag-Add1i2) в присутствии или в отсутствие Add3 (p-3xTy1-Add3).Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом (CHX) для ингибирования трансляции белка. Клетки собирали через 0, 24 и 48 часов после обработки. (Слева) WB для отображения уровня белка. (Справа) Измерение относительного уровня белка ADD1i1 или Add1i2 (рассчитанного как FLAG по сравнению с GAPDH) в отсутствие или в присутствии ADD3. Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием одностороннего критерия t . Б. Схематическая диаграмма, показывающая конструкции для создания двойных трансгенных Add1 i2 и Add3. Обе экспрессионные конструкции управлялись промотором α-MHC. C. Результаты QPCR, показывающие уровень мРНК Add1i2 у двухмесячных двойных трансгенных животных с низкой экспрессией. D. (слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных клеток Add1 i2 / Add3 с низкой экспрессией. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. (Справа) Соотношение массы сердца к массе тела у WT и двойных трансгенных животных с низкой экспрессией. E. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у двухмесячных двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 (низкая экспрессия). n = 3 для каждой группы. F. Продольные виды, демонстрирующие структуру саркомеров двухмесячного дикого животного и двойного трансгенного аддуцина (низкая экспрессия). Изображения с большим увеличением области в рамке на изображении с низким увеличением показаны справа. Пунктирными линиями обозначена граница, на которой экспрессируется аддуцин. На вставке показаны саркомеры в частично разобранном виде (неорганизованные, но не отсутствующие саркомеры).Соответствующая экспрессия аддуцина указана стрелками. Масштабная линейка = 10 мкм. G. QPCR, чтобы показать уровень мРНК Add1i2 у двухмесячных двойных трансгенных животных с высокой экспрессией. H. (Слева) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных клеток Add1 i2 / Add3 с низкой экспрессией. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. (Справа) Соотношение массы сердца к массе тела у WT и двойных трансгенных животных с высокой экспрессией. I. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 в возрасте 1 месяца (высокая экспрессия).(n = 3 для каждой группы). J. (вверху) Репрезентативные изображения, демонстрирующие паттерн саркомеров у двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 возрастом 1 месяц (высокая экспрессия). (Внизу) Увеличенные изображения Вставки из панелей сверху. K. (слева) Двойной трансгенный ADD1 i2 / ADD3 с высокой экспрессией имеет свидетельства фрагментации кардиомиоцитов. (Справа) Большое увеличение области слева. Стрелки указывают на фрагменты саркомера, в которых совместно локализованы ADD1 и TNNT2. Масштабная линейка = 10 мкм. Масштабная линейка = 10 мкм.Данные представлены как среднее значение ± среднеквадратичное отклонение. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t .

Чтобы проверить эту гипотезу, мы создали кардиоспецифичную линию двойных трансгенных (dTG) мышей, коэкспрессирующих ген Add1 варианта 2 и ген Add3. Эта линия была получена путем инъекции двух независимых кассет экспрессии вместе (фиг. 4B). Из 35 учредителей 11 были положительными dTG. Иммуноокрашивание с помощью Add1 и Add3 подтвердило, что как α-, так и γ-аддуцин экспрессируются и совместно локализуются в кардиомиоцитах (рис.S4A). Основываясь на результатах qPCR уровней экспрессии Add1 i2, мы разделили линии на две группы в зависимости от уровня экспрессии (рис. 4C). Здесь важно отметить, что уровни эндогенной экспрессии Add1i2 на исходном уровне не обнаруживаются после P14, поэтому трансгенные линии показывают высокий уровень относительной экспрессии мРНК в сравнении.

Сначала мы исследовали линии с более низким уровнем экспрессии (dTG-L). Мы обнаружили, что морфология сердца и HW / BW в 2-месячном возрасте были аналогичны WT (рис.4D — репрезентативная нижняя линия выражения). Однако систолическая функция ЛЖ у мышей dTG-L была немного ниже, чем у WT (рис. 4E). Интересно, что мы обнаружили, что саркомерные структуры демонстрировали частичную разборку в кардиомиоцитах, если аддуцин был сверхэкспрессирован (Рис. 4F). Эта морфология выглядела как дезорганизованные саркомеры без четких полос (рис. 4F). Однако мы не наблюдали классической схемы разборки саркомера с зазором саркомера. Затем мы исследовали фенотип группы с высокой экспрессией аддуцина (dTG-H).Уровень мРНК группы с высокой экспрессией dTG-H был примерно в 1,6 раза выше, чем в группе с низкой экспрессией (фиг. 4G-репрезентативная линия с более высокой экспрессией). Срезы сердца с dTG-H в возрасте двух месяцев показали расширение желудочков (рис. 4H, слева) и увеличенное соотношение HW / BW (рис. 4H, справа). Эхокардиография показала заметно сниженную систолическую функцию ЛЖ с фракцией выброса левого желудочка (ФВЛЖ) 56% (рис. 4I). Мы наблюдали некоторую частичную разборку с фокальной локализацией TNNT2 на вставленном диске (рис.4J), хотя некоторые миоциты не демонстрировали значительной дезорганизации саркомеров (нижний ряд рис. 4J). Мы также наблюдали разрушение и фрагментацию кардиомиоцитов, что свидетельствует об увеличении гибели клеток (рис. 4K). что было дополнительно подтверждено тестом TdT-опосредованного мечения ник-концов dUTP (TUNEL) (рис. S4B). Затем мы оценили размер кардиомиоцитов с помощью окрашивания WGA и обнаружили, что dTG-H имеет значительно высокий процент малых кардиомиоцитов, более низкий процент кардиомиоцитов среднего размера и аналогичный процент крупных кардиомиоцитов (рис.S4C). Эти результаты показывают, что сопутствующая экспрессия Add3 и Add1 стабилизирует аддуциновый комплекс, и что как dTG-L, так и dTG-H демонстрируют частичную разборку саркомера, при этом dTG-H демонстрирует доказательства широко распространенной гибели кардиомиоцитов и подавления функции ЛЖ.

Генерация Add1 / Add3 фосфо-аддуцина с двойной трансгенной мышью Модель

Как отмечалось ранее, фосфо-одиночный TG T445E / T480E демонстрирует разрушение саркомера в сердце новорожденного, но не во взрослом сердце (рис. 3G), вероятно, из-за отсутствия Выражение Add3 во взрослом сердце.Учитывая улучшенную разборку кардиомиоцитов новорожденных с форсированной экспрессией фосфо-T445E / T480E, мы интегрировали дизайн фосфомиметического трансгенного с Add1i2 / Add3 dTG для создания нового кардиоспецифичного двойного трансгена, который коэкспрессирует фосфомиметик Add1 i2 T445E / T480E и WT Add3 (p-dTG) (рис. 5A вверху). Окрашивание H&E сердец этих мышей продемонстрировало, что взрослые сердца p-dTG больше, чем WT (фиг. 5A внизу), что было подтверждено измерением HW / BW (фиг. 5B). ФВЛЖ была умеренно снижена у двухмесячных мышей, но не претерпела значительных изменений у более молодых мышей (рис.5С). Изучение уровня мРНК аддуцина с помощью кПЦР подтвердило повышенный уровень экспрессии pAdd1i2 по сравнению с данными WT (фиг. 5D). Иммуноокрашивание Add1 и Add3 подтвердило, что как α-, так и γ-аддуцин экспрессируются и совместно локализуются в цитоплазме кардиомиоцитов (рис. S5A). Затем мы исследовали структуру саркомера путем окрашивания тропонином на P7, P14, P21 и через 2 месяца. Результаты демонстрируют, что кардиомиоциты p-dTG демонстрируют разобранные саркомеры, которые были очевидны во все моменты времени (рис. 5E I, ii, iii и iv), хотя разборка кажется более выраженной на ранних стадиях новорожденности.Фактически, большинство взрослых кардиомиоцитов демонстрировали частичную разборку, которая, по-видимому, была локализована в зоне, окружающей ядра и на периферии кардиомиоцитов, с полным очищением саркомеров в этих зонах. Исследование митотических маркеров кардиомиоцитов этих сердец показало увеличение количества кардиомиоцитов, положительных по киназе ph4 и aurora B, как на P21, так и через 2 месяца (рис. S5B и C), без изменения размера клеток (рис. S5D) или нуклеации (рис. . S5E).

A. (вверху) Схематическая диаграмма конструкций для создания двойных трансгенных фосфомиметиков Add1 i2 и Add3. Замена Glu на T445 и T480 имитирует фосфорилированную форму Add1 i2. Обе экспрессионные конструкции управлялись промотором α-MHC. (Внизу) H&E окрашивание контрольных и кардиоспецифичных двойных трансгенных фосфо-Add1 i2 / Add3. Образцы взяты из двухмесячных мышей. Масштабная линейка = 1 мм. B. Отношение массы сердца к массе тела у WT и фосфо-двойных трансгенных животных на P21 день и 2 месяца.(n = 3 для P21 и n = 5 в течение 2 месяцев). C. Эхокардиография (слева) и количественная оценка систолической функции левого желудочка по фракции выброса (справа) у P21 и двухмесячных двойных трансгенных ADD1 i2 / ADD3 (низкая экспрессия). (n = 3 для P21 и n = 5 в течение 2 месяцев). D. QPCR уровня мРНК Add1i2 у двухмесячных фосфо-двойных трансгенных клеток. E. Саркомерный паттерн двойных фосфо-трансгенных трансгенных клеток в точках P7 (i), P14 (ii), P21 (iii) и в возрасте 2 месяцев (iv). Изображения с большим увеличением области в рамке показаны справа от уменьшенного изображения.Пунктирные линии обводят границу, где аддуцин выражается вне саркомеров. Стрелки относятся к регионам с высоким уровнем экспрессии аддуцина. Обратите внимание на очистку саркомеров, в которых экспрессируется аддуцин. Масштабная линейка = 10 мкм. F. Крупномасштабный скрининговый анализ киназ выявил 7 кандидатов, которые потенциально фосфорилируют сайты T445 (слева) и T480 (справа). Скорректированные значения активности киназы (исходное значение минус образец пептидного фона, в имп / мин) с образцом пептида при одной концентрации в анализах пептидкиназы 245 Ser / Thr.Синий: киназа с образцом пептида; желтый: активность киназы без образца пептида. G. Анализ совпадения серин / треониновых киназ для проверки 3 киназ, NEK1, DCAM1 и IRAK4, выбранных из начального скринингового анализа киназ. Каждую киназу тестировали при трех концентрациях в трех повторностях. Эти результаты предполагают, что все киназы NEK1, DCAMKL2, IRAK4 демонстрируют зависящую от концентрации способность фосфорилировать образец пептида «T445» и «T480». H. Подтверждение паттерна эндогенной экспрессии IRAK4 (слева) и NEK1 (справа) в регенерирующем сердце новорожденных.Положительные сигналы обозначены стрелкой. I. (вверху) Схема кассет экспрессии IRAK4 в конструкциях AAV6. Сверхэкспрессия IRAK4 (зеленый) в NRVM вызывает разборку саркомера (окрашенного α-актинином, красный цвет) (i) и аддуцина pT445 (окрашенного pT445, красный цвет), перемещаемого из ядра в цитоплазму (ii). Стрелки указывают на то, что аддуцин экспрессируется в ядрах IRAK4-отрицательных клеток. Масштабная линейка = 10 мкм. J. (вверху слева) Схема кассет экспрессии IRAK4 в конструкциях AAV9. (Вверху справа) Схематическое изображение экспериментальной конструкции.(Внизу) AAV9-IRAK4-GFP вводили детенышам CD1 на P1, а сердца собирали на P15 для разделения и окрашивания. Сверхэкспрессия IRAK4 вызвала сильную разборку саркомеров (i) в кардиомиоцитах по сравнению с контролем из однопометников (ii).

Идентификация киназ, которые опосредуют фосфорилирование аддуцина в кардиомиоцитах

Учитывая критическую роль, которую фосфорилирование T445 / T480 играет в разборке саркомера, мы попытались определить механизм этого события фосфорилирования. Чтобы идентифицировать киназы, которые опосредуют фосфорилирование ассоциированных с мембраной сайтов T445 и T480, мы выполнили анализ киназного скрининга 245 киназ на фосфо-сайты T445 и T480.Первоначальный скрининг выявил семь потенциальных киназ с относительно высокими значениями активности по сравнению с фоном для фосфо-сайта T450 (таблица S1, фиг. 5F слева). Пептид T480 показал значительный ответ только на киназу VRK1 (рис. 5F справа). Затем мы выполнили вторичный скрининг для основных совпадений, описанных выше, с использованием анализа зависимости реакции от дозы HitConfirmation ™. Эти исследования подтвердили активность только трех киназ, а именно киназы 1, связанной с NIMA (NEK1), киназы 4, связанной с рецептором интерлейкина 1 (IRAK4), а также даблкортин-подобной и CAM-киназы 2 (DCAMKL2), которые проявляют зависимое от концентрации фосфорилирование T445. фосфозит (рис.5G). Эти киназы также показали увеличение доза-ответ на T480, хотя это оказалось менее заметным, чем у пептида T445. Эндогенное окрашивание кандидатов в киназы на сердце P4 подтвердило, что как IRAK4, так и NEK1 продемонстрировали четкую совместную локализацию с разобранными саркомерами (фиг. 5H).

Чтобы определить роль IRAK4 в индукции разборки саркомеров, мы создали конструкции IRAK4-AAV6 для сверхэкспрессии IRAK4 в кардиомиоцитах новорожденных in vitro. Интересно, что сверхэкспрессия IRAK4 привела к разборке саркомера (рис.5I, верхняя панель), что было связано с экспрессией фосфорилированного аддуцина pT445 в цитоплазме IRAK4-положительных клеток (нижняя панель). В IRAK4-отрицательных клетках аддуцин экспрессировался только в ядре (рис. 5I, нижняя панель со стрелками). Сверхэкспрессия NEK1 в NRVM не оказывала какого-либо явного эффекта на саркомеры или фосфорилирование аддуцина (данные не показаны).

Для оценки структурных изменений саркомера при сверхэкспрессии IRAK4 in vivo, мы создали вирус AAV9-IRAK4.Мы вводили этот вирус в сердца новорожденных мышей в точке P1 и собирали сердца в точке P15, момент времени, значительно превышающий выход из клеточного цикла кардиомиоцитов новорожденных. Иммуноокрашивание срезов сердца продемонстрировало, что клетки со сверхэкспрессией IRAK4 демонстрировали заметную разборку саркомеров (фиг. 5J). Эти результаты показывают, что IRAK4 фосфорилирует аддуцин in vitro и in vivo и вызывает разборку саркомера. В совокупности наши результаты идентифицируют гетеродимер аддуцина в качестве важного регулятора разборки саркомера кардиомиоцитов во время митоза кардиомиоцитов

Идентификация партнеров по связыванию комплекса аддуцина в регенеративных и нерегенеративных точках времени

Наши результаты до сих пор предполагают, что фосфорилированный гетеродимер аддуцина опосредует разборку реоцитомии кардиомиоцитов. .Однако, учитывая, что аддуцины ранее не исследовались на сократительных клетках, партнеры связывания аддуцина в кардиомиоцитах неизвестны. Чтобы идентифицировать белки, которые взаимодействуют с аддуцином в кардиомиоцитах, мы выполнили MS-анализ экстрактов сердечных белков P1 и P7 с использованием антитела ADD1 в качестве приманки (стратегия, аналогичная фигуре 1A, но с использованием антитела ADD1 вместо антитела Tnnt2). Мы обнаружили, что многочисленные мишени, которые были идентифицированы при начальном анализе Tnnt2 с понижением, также были обнаружены с помощью α-аддуцина (рис.6A), предполагая, что α-аддуцин связывается с саркомерными белками в раннем постнатальном сердце.

A. В таблице перечислены выбранные белки, ассоциированные с ADD1, идентифицированные с помощью Co-IP / MS. * PSM: соответствие пептидного спектра. Количество спектров, присвоенных пептидам, которые способствовали заключению о белке. ** MIC Sin: нормализованная статистика спектрального индекса для белка для конкретной группы. Рассчитывается по интенсивности ионов фрагментов в каждом спектре, относящемся к конкретному белку.*** Соотношение: количественное соотношение белка между группами, полученное на основе значения MIC Sin. Масштабная линейка = 10 мкм. Б . Схема процесса очистки коротких и длинных комплексов аддуцинов. C. Схематический чертеж показывает блок-схему Co-IP / MS с помощью раскрывающегося списка очищенного комплекса аддуцина D. Гистограмма для канонических путей, обогащенных каждым образцом. Ось X показывает преобразованное скорректированное значение p (процедура Бенджамини-Хохберга) перекрытия между белками образца и путями.FDR относится к уровню ложного обнаружения. * P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001; Статистическая значимость рассчитывалась с использованием двустороннего критерия t . E. Сетевой график белков цитоскелета из анализа методом pull down взаимодействует с adducin_long или adducin_short в разные моменты времени (P1 и P21). Различная цветовая маркировка, выделяющая общие и уникальные белки среди групп образцов. Красный цвет представляет четыре группы образцов в выпадающем анализе. Желтым цветом обозначены белки, общие для всех групп.Зеленый цвет обозначает белки, общие только для двух или трех групп. Синий представляет белки, уникальные для каждой группы. F. Анализ близости лигирования (PLA) для изучения прямого взаимодействия между аддуцином (pT445) и саркомерными белками (α-актинин 2) в ткани сердца P4. Красные точки (стрелки) — это флуоресцентные сигналы, указывающие на тесное взаимодействие между двумя антигенами. Образцы включают взаимодействие между α-актинином и тропонином Т (в качестве положительного контроля) или фосфо-аддуцином (pT445) и α-актинином. Масштабная линейка = 10 мкм. G. Иммуно-ЭМ изображение, показывающее субклеточное расположение фосфо-аддуцина в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами в сердцах новорожденных после ИМ на 3-й день после операции. Два красных прямоугольника на левом изображении увеличены справа. (i) аддуцин локализован на z-дисках. (ii) фосфо-аддуцин в значительной степени локализован на z-дисках, связанных с плазматической мембраной в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами. Красные стрелки указывают местонахождение аддуцина.

Поскольку аддуцин действует как дуплекс (α / y в кардиомиоцитах), использование антитела ADD1 в качестве приманки может не повторить его характер связывания.Кроме того, хотя вышеупомянутое исследование на основе антител может работать в сердце новорожденного, отсутствие значимой экспрессии аддуцина в сердце взрослого человека не позволяет провести это исследование у взрослых. Чтобы лучше понять, почему даже в dTG-сердцах разборка сердец, по-видимому, более выражена у новорожденных по сравнению с кардиомиоцитами взрослых, мы провели исследование с использованием очищенного комплекса α / γ-аддуцина в качестве приманки с экстрактами сердца P1 или P21. Мы клонировали оба гена Add1 и Add3 в плазмиду pETDuet, которая совместно экспрессирует две ORF вместе и естественным образом образует дуплекс в клетках.6xHis-метку клонировали на N-конце Add1 для облегчения очистки и анализа с пониженным содержанием. Чтобы определить, связывает ли длинная (ADD1i1 / ADD3) и короткая (ADD1 i2 / ADD3) формы аддуцина саркомерные белки по-разному во время регенеративного окна по сравнению с более поздними временными точками, мы создали две плазмиды для ко-экспрессии ADD1i1 / ADD3 (длинная форма) или ADD1i2 / ADD3 (краткая форма) соответственно. Очищенные белки инкубировали с лизатами сердца в течение ночи, затем связывали с гранулами Ni-NTA, чтобы аддуцин и связанные белки могли прикрепиться к смоле.Мы также включили отрицательный контроль, в котором лизаты сердца были смешаны с гранулами Ni-NTA. Фиг. 6B и представляют собой схемы очистки белка и Co-IP с использованием очищенного белкового комплекса в качестве приманки. Затем образцы и соответствующие им контроли анализировали масс-спектрометрией в форме log2 (образец / контроль) для расчета кратного изменения. Изменения складок более 1,5 учитывались для дальнейшего анализа пути изобретательности. Фиг.6D представляет собой гистограмму статистически значимых канонических путей, обогащенных образцом.Интересно, что единственный путь с усиленной регуляцией на P1 по сравнению с P21 — это сигнальный путь актинового цитоскелета (два других пути, связанных с митохондриями, были подавлены на P1 по сравнению с P21). Мы также создали сетевой график, чтобы показать, как белки сигнального пути цитоскелета взаимодействуют с длинными или короткими аддуцинами в разные постнатальные моменты времени (P1 и P21) (рис. 6E). Мы также обнаружили, что как длинная, так и короткая формы аддуцина связывают исключительно специфические саркомерные белки в сердце P1, но не в P21.В частности, мы обнаружили, что комплекс аддуцина связывает сердечный актинин (ACTN2) только в сердце P1, но не в сердце P21. Оглядываясь назад, возможно, это не должно было вызывать удивления, учитывая, что актинины являются каркасными белками, которые принадлежат к суперсемейству спектринов ⁴⁴ , а спектрин является известным партнером по связыванию аддуцинов в неконтрактильных клетках. В кардиомиоцитах альфа-актинин локализован на Z-дисках, где он важен для регуляции саркомерной организации актина и сборки саркомера.Следовательно, потенциальное взаимодействие между аддуцином и альфа-актинином может быть механизмом разборки саркомера во время митоза кардиомиоцитов. Чтобы оценить взаимодействие между аддуцином и α-актинином2, мы провели анализ лигирования методом близости (PLA) (Duolink®, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) (рис. 6F) с использованием антитела против фосфо T445 в сердце новорожденного. В качестве положительного контроля мы использовали связывание TNNT2 с α-актинином 2 в анализе PLA. Или результаты показывают, что аддуцин pT445 больше ассоциирует с ACTN2 in vivo в сердце новорожденного.Кроме того, мы использовали электронную микроскопию Immunogold (Immuno-EM) для определения субклеточной локализации аддуцина pT445 в неонатальных кардиомиоцитах с разобранными саркомерами, что продемонстрировало, что аддуцин локализован на z-дисках саркомеров (где также находится альфа-актинин). локализованный) (рис. 6 Ги). Аддуцин pT445 также, по-видимому, связан с разобранными саркомерами в клеточной коре в ассоциации с плазматической мембраной (рис. 6Gii).

Обсуждение

В последние годы многочисленные исследования выявили механизмы регуляции клеточного цикла кардиомиоцитов.Эти механизмы включают различные пути, включая прямые регуляторы клеточного цикла, факторы транскрипции, микро-РНК, Lnc-РНК, а также немиоцитарные факторы, включая, среди прочего, внеклеточные матричные, иммунологические факторы и факторы окружающей среды. Однако специфические для поперечно-полосатых мышц механизмы, которые регулируют организацию саркомеров во время митоза кардиомиоцитов, остаются плохо изученными. В текущем отчете мы демонстрируем, что белок цитоскелета аддуцин регулирует разборку саркомеров во время митоза кардиомиоцитов.В неконтрактильных клетках предыдущие исследования идентифицировали механизмы, которые регулируют сборку цитоскелета и димеризацию актиновых листов. Напр., Цитоскелетный регуляторный белок аддуцин является основным регулятором связывания актина и взаимодействия актин-спектрин ^29,30 . Семейство аддуцинов состоит из 3 членов, а именно α-, β- или γ-аддуцинов. Полностью собранный аддуцин состоит из гетеродимеров гомологичных альфа- и бета- или гамма-субъединиц. Несмотря на известную роль аддуцина в сборке актина в неконтрактильных клетках, его роль в сократительных клетках полностью неизвестна.

Наши результаты основаны на протеомном скрининге белков, которые дифференциально связываются с TNNT2 в момент ранней регенерации сердца новорожденной мыши. Хотя некоторые белки цитоскелета, по-видимому, по-разному связаны с TNNT2 в этот ранний момент времени, мы сосредоточились на аддуцине, учитывая его известную регулирующую роль цитоскелета в неконтрактильных клетках. Мы приводим несколько линий доказательств, подтверждающих связь аддуцина с саркомерными белками; Во-первых, иммуноокрашивание демонстрирует, что α-аддуцин локализован в цитоплазме и мембране только в кардиомиоцитах с разобранными саркомерами.Во-вторых, CoIP с использованием антитела ADD1 или очищенного комплекса α / γ-аддуцина предполагает возможную ассоциацию аддуцина с саркомерными белками, в частности α-актинином. В-третьих, мы идентифицировали ассоциированную с мембраной фосфо-изоформу Add1, которая связывает α-актинин с помощью пробы лигирования близости и колокализуется с ассоциированными с мембраной саркомерами с помощью иммуно-электронной микроскопии, меченных частицами нанозолота. Эти результаты показывают, что Add1 является цитоскелетным белком, связанным с саркомером, в кардиомиоцитах.

Важно отметить увеличение функциональных исследований in vitro и in vivo, чтобы продемонстрировать, что форсированная экспрессия аддуцина вызывает разборку саркомера.Мы показали, что экспрессия нескольких изоформ аддуцина вызывает разборку саркомеров в первичных неонатальных кардиомиоцитах в культуре. Кроме того, как одиночный фосфомиметик TG Add1 i2, так и Add1 i1 обнаруживают негомогенный паттерн экспрессии, который приводит к расширению окна разборки саркомера до P14, но не до зрелого возраста. Анализы стабильности белков продемонстрировали, что совместная экспрессия Add1 или Add3 необходима для стабильности обоих белков, и это было подтверждено in vivo на линиях dTG, которые демонстрировали стабильную экспрессию в зрелом возрасте.Мы также демонстрируем, что хотя нефосфомимические линии dTG демонстрируют стойкую экспрессию аддуцина, это не привело к выраженной разборке саркомера, в то время как та же самая конструкция dTG с конститутивно активным фосфомимиком T445 / T480 привела к разборке саркомера, которая сохранялась до взрослой жизни.

Одним из важных ограничений текущих результатов является неполная разборка, которую мы наблюдали во взрослых кардиомиоцитах даже в фосфо-мимических dTG. Хотя мы отметили полную разборку в раннем постнатальном периоде, большинство взрослых кардиомиоцитов демонстрировали частичную разборку, которая, по-видимому, локализовалась в зоне, окружающей ядра, и на периферии кардиомиоцитов с полным очищением саркомеров в этих зонах.Эта частичная разборка, вероятно, объясняет отсутствие заметного снижения систолической функции ЛЖ в этой линии ТГ. Механизм этого дифференциального эффекта аддуцина на раннем постнатальном периоде по сравнению со взрослыми саркомерами неясен, но может быть связан с изменениями фенотипа саркомеров с возрастом. Чтобы ответить на этот вопрос, мы использовали очищенный белковый комплекс альфа (короткая или длинная изоформа) -гамма-аддуцин для выявления партнеров по связыванию в сердце ранних новорожденных и подростков. Результаты демонстрируют, что комплекс аддуцина по-разному связывается с белками цитоскелета в зависимости от постнатального возраста.В частности, как короткие, так и длинные формы комплекса аддуцина, по-видимому, избирательно связываются со специфическим для сердца α-актинином (ACTN2) в сердце P1, но не в сердце P21. PLA и иммуноголд-EM подтверждают мнение, что аддуцин ассоциируется с α-актинином в z-дисках. Хотя ранее не было показано, что аддуцин связывает α-актинин, α-актинин принадлежит к суперсемейству спектринов, и спектрин является известным партнером по связыванию аддуцина в неконтрактильных клетках. Учитывая известную роль α-актинина в прикреплении актина к z-дискам кардиомиоцитов, будущие исследования должны изучить потенциальную роль α-актинина в регуляции разборки саркомера ниже аддуцина.В совокупности эти результаты идентифицируют важный регуляторный механизм разборки саркомеров, который связывает организацию цитоскелета с регуляцией клеточного цикла в кардиомиоцитах млекопитающих и дает представление о проблемах митоза в активно сократительных клетках.

МЕТОДЫ

Экспериментальные животные

Все протоколы были одобрены Комитетом по уходу и использованию институциональных животных Юго-западного медицинского центра Техасского университета. Во всех экспериментах использовались как самцы, так и самки мышей, чтобы гарантировать соответствие возраста и пола.Здоровых мышей выбирали случайным образом из колонии для всех экспериментов. Мышей CD1 использовали для гистологических исследований дикого типа с окрашиванием и инъекциями AAV9. Количество животных, используемых для каждого эксперимента, составляло от 3 до 5.

Коиммунопреципитация (Co-IP) и масс-спектроскопия (MS)

Мышиные сердца в двух разных точках времени регенерации (n = 3 для каждой), через 3 дня после Инфаркт миокарда (MI) на P1 (P1MI) и через 3 дня после MI на P7 (P7MI) собирали и лизировали в буфере для лизиса IP: 2.5 мМ Трис, pH 7,4, 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1% NP40, 5% глицерин. Комбинация ингибиторов протеиназы и ингибиторов фосфатазы включалась постоянно. 5 мкг мышиного моноклонального антитела TNNT2 (Thermo Scientific) использовали для связывания с 1 мг переваренных образцов сердца при осторожном покачивании при 4 ° C в течение ночи. К смеси добавляли гранулы агарозы с белком A (Calbiochem) и продолжали инкубацию при осторожном покачивании в течение 3 часов при 4 ° C. После микроцентрифугирования в течение 30 секунд при 4 ° C осадки пять раз промывали 1 мл буфера для лизиса IP.Конечные осадки ресуспендировали в 25 мкл буфера для образцов 2XSDS и наносили на гель SDS-PAGE (4-20%). Когда образцы входили в растворяющийся гель примерно на 5-10 мм, анализ останавливали и гель окрашивали кумасси синим. Окрашенную область разрезали и нарезали кубиками размером 1 мм. Затем образцы подвергали масс-спектрометрическому анализу для идентификации белка. Ко-IP с антителом к ​​аддуцину (H-10, номер по каталогу sc-25731 Santa Cruz) проводили с использованием того же протокола.

Гистология и иммуноокрашивание

Ткани сердца фиксировали в 4% параформальдегиде (PFA) / PBS в течение ночи при комнатной температуре, а затем обрабатывали либо для парафина, либо для криогенной заливки.Окрашивание H&E проводили в соответствии со стандартными процедурами в центре гистологии ядра UTSW на парафиновых срезах. Для криозакрепления фиксированные ткани инкубировали в 30% сахарозе / PBS при 4 ° C до погружения тканей. Ткани помещали в замораживающую среду, замораживали при -80 ° C и готовили для криосрезов. Иммуноокрашивание проводили согласно предыдущему описанию ⁴⁵ . Вкратце, после извлечения антигена срезы пермеабилизировали и блокировали 10% сывороткой / 0,3% Triton-X100 / PBS в течение 20 минут при комнатной температуре.Затем образцы инкубировали в течение ночи при 4 ° C с первичными антителами. Разведения первичных антител и вторичных антител (ThermoFisher) при инкубации варьировались в зависимости от экспериментов. После промывки PBS срезы окрашивали DAPI (ThermoFisher D1306) и устанавливали с помощью VECTASHIELD (Vector Laboratories h2700) для визуализации.

Антитела

Первичные антитела: антитела к тропонину T, сердечная изоформа Ab-1, клон 13-11 (Thermo Scientific MS-295-P1, 1: 100), антисаркомерный α-актинин (Abcam ab68167), анти- фосфогистон h4 Ser10 (Millipore 06-570, 1: 100), антитело против α-аддуцина (1B1, банк гибридом исследований развития, 1:50, для рисунка 1F), антитело против α-спектрина (3A9, гибридома исследований развития Банк, 1:50, для Фигуры 1F), антитело против Филамина 1 (E-3, sc-17749, Санта-Крус, 1: 100, для Фигуры 1F), антитело против α-аддуцина (фосфо T445) (Santa Cruz sc16738 , для WB и окрашивания, 1: 100), N-концевое антитело против α-аддуцина (Abcam ab151474, для Add1i2 WB и TG), антитело против α-аддуцина (Santa Cruz H-100 sc-25731, для WT WB мыши и окрашивание на трансгенном pTRE-Add1 T445 / T480E, 1: 100), антитело против Y-аддуцина (Santa Cruz sc-365177, клон G-2, для WB и окрашивания, 1: 100), анти-α-аддуцин (фосфо S726) антитело (Abcam ab53093, 1: 100.Обратите внимание, что фосфозит S726 у человека расположен на 724 у мыши. Поэтому мы использовали S724, относящийся к этому сайту в статье), антитело против α-аддуцина фосфо S355 (Abmart 20592-1NB-3 / C63-S, 1: 100, для WB и двойных трансгенных), антитело против FLAG (M2 , F3165, Sigma-Aldrich 1: 100). Антитело легкой цепи миозина 2 (ptglab, 10906-1-AP, для окрашивания), антитело против MYH6 (Sigma-Aldrich, HPA001349).

Imaging

Флуоресцентные изображения тканей или клеток были получены с помощью Leica DM2000, микроскопа Nikon Eclipse Ni или конфокального микроскопа Nikon A1R и обработаны с помощью Photoshop CS3 для создания объединенных изображений с разными цветами.Для подсчета размера клеток кардиомиоцитов изображения образцов, окрашенных WGA, анализировали с помощью программного обеспечения Fiji.

Вестерн-блоттинг

Вестерн-блоттинг выполняли с использованием стандартных протоколов. Антитела, используемые в WB, представляют собой антитело против α-аддуцина (Santa Cruz H-100, sc-25731, 1: 500), антитело против γ-аддуцина (Santa Cruz H-60, sc-25733, 1: 500), -FLAG-антитело (Genescript # A00187, 1: 3000), антитело против Ty1 (Diagenode, # C15200054, 1: 3000) и пероксидаза AffiniPure осла против кроличьего IgG (Jackson ImmunoResearch 711-035-152, 1: 20 000), пероксидаза IgG козы антимыши AffiniPure (Jackson ImmunoResearch 115-035-003, 1: 20 000) были обработаны LI-COR.

Выделение желудочковых миоцитов новорожденных крыс (NRVM) и культивирование клеток

Кардиомиоциты были выделены из левого желудочка 1-2-дневных крыс Sprague-Dawley в соответствии с протоколом из набора для изоляции (Cellutron Life Technologies, cat # nc- 6031). Затем миоциты помещали на покровные стекла, покрытые ламинином (Life tech # 23017-015) при плотности 1250 клеток / мм в среде DMEM: M199 (3: 1), содержащей 10% лошадиной сыворотки, 5% FBS и 1% пенициллина / Стрептомицин. 100 мкмоль / л 5’-бром-2’-дезоксиуридина включен для подавления роста фибробластов.Через 24 часа после прикрепления клеток замените питательную среду.

Выделение кардиомиоцитов

Выделение кардиомиоцитов из сердец взрослых мышей было описано ранее (Mahmoud et al., 2013). Вкратце, взрослые сердца были взяты только что без предсердий. Образцы фиксировали в 4% PFA в течение ночи при 4 ° C. Ножницы разрезают область аорты для лучшего проникновения. После непродолжительной промывки в PBS для удаления PFA сердца инкубировали со свежей коллагеназой D (2,4 мг / мл, Roche) и B (1,8 мг / мл, Roche) с добавлением 1% пенициллина / стрептомицина в течение 12 часов при 37 ° C, используя встряхиватель встряхивающий.Супернатанты собирали и хранили при 4 ° C. После нескольких циклов переваривания до исчезновения видимой ткани супернатанты объединяли и фильтровали через фильтр с нейлоновой сеткой 160 мкм. Конечные клетки собирали центрифугированием при 1000 об / мин в течение 5 минут. Осадки клеток ресуспендировали в свежем PBS с добавлением 1% P / S. Для подсчета нуклеации по крайней мере 300 кардиомиоцитов на образец были количественно определены с помощью конфокальной визуализации z-стека.

Плазмиды и мутагенез

Вариант 1 транскрипта кДНК мыши Add1 был приобретен у Origene (№ по каталогу MR210357).Ген Add1 амплифицировали и субклонировали в pUC19 для точечных мутаций с помощью набора GeneArt Site-Directed Mutagenesis Plus (Life Technologies, номер по каталогу A14604). Вариант 2 Add1 клонировали из кДНК библиотеки мыши P1 Mouse Irak4. был куплен у Ориджена (MR207322). Праймеры, используемые для создания сайт-направленного мутагенеза или других клонов, перечислены в приложениях.

Производство и очистка рекомбинантных векторов AAV

Плазмиды pTR-GNP для создания кассеты экспрессии AAV, pDP6rs и pDG9 для упаковки AAV6 и AAV9, соответственно, являются подарками от Dr.Роджер Хаджар (Медицинская школа Маунт-Синай, Нью-Йорк). Мы использовали безвирусную систему упаковки AAV на основе двух плазмид для производства вирусов. Вирусы были продуцированы полиэтиленимином (Polysciences, Warrington, PA) -опосредованной трансфекцией в клетки HEK293T (эмбриональная почка человека, ATCC, # CRL-11268, Manassas, VA). После трансфекции в течение 72 часов клетки собирали центрифугированием. После трех циклов замораживания и оттаивания лизаты клеток обрабатывали универсальной нуклеазой Pierce для лизиса клеток (Pierce, Waltham, MA).Неочищенные вирусные суспензии подвергали двум циклам центрифугирования в градиенте плотности йодиксанола. Конечные концентрированные вирусы диализовали против PBS и титровали количественной ПЦР в реальном времени.

Культура клеток, трансфекция и обработка циклогексимидом

Клетки HEK293T трансфицировали p-3xFlag-Add1i1 и p-3xFlag-Add1i2 в присутствии или в отсутствие плазмиды p-3xTy1-Add3. Через 24 часа после трансфекции клетки обрабатывали 80 мкМ циклогексимидом. Клетки собирали через 0, 24 и 48 часов после обработки.Белки экстрагировали и измеряли концентрацию. 10 мкг общих белков разделяли с помощью SDS-PAGE и позже переносили на нитроцеллюлозную мембрану для WB. Антитело против FLAG использовали для обнаружения экспрессии α-аддуцина. Антитело против Ty1 использовали для обнаружения экспрессии γ-аддуцина. GAPDH использовался в качестве внутреннего контроля.

Получение трансгенных мышей

ORF конститутивно активной формы Add1i1 (T445 / T480E) субклонировали в вектор ДНК pTRE-Tight для создания плазмиды pTRE-T445 / T480E.pTRE-T445 / T480E линеаризовали с помощью PvuI и микроинъектировали в оплодотворенные ооциты полученным трансгенным мышам с использованием стандартных процедур ¹⁷ . Чтобы вызвать сверхэкспрессию Add1 в кардиомиоцитах, мышей pTRE-T445 / T480E скрещивали с мышами αMHC-tTA. Мышей соответствующего возраста αMHC-tTA использовали в качестве контроля. кДНК Add1 i2 синтезировали непосредственно из сердца мыши P1 CD-1. Область ORF субклонировали в вектор на основе pBluescript, промотор которого был заменен промотором αMHC для специфической экспрессии в кардиомиоцитах ⁴⁶ .Плазмиду αMHC-Add1i2 линеаризовали с помощью EcoRV и микроинъектировали в оплодотворенные ооциты созданным трансгенным мышам. Трансгенных мышей скрестили с C57B6N / J. кДНК Add3 была приобретена у Genecript (GenScript Bioteh, NJ). ORF субклонировали в тот же вектор, что и αMHC-Add1i2. Для создания двойных трансгенных образцов Add1i2 / Add3 линеаризованную ДНК αMHC-Add1i2 и αMHC-Add3 микроинъектировали в оплодотворенные ооциты с использованием стандартных процедур. Для создания двойного трансгенного фосфо-аддуцина мутантный Add1 i2 T445E / T480E субклонировали под промотором αMHC.Линеаризованную ДНК αMHC-Add1i2 T445E / T480E и αMHC-Add3 микроинъектировали в оплодотворенные ооциты. Как двойные трансгенные, так и фосфо-двойные трансгенные были скрещены с C57B6N / J для стратегии разведения.

Иммуно-электронная микроскопия

Чтобы пометить антитело аддуцина нанозолотыми частицами, мы использовали золотое мечение антитела альфа-аддуцина фосфо-Т445. Процедура маркировки соответствовала протоколу J.R.Thorpe ⁴⁷ .

Proximity Ligation Assay

Proximity Ligation Assay (Duolink, # DUO92101, Sigma) выполняли в соответствии с инструкциями.Циросрезы, полученные через 3 дня после образцов P1MI, использовали для всех исследований. Этапы извлечения антигена и пермеабилизации были такими же, как и при стандартной процедуре иммуноокрашивания. Первичные антитела TNNT2 и α-актинин использовали в качестве положительного контроля.

TUNEL Assay

Криосрезы окрашивали на тропонин Т, как указано выше в разделе «Гистология и иммуноокрашивание». После инкубации с соответствующим вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 555 (Invitrogen), окрашивание TUNEL проводили в соответствии с рекомендациями производителя (набор для определения гибели клеток in-situ, Fluorescein, Roche).Все окрашивание проводили на 3 сердцах на группу, по 3 среза на сердце.

Анализ скрининга серина / треонина

Мы синтезировали два биотинилированных пептида с сайтами фосфорилирования в середине последовательностей. Они предназначены для «T445», KQQREK T RWLHSG и «T480», EDGHR T STSAVP (символы, отмеченные красным, представляют собой сайты фосфорилирования). Скрининговый анализ киназ проводился ProQinase GmbH (Фрайбург, Германия). Первоначальный скрининговый анализ определяли при концентрации 1 мкМ в одном экземпляре в радиометрическом анализе ( ³³ PanQinase® Activity Assay) на панели 245 Ser / Thr киназ с использованием планшетов FlashPlate® PLUS, покрытых стрептавидином (PerkinElmer, Бостон, Массачусетс).Реакционные смеси вносили пипеткой в ​​96-луночные V-образные полипропиленовые микротитровальные планшеты. Каждый аналитический планшет содержит одну лунку, которая не содержит фермента и используется в качестве фона. Для оценки результатов параллельно определяли фоновый сигнал каждой киназы (без биотинилированного пептида). Для анализа подтверждения совпадения семь киназ, выбранных из первого скринингового анализа, тестировали с образцами пептидов в трех повторностях при трех концентрациях (1, 0,5, 0,25 мкМ).

Экспрессия и очистка белка

Полноразмерная изоформа 1 ADD1 мыши и ADD3 или ADD мыши! Изоформа 2 и ADD3 были субклонированы в первую и вторую открытую рамку считывания (ORF) вектора pETDuet соответственно.mADD1 имеет метку 6xHis на своем N-конце, за которой следует сайт узнавания протеазы TEV, и плазмида была трансформирована в клетки Rosetta (DE3) pLysS (Novagen). Целевой белок экспрессировали в культурах, выращенных в среде для аутоиндукции при 18 ° C в течение ночи ⁴⁸ . Культуру собирали и лизировали через French Press в буфере для лизиса (20 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 0,5 мМ DTT и с добавлением ингибиторов протеаз). Лизат центрифугировали и супернатант наносили на аффинную колонку Ni-NTA (Qiagen).Белки элюировали элюирующим буфером (20 мМ Трис (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 2 мМ DTT и 250 мМ имидазол (pH 8,0)). Элюат дополнительно очищали ионообменной хроматографией (HiTrapSP) с последующей гель-фильтрационной хроматографией (GF_Superose6). Пиковые фракции собирали и концентрировали до 2-3 мг / мл для последующих экспериментов.

Co-IP очищенного аддуцина 1/3

Очищенный дуплекс аддуцина длинной формы ADD1 i1 / ADD3 и короткой формы дуплекса ADD1 i2 / ADD3 использовали в качестве приманки в анализе методом вытягивания вниз.Свежие сердца P1 и P21 лизировали в IP-буфере: 50 мМ Nah3PO4, 150 мМ NaCl, 10 мМ имидазол, 0,05% Твин 20, pH 8,0. Комбинация ингибиторов протеиназы и ингибиторов фосфатазы включалась всегда. 2 мкг очищенного дуплекса аддуцина (короткого или длинного) использовали для связывания с 800 мкг переваренных образцов сердца при осторожном покачивании при 4 ° C в течение ночи. Гранулы агарозы Ni-NTA промывали 3 раза буфером для лизиса. Затем в смесь добавили шарики. Инкубацию продолжали при осторожном покачивании в течение 1 часа при 4 ° C.После микроцентрифугирования в течение 30 секунд при 4 ° C осадки 5 раз промывали 1 мл IP-буфера для лизиса. Буфер для лизиса IP был дополнен 5 мМ иммидазолом в первые 3 раза; с 20 мМ имидазолом последние 2 раза. Гранулы Ni-NTA, связывающиеся с лизатами сердца P1 или P21 при 4 ° C, 1 час были включены в качестве отрицательного контроля.