Сценарий крио шоу: Элементы крио-шоу в шоу мыльных пузырей

Содержание

Криошоу

Крио шоу. Скоро у вас знаменательное событие: свадьба, юбилей, корпоратив, день рождение у вас или вашего ребенка, но вы не знаете, чем удивить ваших гостей. Праздничное агентство в Белгороде «Фокус-Покус» предлагает непревзойденное шоу низких экстремальных температур под названием «Крио-шоу». Что же это за шоу, и почему оно экстремальное, сейчас поговорим подробней. Крио-шоу это работа с жидким азотом. Его температура минус 196 градусов. Крио-шоу это конечно же интерактивная программа, участникам которой предстоит на время перевоплотиться в самых настоящих ученых-экспериментаторов под руководством наших опытнейших и самых веселых

профессоров Мегамозга и Извилинки , будет интересна не только детям, но и взрослым. 

Мы докажем опытным путем, что наука – это весело и очень интересно. Главное, не волнуйтесь – все эксперименты абсолютно безопасны даже для самых маленьких экспериментаторов. В программе наши умелые профессора Мегамогз и Извилинка ярко и увлекательно демонстрируют законы физики и химии в действии. На ваших глазах будут эксперименты, а именно: разбивание цветов, замораживания фруктов и овощей взрывы, забивание гвоздей замороженным бананом, клубы густого азотного пара, питье жидкого азота.  А так же всех зрителей ждет
крио-кухня
: замороженный попкорн и самое сливочное мороженое в мире, которое на ваших глазах сделают наши профессора из праздничного агентства «Фокус-Покус».  Если вы сомневаетесь и думаете, что это опасно, мы вас разубедим. Жидкий азот – бесцветная нетоксичная жидкость. Не взрывоопасен и не ядовит. А получают жидкий азот из воздуха. Для этого воздух сначала охлаждают, сжижают, а жидкий воздух подвергают перегонке. Жидкий азот нередко демонстрируется в кино в качестве вещества, способного мгновенно заморозить достаточно крупные объекты. Это широко распространённая ошибка. Даже для замораживания цветка необходимо достаточно продолжительное время. Ну, вот мы вас убедили, что жидкий азот абсолютно безопасен. Так что не раздумывайте и заказывайте на любой праздник самое удивительное «Крио-шоу» от которого останутся в восторге, как дети, так и взрослые. И конечно же вас покорят наши профессора Мегамозг и Извилинка и продемонстрируют самые невероятные эксперименты с жидким азотом. Ваш праздник будет самым незабываемым. Праздничное агентство «Фокус-Покус» это команда профессионалов. Самые опытные
аниматоры
, которые с легкостью находят подход к детям, доброжелательные менеджеры, креативные сценаристы, которые индивидуально разрабатывают сценарии к каждому празднику. Так, что не раздумывайте и звоните прямо сейчас.

Вы хотите заказать праздник ? Тогда звоните !

Агентство по организации праздников "ФОКУС-ПОКУС" г. Белгород qr-code e-mail

Крио шоу для детей на день рождения и праздник – Заказать по лучшей цене в Москве

Крио шоу с сухим льдом и азотом в Москве лучший подарок детям на праздник


Самое фееричное научное крио или азотное шоу для детей и взрослых по лучшей цене: индивидуальный подход, авторские сценарии и талантливые аниматоры.

Крио шоу на заказ: сюрприз, который удивит всех

Фантастическое и захватывающее, эффектное и познавательное, а главное полностью интерактивное и абсолютно безопасное крио шоу понравится всем. Предлагаем интересные авторские программы, которые удивят и малышей, и даже взрослых.

Азот шоу— это удачный выбор на день рождения, на юбилей, на выпускной, на корпоратив, на свадьбу, мероприятие любой тематики и масштаба. С каждой выездной программой мы предоставляем гарантии того, что гости и виновники торжества будут в восторге.

Для действа используется жидкий азот, и все присутствующие смогут стать не только зрителями, но и активными экспериментаторами. Все материалы и реквизит на 100% безопасны, наслаждайтесь чудесами науки в интерактивном формате, изучайте уникальные особенности азота и его взаимодействие с другими веществами так, как вам еще не показывали.

Вы увидите представление наших мастеров, аниматоров с множеством фантастических опытов: мгновенная заморозка, превращение мягких предметов в настолько твердые, что ими легко можно забить гвоздь, а еще впечатляющие взрывы, дыхание дракона, необычное, очень вкусное мороженное и многое другое.

Программы, их длительность и сценарии разные, с возможностью индивидуальной корректировки, поэтому заказать крио шоу именно под ваш праздник легко.

Интересные научные эксперименты с жидким азотом

Популярность азотного крио шоу оправдана не только зрелищем, но и тем, что каждый гость может самостоятельно принимать в нем непосредственное участие. Особенно от этого в восторге дети любого возраста. Аниматор интересно расскажет и покажет, что такое сухой лед, водородный взрыв, азотный фейерверк и как держать в руках огонь. Это удивительно и, конечно же, безопасно.

Тематика крио шоу для детей может быть на ваш выбор. Мы занимаемся организацией и проведением праздников далеко не первый год, имеем весь необходимый реквизит, оборудование, красивые, реалистичные костюмы для аниматоров и талантливых, проверенных артистов. Заказать представление можно с выездом к вам на дом, в детский сад, школу, в кафе или ресторан, за город, в парк – программа проводится как в помещении, так и под открытым небом.

<Азотное крио шоу прекрасно подходит празднику даже без дополнительной анимационной программы. Гостям будет настолько интересно, что другие развлечения просто поблекнут в сравнении.>

Это программа, которая одинаково нравится и мальчикам, и девочкам, особенно когда приходит время готовить мороженное. Яркие эмоции от праздника останутся очень надолго.

Цена крио шоу с жидким азотом отличается от длительности и наполнения программы. Количество гостей нам также важно знать заранее, как и место проведения мероприятия, чтобы подготовить сценарий индивидуально под ваш заказ.

Представление и невероятное мороженное

Наш аниматор профессор на научном крио шоу приготовит удивительные коктейли и морозные напитки, криогенный попкорн и ледяной салат, а самое главное угощение крио шоу – мороженное. Такое не купить в магазине, к тому же профессор химик проведет увлекательный мастер класс по изготовлению мороженого, показывая и рассказывая в доступной даже для малышей форме, что и почему происходит. Используются только натуральные ингредиенты!

Из нашего представления все гости узнают много нового и совершенно иначе посмотрят на такую, казалось бы, скучную науку. Мы покажем вам, что она может быть веселой и креативной. Вас ждет вулкан восторга от по-настоящему волшебного действа. Жидкий азот в емкостях переливается всеми цветами радуги, а его температура около -200 градусов по Цельсию. Поэтому крио мороженное это не только вкусно, но и зрелищно.

Вы также можете заказать профессионального видеооператора и фотографа для красивых, эмоциональных фото. Вся необходимая информация есть на нашем сайте, но вы всегда можете задать вопросы по телефону. Не бойтесь экспериментировать, с нами это очень интересно, весело, феерично. Закажите представление на праздник и убедитесь в этом лично.

Эксклюзивная программа под ключ

У нас можно заказать не только детские программы, но и крио шоу для взрослых. С таким же восторгом и интересом гости будут смотреть представление и участвовать в нем, если вы закажете его на день рождения, юбилей, выпускной, корпоратив, свадьбу, новогоднюю вечеринку или презентацию.

Выездное крио шоу для детей и взрослых в Москве актуально на любом празднике, независимо от его тематики, формата, возраста и интересов присутствующих. Каждый сценарий оговаривается с клиентом в индивидуальном порядке, поэтому вы имеете возможность включить в программу свои пожелания и сделать мероприятие максимально особенным и неповторимым.

Стандартное описание крио шоу:

  • на место проведения заранее приезжает аниматор (ведущий) уже в образе;
  • на ваших глазах разворачивается удивительная мини-лаборатория;
  • каждый эксперимент проводится вместе с присутствующими;
  • аниматор (ведущий) объясняет каждое свое действие так, что его с интересом слушают все от малышей до бабушек;
  • имениннику уделяется особое внимание с вручением подарка;
  • от аниматора – подарок каждому ребенку.

Чтобы заказать крио шоу под ключ, достаточно позвонить по указанному телефону или оставить заявку онлайн. Вам не нужно переживать об организационных вопросах, весь необходимый реквизит, оборудование, материалы мы привозим с собой. Все мастер-классы проводит опытный специалист, соблюдая технику безопасности и используя только проверенное оборудование.

Если вы еще не определились с тематикой и форматом мероприятия, наш менеджер с удовольствием подскажет наилучшие варианты лично для вас. Мы заботимся о том, чтобы каждый клиент получил максимум удовольствия и высококлассное крио шоу в Москве и области независимо от его стоимости.

Химическое шоу на детские праздники

Химическое шоу в Москве пользуется огромной популярностью и часто является главной изюминкой различных торжеств — химические опыты часто можно увидеть на детских днях рождения, утренниках в садах или на выездных мероприятиях. Это увлекательные научно-развлекательные представления, где с аудиторией работают опытные аниматоры.
Заказать химическое шоу на детский праздник — прекрасное решение для того, чтобы подарить незабываемые эмоции всем зрителям.
Как проходит представление
Химическое шоу — это целый комплекс увлекательных научных опытов и экспериментов. Дети наблюдают за тем, как различные вещества взаимодействуют друг с другом, и происходит настоящее волшебство. Химия — очень увлекательная наука, и в процессе представления ребёнок знакомится с ней в простой, доступной и увлекательной форме.

Подрастающее поколение знакомят с различными секретами этой таинственной науки. Маленькие гости мероприятия наблюдают за экспериментами с жидким азотом, водой и воздухом, огнем. Малыши узнают о том, что снег может быть тёплым, а деньги можно поджигать без вреда для купюр и, затаив дыхание, наблюдают за процессом рождения настоящей молнии прямо в комнате. Во время представления ведущий рассказывает зрителям, как происходят те или иные процессы. Всё это и многое другое включает профессиональное химическое шоу для детей.
Специально подготовленный аниматор делает различные опыты и активно вовлекает участников мероприятия в процесс. Каждый ребенок может самостоятельно попробовать сделать какой-нибудь эксперимент. Всё это происходит под строгим контролем аниматора, который поддерживает в юных зрителях интерес к представлению, а также следит за безопасностью. Химические опыты на день рождения или любое другое торжество делают праздник ярче. Может быть, именно благодаря им дети проявят интерес к науке, что поможет их дальнейшему обучению в школе и, возможно, раскроет их таланты.
Заказ представления в Москве
Агентство «Конфетти» специализируется на проведении различных мероприятий в Москве и Подмосковье. У нас вы можете заказать химическое шоу для детей, которое будут проводить профессионалы своего дела, знающие все особенности работы с аудиторией разных возрастов. Мы подготовили для вас самые интересные опыты, в которых маленькие гости смогут принять непосредственное участие. Пассивным зрителем быть точно не получится — ведущий зорко следит за тем, чтобы каждый гость почувствовал себя в роли ученого и экспериментатора. Мы используем только проверенное оборудование, с которым работают профессионалы, что гарантирует полную безопасность.
Заказать такое представление можно на день рождения, мероприятие в культурном центре или учебном заведении. Химическое шоу на детский праздник — это незабываемые эмоции, которые останутся на долгие годы. Для того чтобы это событие осталось в памяти ребёнка надолго, вы можете заказать фото- и видеосъемку.
Мы организуем подобные представления не только в Москве, но и в городах Московской области. У нас в запасе множество готовых интересных сценариев, но по желанию клиента наши специалисты могут подготовить индивидуальный сценарий.

Вопросы и ответы научного шоу "Точка науки"

Где можно посмотреть отзывы, а также фото и видео?​

Самые свежие фотографии и видео мы выкладываем в нашу официальную группу вконтакте, а также в инстаграмм.

Также у нас есть МЕДИАТЕКА, где есть фото и видео научных шоу со свадеб, корпоративов, детских выпускных и Дней Рождения.

Отзывы можно посмотреть на этой странице

Также можете поискать информацию о нас в интернете - многие наши клиенты публикуют фото и видео в своих блогах и социальных сетях.


Можно ли научное шоу устроить для взрослых?

Нужно! У нас есть специальные концептуальные разработки шоу-программ для взрослой премиальной аудитории, где подобраны самые яркие, порой страшные и невероятные эксперименты.

Мы успешно проводим научные шоу на свадьбах, корпоративах, презентациях и других мероприятиях. А если добавить к нашему выступлению работу молекулярной кухни с нитро-баром, то такое мероприятие точно невозможно забыть!


Как заказать научное шоу на праздник?

Это очень просто! Есть несколько способов:

  • позвоните нам на единый контактный телефон: +7 992 003-31-71
  • либо оставьте заявку на обратный звонок и наши специалисты сами свяжутся с вами!

​Наш специалист по организации научного шоу может уточнить у вас следующие вопросы:

Дата и примерное время проводимого праздника, какая шоу программа кажется вам более предпочтительной, количество зрителей и желаемая продолжительность вашего праздника.


Что нужно для организации научного шоу в ресторане/школе/дома?

Для проведения лучшего праздника с нашим шоу необходимо предоставить немного горячей воды, стол и розетку!

Если у вас планируется концертное мероприятие, то технические требования обсуждаются индивидуально.


Какие у вас гарантии безопасности?

Всё оборудование у нас является сертифицированным, а реактивы подобраны с учетом того, что с ними будут работать не только взрослые, но и дети под присмотром опытных профессионалов.

100% безопасность шоу выполняется также за счет того, что мы не используем высокотоксичных и опасных веществ. Всегда есть средства пожаротушения. По запросу предоставляем гарантийное письмо о безопасности.


Могут ли ваши ведущие работать в детских учреждениях закрытого типа?

Да, могут. У наших ведущих есть допуск в детский коллектив, а также актуальные медицинские книжки.


Возможен ли выезд научного шоу по области, либо в другой город?

Да, такую возможность мы предоставляем. Однако учитывайте, что все транспортные расходы берет на себя заказчик.


У вас есть лицензия?

Согласно российскому законодательству (Федеральный закон "О лицензировании отдельных видов деятельности") наша деятельность не требует получения государственной лицензии. Однако мы имеем ряд сертификатов и свидетельств обо всех наших реактивах и экспериментах.

Наши ведущие являются специалистами в работе с детьми (педагогическое образование, а также специальная профессиональная подготовка).


Сколько вам нужно времени на подготовку?

Обычно около 10-15 минут. Для вашего спокойствия мы приезжаем как минимум за полчаса до начала представления.

Мы гарантируем, что у нас все вовремя! Ведь наша наука должна быть максимально точной!

А вы делаете скидки?

Да! Мы очень любим это делать! На странице "Акции" можно узнать о проводимых нами приятных акциях для вас!

В группе вконтакте мы тоже постоянно размещаем различные интересные предложения, дарим скидки и другие отличные подарки! Мы даже как-то разыгрывали бесплатное шоу!

Кстати, можно нам просто позвонить и договориться с нами о взаимовыгодных условиях =)

+7 992 003-31-71

Что делать, если дети уже видели химическое (научное) шоу?

В этом нет никакой проблемы! Мы постоянно (примерно каждые три месяца) разрабатываем новые уникальные сценарии! Это делают настоящие КВНщики! А наши друзья - химики и физики, профессора и лаборанты помогают нам с реализацией самых безумных идей, придумывая и воплощая в жизнь самые интересные эксперименты безопасные для детей!

Единственная просьба - если Вы знаете, что некоторые ребята видели какое-либо научное или химическое шоу - обязательно скажите об этом нам заранее, чтобы мы привезли какие-нибудь супер-пупер интересные эксперименты!


В чем отличие научного шоу от обычного урока по химии?

Можно много написать по этому поводу, но лучше один раз увидеть! Научное шоу – это далеко не школьный урок.

Порой школьные уроки похожи на лекции и интерес детей к знаниям исчезает с геометрической прогрессией. Мы ничего не заставляем делать, однако дети сами рвутся принять участие во всем, что мы делаем!

Наше шоу - это исключение из всех возможных представлений детям информации. Профессиональные ведущие устроят настоящий праздник вашим детям, покажут различные исключения из правил, яркие, необычные и веселые эксперименты.

Каждый эксперимент будет в обязательном порядке харизматично обыгран и увлекательно преподнесен! После таких экспериментов в детях пробуждается исследовательский дух.

Кто знает, может именно это шоу и подтолкнет кого-то из ребят к глубокому изучению науки, к исследованиям и новым открытиям. После нашего шоу дети (да и взрослые!) будут долго говорить о том, что наука - это здорово. И точка!

Безумная лаборатория - Статьи

«Ребёнка нужно занять так, чтобы у него не было времени глупостями заниматься», «Нужно заниматься интеллектуальным развитием ребенка!» — частенько мне случалось слышать такое мнение (от самых заботливых мам, между прочим).

Как помочь найти свой путь?

Такие родители из самых лучших побуждений строят график своего ребёнка так, чтобы он постоянно был занят. Школа, затем музыкальная школа, затем танцевальная студия, затем репетитор по английскому, а вечером остается как раз время на то, чтобы поучить уроки. На следующий день такое же плотное расписание на другие кружки, к другим репетиторам.

Всё это делается для того, чтобы ребёнок «не успевал заниматься глупостями».

Наверное, такие папы и мамы думают, что их ребёнок, выйдя во двор, обязательно начнет курить, пить, нюхать клей и пробовать наркотики. Двор вместе с шатающейся там мальчишеской стаей кажется таким родителям олицетворением зла. И нечего там делать их ребёнку.

Интеллектуальное развитие ребенка – как не навредить?

Ребёнок ведь нуждается в развитии. Его образование – это старт в будущее. И это наша, родительская ответственность. Мы озабочены тем, как заставить ребёнка учиться. Нужно тщательно следить за этим процессом – чтобы он старался, как можно аккуратнее учил уроки, участвовал в школьных олимпиадах и много читал.

Не каждый ребёнок поддается таким требованиям – не каждому это под силу. Но есть все же детки, которыми родители смело могут гордиться. Победители олимпиад, круглые отличники, вечно занятые своим развитием.

Отличник в школе

Но почему же вот тот мальчик – золотая голова, умница, победитель государственных олимпиад из самой почтенной семьи — ещё в институте начал пить, а после его окончания и вовсе спутался с плохой компанией и стал героиновым наркоманом? Ведь его ограждали от этого всю жизнь! Ведь он никогда даже не пробовал курить! Ведь он был идеальным ребёнком! И вообще – он гений!

Раннее интеллектуальное развитие ребенка вредит ему — Как и почему такое возможно?

Ответ прост: свое развитие ребёнок должен начинать с нижних векторов (кожный, анальный, уретральный и/или мышечный). Верхние вектора (если они есть у ребёнка) отвечают за тип интеллекта. Когда родители с раннего детства занимаются интеллектуальным развитием ребёнка, оно действительно способствует развитию верхних векторов, то есть интеллекта. Но это происходит в ущерб развитию нижних векторов.

Такой ребенок, вырастая, испытывает трудности в ранжировании, не может найти и занять свое место в обществе. Нижние вектора определяют либидо человека и составляют фундамент характера. При неразвитых нижних векторах (фундаменте) даже сверхразвитые верхние вектора не помогут человеку состояться в этой жизни.

Для развития нижних векторов нужно прежде всего давать возможность ребёнку ранжироваться среди сверстников. И пусть дворовая жизнь, с присущими ей лазаньем по деревьям, крышам и стройкам, игрой в мяч и нечаянным битьём окон, не пугает любящих родителей, хотя и так далека от постулатов интеллектуального развития ребенка. Ребёнок должен «потолкаться» в коллективе, научиться защищать свое мнение, завоёвывать уважение и своё место в стае.

Взаимодействие детей

«Гулять во дворе» — это не просто времяпровождение. Ранжируясь в кругу сверстников, ребёнок проигрывает свои видовые роли. Это разовьет заданные ему от рождения свойства до того уровня, когда он успешно сможет их адаптировать в социуме. Уже во взрослой жизни он всегда найдет свое место под солнцем и не пропадет на очередном повороте жизни.

Выбор направления интеллектуального развития ребенка — Родительская ответственность

Она, родительская ответственность, на самом деле состоит не в том, чтобы напихать в голову своему ребёнку максимум информации или начать развивать его интеллект с ранних лет. Лучшее, что можно сделать – это развить в ребёнке то, что задано ему природой. Врожденные психические свойства (вектора) включают в себя и таланты, и способности, и тип интеллекта. Нужно просто увидеть, чем наградила природа вашего малыша.

Считать, что ребёнок – это чистый лист бумаги на котором мы, родители, можем написать все, что угодно – распространенное и на самом деле ужасное заблуждение(!). Ребёнок получает при рождении свой набор психических качеств и желаний. Правильное интеллектуальное развитие ребенка – это умелое направление родителями его психических ресурсов в правильное русло.

Часто родители делают одну и ту же ошибку – навязывают ребёнку то занятие, которое нравится им самим. Мечтали когда-то научиться танцевать, но не получилось – не беда, ребёнок заполнит этот пробел. И не страшно, что он не хочет туда ходить, и что получается у него хуже всех – научиться. Терпение и труд, знаете ли.

Пытаясь развить в своем детище то, чего в нём нет и быть не может, мы приносим вред интеллектуальному развитию ребенка, тем самым создавая угрозу его будущему. Еще хуже мы поступаем, когда пытаемся подавить неугодные нам психические свойства малыша.

Например, постоянно торопить медлительного ребёнка с анальным вектором, он будет проявлять упрямство, может начать садистировать над животными, обижать девочек в школе. Усугубляя конфликт с таким ребёнком, мы можем вырастить домашнего садиста или даже педофила. Так устроена его психика.

Или другой пример: если постоянно «затыкать рот» незамолкающему ребёнку с оральным вектором, он может начать врать – только чтобы привлечь внимание. Привычка врать может прочно закрепиться в его жизненном сценарии и, вместо талантливого оратора, ведущего или комика родители получат… никчемного врунишку.

Правильное интеллектуальное развитие ребенка

Конечно, воспитание ребёнка не нужно пускать на самотек, и ему необходимо то физическое и интеллектуальное развитие, которое могут дать ему детские кружки. Но развивать верхние вектора (то есть, интеллект и таланты ребенка) нужно осознанно и без ущерба для нижних векторов.

Не допусти ошибку!

  • Во-первых, раннее интеллектуальное развитие ребенка (грубо говоря, с самого горшка), которое сейчас очень модно у родителей – это лишнее. Сначала у малыша должны сформироваться нижние вектора.
  • Во-вторых, у вашего школьника должно оставаться достаточно времени для ранжирования – для того, чтобы погулять и поиграть с друзьями во дворе.

Естественно, кружки для вашего школьника нужно выбирать, исходя из его векторального набора (и учитывая его предпочтения).

Пример правильного интеллектуального развития: школьника, обладающего зрительным вектором можно отдать в художественную студию, клуб юных фотографов либо в драматический кружок (в зависимости от его желания). Такому ребенку нужно прививать любовь к чтению – стимулировать его лучшие эмоции, развивая его чувственность и способность любить.

Ребёнка с оральным вектором можно отдать в кружок ораторского искусства или в школьный «Клуб веселых и находчивых».

Идеальный слух школьника, у которого есть звуковой вектор, поможет ему учиться в музыкальной школе и достигать успехов на этом поприще.

К каждому малышу необходимо найти свой подход, понять его, распознать то, что скрыто в его психическом. Было бы идеально, если бы и воспитатели, и учителя пытались делать это. Но пока что ответственность за правильное интеллектуальное воспитание детей лежит только на родителях.

Информация с сайта http://polyova.com

Just Show - Агентство по организации праздников предлагает в Москве Услуги детских и взрослых праздников и аниматоров с уникальными Шоу программами.

Различные сценарии научного шоу для малышей, подростков и взрослых, веселые аниматоры и полноценное погружение в настоящую магию.

Профессиональная организация детских праздников

Научное и химическое шоу: эксклюзив на заказ

Мы с радостью развеем миф о скучной науке – любой праздник захватывает благодаря нашим ведущим и артистам! Организовываем и проводим мероприятия на заказ как для детей, так и взрослых. Спектр наших услуг варьируется от непродолжительных представлений до зажигательных вечеринок на всю ночь. Вы не сможете отвести взгляд от зрелища, подаренного талантливыми аниматорами и авторским сценарием.

Химическое шоу включает в себя:

– водородные взрывы;

– эксперименты с сухим льдом;

– мгновенное замораживание и опыты с жидким азотом;

– немыслимые метаморфозы с предметами;

– ньютоновская жидкость и фараоновые змеи;

– огонь в руках;

– уникальные напитки, сладости и т.д.

Если у вас есть желание насладится либо поучаствовать в научном шоу, дать детям возможность стать волшебниками и изучить нечто очень интересное, то мы вам поможем. Даже у привереды нет шансов устоять перед соблазном потрогать все своими руками.

Научное и химическое шоу подойдет для любого события. Можно заказать выступление на дом, в школу, свадьбу, новогоднюю вечеринку и т.д. Развлекательная программа может быть скорректирована при учете клиентских пожеланий и тематики действа. Все, что нужно для проведения мероприятия – требуемый реквизит, музыкальное и световое оборудование, спецэффекты и расходные материалы – мы имеем. Красивые костюмы, море свежих идей, талантливые ведущие и аниматоры Just Show – все это обеспечит незабываемый праздник.

Принять участие в представлении может один артист и группа аниматоров. Различные нюансы, в том числе и цену, согласовываем заблаговременно. Не стоит опасаться за малышей при проведении опытов – это безопасно. Для большего веселья можно совместить визуальную часть с игрой, квестом, мастер-классом и опытами.

Главное требование для осуществления мероприятия – наличие места с достаточным пространством. Если у вас нет такого на примете, мы можем подсказать неплохие варианты. Посмотреть отзывы, фотографии и видео шоу, а также встретиться лично можно в любое время. Советуем позвонить и забронировать мероприятие заблаговременно, пока не кончились свободные даты.

Длительность: 30-50 минут

Где мы работаем:

  • В кафе/ресторане
  • В парке
  • В детском саду/школе
  • В частном доме/на даче
  • В квартире
  • В детском центре

Научное шоу для детей в Воронеже по выгодной цене

Сегодня большое количество родителей отдает предпочтение не просто весёлым развлечениям для детей, но и тем, которые могут развить способности ребёнка, расширить его кругозор. Интерактивные научные шоу-программы очень популярны среди детей от 4 до 18 лет.

Такие программы состоят из разнообразных научных экспериментов и зрелищных демонстраций, которые не просто веселят участников, но и помогают им овладеть новыми знаниями. Если вы хотите заказать научное шоу по привлекательной цене в Воронеже, сделать это можете в нашей компании BabyBoss.

Уникальность научного шоу

Подобное шоу проходит в формате игрового обучения и уже на протяжении многих лет популярно в Европе, Канаде и США. Такой формат позволяет заинтересовать детей, продемонстрировать, что обучение может быть веселым и интересным.

Сторонники подобной методики утверждают, что во время игры информация усваивается намного лучше и разнообразные эксперименты, проведённые в таком формате, намного лучше запомнятся детьми.

Кроме этого на подобных представлениях дети сами могут стать участниками научного шоу, а не только зрителями, попробовать провести интересный эксперимент и, конечно же, это оставит неизгладимое впечатление.

Почему заказать научное шоу стоит именно у нас

Каким должно быть настоящее научное шоу? Интересным, преподнесенным в легкой игровой форме, ориентированным на всех детей, которые будут присутствовать на празднике. Именно такое научное шоу Вы можете заказать в нашей компании BabyBoss.

Мы индивидуально разрабатываем сценарии для праздников. Поэтому учитываем все нюансы: количество детей, их предпочтения, возраст. Мы можем создать настоящую сказку приехав к Вам на торжество, или Вы можете провести его у нас.

В Вашем распоряжении будет большая площадка, которая подходит для проведения любых мероприятий: дней рождения, выпускных, Нового года и т. д. Мы поможем с оформлением, установкой профессионального аудио оборудования и фотографом. Вам не придётся ни за что переживать — мы можем организовать праздник от и до.

leschzinerlab / General_routines: Репозиторий общих скриптов для взаимодействия с крио-ЭМ данными одиночных частиц.

Этот репозиторий будет содержать скрипты для общей обработки данных наборов данных криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ) одиночных частиц.

Содержание

Преобразование файлов .mrc dm3 в .mrc (сценарий bash)

Быстрый сценарий bash, который преобразует все микрофотографии в заданной папке с расширением .dm3 в формат .mrc.

 ./convert_all_dm3_to_mrc.csh 

Преобразование стека .mrc в отдельные 2D-изображения .mrc

Для преобразования стопки изображений MRC в отдельные 2D-изображения MRC. Это полезно для работы со стеками из SerialEM или любого другого стека изображений .mrc.

 $ Общие_программы / mrc_stack_to_2Dimages.py
Использование: mrc_stack_to_2Dimages.py -i [стек]

Параметры:
  -h, --help показать это справочное сообщение и выйти
  -i ФАЙЛ Входной стек .mrc
  -d отладка 

Извлечение частиц с помощью makeStack.py

### Входы

makeStack.py предполагает, что выбранные вами частицы хранятся в файле .box с тем же именем , что и микрофотография , который находится в формате .mrc . Координаты частиц, хранящиеся в файле .box , находятся в текстовом файле с четырьмя столбцами: X, Y, BoxSize X, BoxSize Y.

Например, вывод из [ runSignature.py ] (https://github.com/leschzinerlab/Signature) предоставит координаты частиц в формате .box , который совместим с makeStack .py .

#### Уборка частиц

Обычно пользователи могут собирать частицы с помощью boxer из EMAN1.9 или e2boxer.py из EMAN2. Оба могут сохранять координаты частиц в формате .box.

#### Оценка CTF

Ниже у пользователей есть возможность извлечь 1) частицы с перевернутой фазой или 2) пары частиц RCT / OTR. Для любого из этих выходов обработки вам нужно будет запустить:

  1. переключение фазы: CTFFIND3 -> [оценкаCTF_CTFFIND3.py] (https://github.com/leschzinerlab/FREALIGN/tree/master/ctffind_ctftilt)

  2. RCT / OTR: CTFTILT -> [оценкаCTF_CTFTILT.py] (https://github.com/leschzinerlab/FREALIGN/tree/master/ctffind_ctftilt)

Эти программы будут выводить текстовые файлы с CTF и информацией о наклоне.

### Зависимости

Это программное обеспечение требует установки [SPIDER] (http://spider.wadsworth.org/spider_doc/spider/docs/spider.html) и [EMAN2] (http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2). & библиотеки правильно настроены.

### Запуск программы

Параметры ввода для программы отображаются при запуске программы без параметров в командной строке:

  $ /General_routines/makeStack.py
Использование: makeStack.py --micros = <микрофотография> -o <имя стека вывода.img>

Параметры:
  -h, --help показать это справочное сообщение и выйти
  --micros = ФАЙЛ Путь к микрофотографиям с подстановочным знаком в кавычках ('* en.mrc')
                   (Не требуется для ответвлений по углу наклона)
  -o ФАЙЛ Имя выходного стека (.img). Если наклона сопрягается, не предоставляйте
                   расширение .img, имя выходного стека будет базовым именем для
                   наклонные и остроконечные частицы.
  --bin = INT Коэффициент биннинга, используемый при выборе боксера (по умолчанию = 1)
  --invert Дополнительно: инвертировать контраст микрофотографий
  --boxsize = INT Необязательно: Размер коробки для окончательного стека. (По умолчанию используется размер
                   в комплектации боксеров)
  --binstack = INT Необязательно: Биннинг для окончательного извлеченного стека частиц.
                   (По умолчанию = 1)
  --phaseflip Флаг для фазового переворота частиц
  --ctf = STRING При переключении фазы - ctf_param.txt выходной файл из
                   оценкаCTF_CTFFIND.py, если не используются сопряжения по углу наклона
  --untilt = STRING При извлечении сопряжений наклона - предоставить выходной файл CTFTILT для
                   Микрофотографии без наклона, созданные с помощью valuCTF_CTFTILT.py.
                   Предполагается, что расширение - «01».
  --tilt = СТРОКА При извлечении сопряжений наклона - предоставить выходной файл CTFTILT для
                   НАКЛОННЫЕ микрофотографии, созданные с помощью EstimatedCTF_CTFTILT.py.
                   Предполагается, что расширение - «00».
  --noinsideonly Отметить, чтобы НЕ исключать частицы по краям изображений (необходимо
                   для тилт-пар)
  -d отладка
  

#### Извлечение сырых частиц (без смены фаз)

Чтобы извлечь частицы из ваших микрофотографий без переворота фазы или выделения сопряжений наклона для OTR / RCT, вам просто нужно указать путь к микрофотографиям и предоставить имя выходного стека. ПРИМЕЧАНИЕ Предполагается, что файлы коробок имеют то же имя, что и имена микрофотографий.

  $ /General_routines/makeStack.py --micros = '* en.mrc' -o outputstack.img
  

#### Извлечение частиц с переворачиванием фазы

Чтобы извлечь частицы из микрофотографий с перевернутой фазой, вы можете выполнить эту команду, указав --phaseflip и предоставив файл ctf_param.txt , который является выходом из ratingCTF_CTFFIND.py :

  $ / Общие_программы / makeStack.py --micros = '* en.mrc' -o outputstack.img --phaseflip --ctf = ctf_param.txt
  

#### Извлечение сопряжений наклона RCT / OTR

в незавершенном производстве

leschzinerlab / Relion: Скрипты для использования пакета Relion для криоэлектронной микроскопии одиночных частиц (крио-ЭМ)

Построение распределений углов Эйлера для трехмерных реконструкций

Учитывая выходной файл .star из Relion, вы можете визуализировать углы Эйлера, открыв файл .bild с помощью UCSF Chimera.

В качестве альтернативы, если вы хотите создать графики одномерной гистограммы для любого угла Эйлера или двухмерную тепловую карту двух конкретных углов Эйлера, вы можете использовать plot_indivEuler_histogram_fromStarFile.py :

  $ Relion / plot_indivEuler_histogram_fromStarFile.py
Использование: plot_indivEuler_histogram_fromStarFile.py --starfile = 

Параметры:
  -h, --help показать это справочное сообщение и выйти
  --starfile = ФАЙЛ Звездный файл отношения (data.star)
  --rlnEuler = СТРОКА Имя обозначения угла Эйлера в Relion:
                     AngleRot, AngleTilt, AnglePsi.Укажите два названия углов
                     (например, AngleRot, AngleTilt) для 2D тепловой карты Эйлера
                     углы
  --binsize = INT Необязательно: размер ячейки для гистограммы углов Эйлера
                     (По умолчанию = 5)
  -d отладка
  

Этот сценарий использует numpy и matplotlib для создания гистограмм 1D / 2D для указанного угла Эйлера (AngleRot, AngleTilt, AnglePsi), который находится в файле Relion .star.

Примеры выходных изображений

1D-гистограмма для заданного угла Эйлера

2D-гистограмма для заданного угла Эйлера

Удаление чрезмерно представленных представлений в файлах Relion STAR

После визуализации приведенных выше результатов для распределений углов Эйлера в ваших данных следующий скрипт случайным образом удалит определенное подмножество частиц в указанном диапазоне углов Эйлера, тем самым перенастроив распределение углов Эйлера для ваших данных.

  $ Relion / reweight_particle_stack.py
Использование: reweight_particle_stack.py --stareuler =  --starparticle =  [lims]

Параметры:
  -h, --help показать это справочное сообщение и выйти
  --stareuler = ФАЙЛ Вывести звезду отношения из уточнения / классификации
                       содержащие углы Эйлера
  --starparticle = ФАЙЛ Звездный файл отношения, который будет повторно взвешен на основе
                       углы Эйлера.
  --remove = INT Количество частиц, которые нужно удалить из предпочтительного просмотра,
                       указанные в пределах нижеуказанных пределов
  --AngleRotLim1 = INT Нижний предел для AngleRot.--AngleRotLim2 = INT Верхний предел для AngleRot.
  --AngleTiltLim1 = INT Нижний предел для угла наклона.
  --AngleTiltLim2 = INT Верхний предел для угла наклона.
  --AnglePsiLim1 = INT Нижний предел для AnglePsi.
  --AnglePsiLim2 = INT Верхний предел для AnglePsi.
  --saveremoved Флаг сохранения списка номеров частиц, удаленных из
                       исходный список.
  -d отладка
  

Использование

По умолчанию, если пределы угла Эйлера не указаны, эта программа не будет удалять какие-либо частицы из.звездный файл.

Чтобы удалить частицы из диапазона углов Эйлера, вы должны указать диапазон ВНУТРИ границ углов Эйлера, которые будут удалены. Например, если вы хотите удалить частицы в диапазоне AngleRot от 50 до 90 градусов, у вас будут следующие параметры ввода:

 --AngleRotLim1 = 50
--AngleRotLim2 = 90 

Для большей гибкости программа может 1) удалять частицы из одного входного файла или 2) удалять частицы из другого файла. Список исключенных частиц можно сохранить, указав параметр --saveremoved .

Пример

Например, если у меня есть чрезмерно представленный диапазон углов Эйлера от 50 до 90 градусов от угла AngleRot, и я знаю, что хочу удалить 10 000 частиц из этого диапазона, чтобы восстановить его до базового распределения:

  $ Relion / reweight_particle_stack.py --stareuler = relion_data.star --starparticle = relion_data.star --remove = 10000 --AngleTiltLim1 = 50 --AngleTiltLim2 = 8 = 90 --saveremoved
  
  • Где, relion_data.star - это файл данных от Relion, из которого будут удалены определенные частицы. И удаленные частицы будут сохранены и сохранены в новом файле с именем relion_data_particlesRemoved.txt .

dm2mrc.sh Сценарий: Linux: Вычисления: Оборудование: Центр электронной микроскопии: Университет Индианы

В следующем описании сценария dm2mrc.sh имя сценария и его содержимое выделены жирным шрифтом. По всему сценарию разбросаны комментарии, не содержащиеся в самом сценарии, которые описывают, что делают различные части сценария, и которые относятся к нашему списку часто используемых команд Linux и описывают общее действие этого сценария.В этих комментариях жирным шрифтом также выделены такие вещи, как текст, который пользователь может ввести, или текст, который также содержится в самом скрипте.

ПРИМЕЧАНИЕ. Сравнение показанного здесь сценария с текущей версией сценария из другого места может показать различия. Сценарий, показанный здесь, и сценарий, работающий на Linux-машине, могут легко отличаться, особенно в отношении интервалов и отступов. Также возможно, что в сценарий на компьютере будут внесены изменения, отражающие изменения в доступном программном обеспечении или в реальной операционной системе.Такие различия можно игнорировать с точки зрения использования того, что показано здесь в качестве объяснения сценариев.

Это сценарий bash, поэтому он должен начинаться с #! / Bin / bash . Затем в сценарии дается очень краткое объяснение (отмеченное с помощью разделителя комментариев # ) того, что делает сценарий, чтобы читатель сценария получил представление о том, что должно произойти.

#! / Bin / bash
# простой скрипт для преобразования серии файлов
# Digital Micrograph (dm3)
# в формат MRC для дальнейшего изображения
# операции обработки

Следующая строка определяет команду echo включить флаг -e , который указывает, что команда должна ожидать и использовать специальные символы для помощи при форматировании вывода.Во многих случаях это не обязательно, но используется в большинстве сценариев EMC для Karst.

ECHO = "/ bin / echo -e"

Следующий блок представляет собой сложный набор if-then-else , который позволяет пользователю ввести dm2mrc.sh help , чтобы получить некоторую информация о работе скрипта. Эта же конструкция также позволяет пользователю получать стандартное сообщение с инструкциями по использованию, если что-то напечатано, что сценарий не может понять (например,g., dm2mrc.sh имя_файла вызывает ошибку, которая сообщает пользователю правильный способ вызова сценария). Какое бы действие ни было произведено с использованием конструкции if-then-else , статус выхода будет 1 (см. Комментарий к оператору exit 0 для объяснения использования значений статуса выхода). Все действия в этой части сценария в другом месте называются шагом 1.

if (test $ # -ne 0) then
if (! (Test `echo $ 1 | wc -w` -ne 1)) then
if (test $ 1 = "help"), то
$ ECHO "\ n \ tdm2mrc.sh \ n "
Этот сценарий использует команду EMAN1 proc2d для преобразования файлов DigitalMicrograph (dm3) в формат MRC. Выходные файлы имеют режим MRC 2 (числа с плавающей запятой), и для большинства изображений, собранных 3200FS, изображения будут фактически быть 16-битными целыми числами, хранящимися как числа с плавающей запятой. Этот сценарий также выполняет автоматический этап «удаления экстремальных выбросов и отрицательных значений» с использованием специально написанной для этой цели программы. \ N
Такие выбросы и отрицательные значения обычно являются результатом попадания рентгеновских / космических лучей во время получения изображения.Если программа обнаружит, что нужно устранить, файл журнала операции будет сохранен в подкаталоге MetaData. Файл журнала показывает минимальное, максимальное и среднее значение до и после удаления необычных значений, а также показывает как общее количество удаленных пикселей, так и число, которые были отрицательными, и среднее значение этих отрицательных значений (попадание рентгеновских лучей в темный эталон будет дают очень отрицательные значения, в то время как для изображений с низкой дозой облучения существует конечная вероятность того, что небольшие отрицательные значения могут появиться при нормальных условиях изображения.\ n
Есть несколько способов определить, где на изображении были изменены значения. Если вы хотите узнать больше об этом, обратитесь к персоналу отделения EM. \ N
Ниже приведены простые инструкции по использованию этого сценария: \ n "else
$ ECHO" \ n \ tНеправильное количество аргументов ($ #)! \ N "fi else
$ ECHO" \ n \ tНеправильное количество аргументов ($ #)! \ n "fi
$ ECHO" \ tПравильное использование просто: \ n "
$ ECHO" \ t dm2mrc.sh \ n "
который преобразует все файлы dm3 в этом каталоге в файлы MRC для преобразования одного файла dm3 в формат MRC, используйте proc2d myImage.dm3 myImage.mrc \ n "
exit 1 fi

Следующий блок сохраняет список всех файлов dm3 в переменной с именем LIST и переходит к конструкции if-then-else . \ ls * dm3 2> / dev / null конструкция здесь гарантирует, что для этой операции используется только самая стандартная команда ls ( \ ls ) (т. Е. Никакие пользовательские версии ls с псевдонимом не должны использоваться) и вывод быть подавленным (см. примечание в конце сценария).

Первая часть if сообщает пользователю, что будет делать сценарий, и заканчивается сохранением только имен файлов (без расширения .dm3) в переменной LIST ( LIST = `\ ls * dm3 | cut -f1 -d. `, где пара обратных кавычек указывает скрипту выполнить команды в обратных кавычках и затем присвоить этот результат переменной LIST ). Предложение else гарантирует, что если по какой-либо причине список файлов dm3 пуст, сценарий передаст его пользователю и выйдет со статусом выхода 2 (вместо обычного статуса выхода 0, когда сценарий заканчивается).

В терминах описания создание переменной LIST - это шаг 2, фактический тест ( "[" $? "==" 0 "]" ) - это шаг 3, первая часть если предложение - это шаг 5, а вторая часть if (часть else) - шаг 4.

LIST = `\ ls * dm3 2> / dev / null`
if [" $? " == "0"]; then
$ ECHO "\ n \ tПреобразование всех файлов dm3 в формат MRC. \ n
Помните, что эта программа удаляет все отрицательные значения изображения, а также крайне положительные выбросы (более чем на 15 стандартных отклонений выше среднего).
$ ECHO "\ t Полезные файлы журнала будут сохранены в подкаталоге MetaData. \ N
LIST =` \ ls * dm3 | cut -f1 -d. `Else
$ ECHO" \ n \ t Файлы dm3 не найдены. Наберите \ n \ n \ t \ tdm2mrc.sh help для получения дополнительной информации \ n "exit 2 fi

Далее происходит сердце сценария. Первая строка создает новую переменную с именем name , которая связана с именами файлов dm3. хранится в переменной LIST. Имя для в конструкции $ LIST (заканчивающееся на , выполненное ) сообщает сценарию, что нужно пройти через каждое имя файла, содержащееся в переменной LIST, назначить это фактическое имя файла имени переменной и выполнить все операции между for и done для каждого файла.

В этом цикле for / done происходят разные вещи: создается переменная с именем TimeStamp (содержащая числовое представление даты с точностью до секунды, в течение которой сценарий начинает работать с новым файлом dm3), а затем используется как часть имени файла, присвоенного переменной TMP . Программа EMAN proc2d используется для преобразования исходного файла dm3 в файл MRC с именем TMP . Этот новый файл загружается в программу под названием removeXrays2 , которая заменяет отрицательные значения в изображении и значения, которые, скорее всего, являются рентгеновскими лучами («слишком яркий», определяемый здесь как больше, чем среднее значение изображения +15.умноженное на стандартное отклонение изображения) со средними значениями, окружающими такие пиксели. Результатом removeXrays2 является новый файл MRC, имя которого ( $ {name} .mrc ) связано с исходным файлом dm3 (т.е. input_file_1.dm3 преобразуется в input_file_1.mrc).

Существует также другая конструкция if-then-else , которая имеет дело с выводом ( $ {name} .removeXrays2.log ) из программы removeXrays2 : если программа действительно заменяет любые значения изображения (if ( ! test -z `grep -l fixed $ {name}.removeXrays2.log `), затем построение), скрипт создает каталог с именем MetaData , если это необходимо (используя тест на отсутствие каталога: if (! test -d MetaData ), затем и делая каталог, если он не существует), а затем перемещает файл журнала из removeXrays2 в него. Если removeXrays2 ничего не делает (последнее предложение else), файл журнала просто удаляется.

Последним шагом в цикле for / done является очистка: временный файл TMP удаляется.Если переменная LIST содержит другие имена файлов, которые не были обработаны, сценарий возвращается к шагу, который создает переменную TimeStamp , и продолжает работу. Если все имена файлов были обработаны, сценарий продолжается после оператора done .

для имени в $ LIST; do
TimeStamp = `date +% m% d% y-% H.% M.% S`
TMP = TMP _ $ {TimeStamp} .mrc
proc2d $ {name} .dm3 $ TMP> / dev / null 2> & 1
removeXrays2 $ TMP $ {имя} .mrc 15.> $ {имя}.removeXrays2.log 2> & 1
if (! test -z `grep -l fixed $ {name} .removeXrays2.log`) then
if (! test -d MetaData) then
mkdir MetaData fi
mv $ {name}. removeXrays2.log ./MetaData else
rm -f $ {name} .removeXrays2.log fi
rm -f $ TMP
done

Сценарий очищается после себя, удаляя файл журнала ( .emanlog ), созданный, когда была запущена программа EMAN proc2d .

rm -f .emanlog

Здесь также перечислены все файлы MRC, которые он может найти в этом каталоге.

ls * mrc

Последняя команда echo просто вставляет пустую строку ( "" ) в самый конец всего, чтобы вывод выглядел немного лучше.

$ ECHO ""

Наконец, сценарий завершается с явным статусом выхода 0. Если этот сценарий запускался внутри другого сценария, можно было бы проверить это значение, чтобы убедиться, что Сценарий dm2mrc.sh работал правильно. Такой сценарий также может сообщать пользователю о ненулевом статусе выхода и даже может иметь разные выходные данные для статуса выхода 1 (указание на то, что сценарий на самом деле никогда не запускался) или 2 (указание на то, что не было никаких файлов dm3, в которых сценарий пытался выполнить).

exit 0

ПРИМЕЧАНИЕ. В приведенном выше сценарии используется несколько конструкций перенаправления вывода. Например,> / dev / null 2> & 1 в конце команды proc2d говорит объединить (> &) std err (2) в std out (1) (т.е. вся эта операция 2> & 1) и отправьте его (>) в / dev / null, тип памяти только для записи. Эта же конструкция используется для помещения всего вывода из removeXrays2 в файл журнала ($ {name} .removeXrays2.log). Кроме того, в самом начале сценария команде \ ls, которая связывает имена файлов dm3 с переменной LIST, предлагается отправить свой вывод (который является только std err, 2) в / dev / null.Перенаправление вывода на / dev / null приводит к тому, что на терминал ничего не отправляется, и резко сокращает вывод, который не нужно видеть в процессе выполнения многих скриптов.

(PDF) Криоэлектронная микроскопия, структура и анализ сигнального каркаса P-Rex1 – Gβγ

Cash et al., Sci. Adv. 2019; 5: eaax8855 16 октября 2019 г.

НАУКИ | НАУЧНАЯ СТАТЬЯ

10 из 10

Л. Лару, Х. К. Велч, Б. В. Озанн, О. Дж. Сансом, P-Rex1 необходим для эффективной миграции меланобластов

и метастазирования меланомы.Nat. Commun. 2011. Т. 2. С. 555–559.

4. М.С. Соса, К. Лопес-Хабер, К. Ян, Х. Б. Ван, М. А. Леммон, Дж. М. Бусилло, Дж. Луо,

Дж. Л. Бенович, А. Кляйн-Сзанто, Х. Яги, Дж. С. Гуткинд, Р. Э. Парсонс , MG Kazanietz,

Идентификация Rac-GEF P-Rex1 как важного медиатора передачи сигналов ErbB при раке груди

. Мол. Cell 40, 877–892 (2010).

5. Дж. Цинь, Ю. Се, Б. Ван, М. Хосино, Д. В. Вольф, Дж. Чжао, М. А. Скофилд, Ф. Дж. Дауд, М.F. Lin,

Y. Tu, Повышающая регуляция PIP3-зависимого обменника Rac 1 (P-Rex1) способствует метастазированию рака простаты

. Онкоген 28, 1853–1863 (2009).

6. Х. К. Велч, Регулирование и функции Rac-GEF семейства P-Rex. Малые GTPases, 49–70 (2015).

7. Д. Р. Кук, К. Л. Россман, К. Дж. Дер, Факторы обмена гуаниновых нуклеотидов: регуляторы

активности Rho GTPase в развитии и болезни. Онкоген 33, 4021–4035 (2014).

8.HCE Welch, WJ Coadwell, CD Ellson, GJ Ferguson, SR Andrews, H. Erdjument-Bromage,

P. Tempst, PT Hawkins, LR Stephens, P-Rex1, PtdIns (3,4,5) P3- и G -Регулируемый фактор обмена

гуанин-нуклеотид для Rac. Cell 108, 809–821 (2002).

9. Дж. Н. Кэш, Э. М. Дэвис, Дж. Дж. Г. Тесмер, Структурная и биохимическая характеристика

каталитического ядра метастатического фактора P-Rex1 и его регуляция с помощью PtdIns (3,4,5) P3.

Структура 24, 730–740 (2016).

10. CM Lucato, ML Halls, LM Ooms, HJ Liu, CA Mitchell, JC Whisstock, AM Ellisdon,

Фосфатидилинозитол (3,4,5) -трифосфат-зависимый обменник Rac 1: Ras-связанный

C3 Комплекс субстрата 1 ботулинического токсина (P-Rex1: Rac1) раскрывает основу активации rac1

в клетках рака молочной железы. J. Biol. Chem. 290, 20827–20840 (2015).

11. Н. К. Рынкевич, Х.-Й. Лю, Д. Баламациас, К. А. Митчелл, INPP4A / INPP4B и P-Rex

белки: родственные, но разные? Adv.Биол. Regul. 2012. Т. 52. С. 265–279.

12. К. Хилл, С. Кругманн, С. Р. Эндрюс, В. Дж. Коадвелл, П. Финан, Н. С. Уэлч, П. Т. Хокинс,

Л. Р. Стивенс, Регулирование P-Rex1 с помощью фосфатидилинозит (3,4,5) -трифосфата

и субъединицы G. J. Biol. Chem. 280, 4166–4173 (2005).

13. Д. Урано, А. Наката, Н. Мизуно, К. Таго, Х. Ито, Домен-доменное взаимодействие P-Rex1

необходимо для активации и ингибирования-субъединицами G-белка и PKA.Клетка. Сигнал.

20, 1545–1554 (2008).

14. М. А. Барбер, С. Дональд, С. Телен, К. Э. Андерсон, М. Телен, Х. К. Э. Велч, Мембрана

Транслокация P-Rex1 опосредуется субъединицами G-белка  и фосфоинозитидом

3-киназой. J. Biol. Chem. 282, 29967–29976 (2007).

15. Л. Тулаби, X. Ву, Ю. Ченг, Ю. Мао, Идентификация и структурная характеристика

фосфоинозитидной фосфатазы Legionella. J. Biol. Chem. 288. С. 24518–24527 (2013).

16. Ф. Сюй, В. Чжу, Л. Бреннан, Л. Тао, З.-К. Луо, Ю. Мао, Структурная основа распознавания субстрата

уникальной фосфоинозитидной фосфатазой Legionella. Proc. Natl. Акад. Sci. США

109, 13567–13572 (2012).

17. Ж.-О. Ли, Х. Ян, М.-М. Джорджеску, А. Ди Кристофано, Т. Маэхама, Й. Ши, Дж. Э. Диксон,

П. Пандольфи, Н. П. Павлетич, Кристаллическая структура супрессора опухолей PTEN: последствия

для его активности фосфоинозитид-фосфатазы и мембранной ассоциации.Cell 99,

323–334 (1999).

18. М. А. Уолл, Д. Э. Коулман, Э. Ли, Дж. А. Иньигес-Ллухи, Б. А. Познер, А. Г. Гилман, С. Р. Спранг,

Структура гетеротримеров G-белка Gi112. Cell 83, 1047–1058 (1995).

19. М. Р. Уортон, Р. Маккиннон, Рентгеновская структура комплекса GIRK2- G-белок

млекопитающих. Природа 498, 190–197 (2013).

20. Д. Т. Лодовски, Дж. А. Питчер, В. Д. Капел, Р. Дж. Лефковиц, Дж. Дж. Г. Тесмер, Сохранение G-белков

на расстоянии: комплекс между G-протеин-связанной рецепторной киназой 2 и G.Science 300,

1256–1262 (2003).

21. Л. Х. Майенуддин, В. Э. Макинтайр, Дж. К. Гаррисон, Дифференциальная чувствительность P-Rex1

к изоформам димеров G белка. J. Biol. Chem. 281, 1913–1920 (2006).

22. Л. Чавес-Варгас, С. Р. Адаме-Гарсия, Р. Д. Сервантес-Виллаграна, А. Кастильо-Кауил,

Дж. Г. Х. Бруйстенс, С. Фукухара, С. С. Тейлор, Н. Мочизуки, Г. Рейес-Крус, Дж. Vázquez-Prado,

Протеинкиназа A (PKA) типа I взаимодействует с P-Rex1, фактором обмена гуаниновых нуклеотидов Rac

.Влияние на локализацию PKA и передачу сигналов P-Rex1. J. Biol. Chem. 291, 6182–6199 (2016).

23. MA Barber, A. Hendrickx, M. Beullens, H. Ceulemans, D. Oxley, S. Thelen, M. Thelen,

M. Bollen, HCE Welch, Фактор гуанин-нуклеотидного обмена P-Rex1 активируется

протеинфосфатазой 1. Биохим. J. 443. С. 173–183 (2012).

24. J. C. Montero, S. Seoane, A. Pandiella, Фосфорилирование P-Rex1 по серину 1169

участвует в передаче сигналов IGF-1R в клетках рака груди.Клетка. Сигнал. 25, 2281–2289 (2013).

25. М. Ф. Бергер, Э. Ходис, Т. П. Хеффернан, Ю. Л. Дерибе, М. С. Лоуренс, А. Протопопов,

Е. Иванова, И. Р. Уотсон, Э. Никерсон, П. Гош, Х. Чжан, Р. Зейд, X Рен, К. Цибульскис,

А.Ю. Сиваченко, Н. Вагл, А. Сукер, К. Сугнез, Р. Онофрио, Л. Амброджо, Д. Оклер,

Т. Феннелл, С.Л. Картер, Ю. Дриер, П. Стоянов, М.А. Сингер, Д. Воет, Р. Цзин, Г. Саксена,

Дж. Барретина, А.Х. Рамос, Т.Дж.Пью, Н. Странски, М. Паркин, В. Винклер, С. Махан,

К. Ардли, Дж. Болдуин, Дж. Варго, Д. Шадендорф, М. Мейерсон, С. Б. Габриэль, Т. Р. Голуб,

С. Н. Вагнер , ES Lander, G. Getz, L. Chin, LA Garraway, Секвенирование генома меланомы

выявляет частые мутации PREX2. Nature 485, 502–506 (2012).

26. Б. Файн, К. Ходакоски, С. Коджак, Т. Су, Л. Х. Саал, М. Маурер, Б. Хопкинс, М. Кенири,

М. Л. Сулис, С. Менс, Х. Хибшош, Р. Парсонс, Активация пути PI3K при раке

посредством ингибирования PTEN фактором обмена P-REX2a.Science 325, 1261–1265 (2009).

27. Н. Сриджакотре, Дж. Ман, Л. М. Оомс, К. М. Лукато, А. М. Эллисдон, К. А. Митчелл, P-Rex1

и P-Rex2 RacGEF и рак. Биохим. Soc. Пер. 45, 963–977 (2017).

28. К. Ходакоски, Б. Д. Хопкинс, Д. Барроуз, С. М. Менс, М. Кенири, К. Э. Андерсон, П. А. Керн,

П. Т. Хокинс, Л. Р. Стивенс, Р. Парсонс, Регулирование ингибирования PTEN с помощью плекстрина

гомологии домен P-REX2 во время передачи сигналов инсулина и гомеостаза глюкозы.

Proc. Natl. Акад. Sci. США 111, 155–160 (2014).

29. SM Mense, D. Barrows, C. Hodakoski, N. Steinbach, D. Schoenfeld, W. Su, BD Hopkins,

T. Su, B. Fine, H. Hibshoosh, R. Parsons, PTEN ингибирует Катализируемая PREX2 активация RAC1

для сдерживания инвазии опухолевых клеток. Sci. Сигнал. 8, ra32 (2015).

30. Р. Кристелли, Г. Гао, Дж. Дж. Г. Тесмер, Структурные детерминанты связывания RhoA

и нуклеотидного обмена в лейкозо-ассоциированном Rho-гуанин-нуклеотидном обмене, фактор

.J. Biol. Chem. 279, 47352–47362 (2004).

31. В. М. Тесмер, Т. Кавано, А. Шанкаранараянан, Т. Козаса, Дж. Дж. Г. Тесмер, снимок

активированных G-белков на мембране: комплекс Gq-GRK2-G. Science 310,

1686–1690 (2005).

32. Р.О. Дрор, Т.Дж. Милдорф, Д. Хильгер, А. Манглик, Д.В. Борхани, Д.Х. Арлоу, А. Филиппсен,

Н. Вильянуэва, З. Ян, М. Т. Лерх, В. Л. Хаббелл, Б. К. Кобилка, Р. К. Сунахара, DE Shaw,

ПЕРЕДАЧА СИГНАЛА.Структурные основы обмена нуклеотидов в гетеротримерных белках

G. Science 348. С. 1361–1365 (2015).

33. T. Kozasa, in G Protein Signaling (Humana Press, New Jersey, 2004), vol. 237, стр. 21–38.

34. C. Suloway, J. Pulokas, D. Fellmann, A. Cheng, F. Guerra, J. Quispe, S. Stagg, C. S. Potter,

B. Carragher, Автоматическая молекулярная микроскопия: новая система Leginon. J. Struct. Биол.

151, 41–60 (2005).

35. Тегунов Д., П.Крамер, Предварительная обработка крио-ЭМ данных в реальном времени с помощью Warp. bioRxiv

338558 [Препринт]. 14 июня 2018 г.

36. А. Пунджани, Дж. Л. Рубинштейн, Д. Дж. Флит, М. А. Брубакер, cryoSPARC: алгоритмы быстрого неконтролируемого определения структуры крио-ЭМ

. Nat. Методы 14. С. 290–296 (2017).

37. Дж. Живанов, Т. Накане, Б. О. Форсберг, Д. Киманиус, В. Дж. Х. Хаген, Э. Линдал,

С. Х. У. Шерес, Новые инструменты для автоматического определения крио-ЭМ структуры высокого разрешения

в РЕЛИОН-3.eLife 7, e42166 (2018).

38. П. Д. Адамс, П. В. Афонин, Г. Бункоци, В. Б. Чен, И. В. Дэвис, Н. Эколс, Дж. Дж. Хедд,

L.-W. Hung, GJ Kapral, RW Grosse-Kunstleve, AJ McCoy, NW Moriarty, R. Oeffner,

RJ Read, DC Richardson, JS Richardson, TC Terwilliger, PH Zwart, PHENIX:

Комплексная система макромолекулярной структуры на основе Python решение.

Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 2010. Т. 66. С. 213–221.

39. Т. К. Тервиллигер, П. Д. Адамс, П. В. Афонин, О. В. Соболев, Полностью автоматический метод

, дающий исходные модели из карт криоэлектронной микроскопии высокого разрешения.

Нат. Методы 15. С. 905–908 (2018).

40. П. В. Афонин, Б. К. Пун, Р. Дж. Рид, О. В. Соболев, Т. К. Тервиллигер, А. Уржумцев,

П. Д. Адамс, Уточнение в реальном пространстве в PHENIX для крио-ЭМ и кристаллографии.

Acta Crystallogr. D Struct. Биол. 74, 531–544 (2018).

Благодарности

Финансирование: Эта работа была поддержана грантами NIH CA221289 (для J.J.G.T., J.S.G. и M.A.C.) и

HL122416 и HL071818 (для J.J.G.T.). J.J.G.T. также была поддержана Фондом Walther Cancer

. Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано NIH под номером

S10OD020011. Вклад авторов: J.N.C. и J.J.G.T. концептуализировал исследование. J.N.C.

и M.D.S. произведен и очищен P-Rex1.J.N.C., J.J.G.T. и M.A.C. разработал методологию

и выполнил определение структуры. С.К.Р. генерировали варианты G и проводили анализы GEF

. J.N.C., M.D.S. и L.V.A. проведены анализы фосфатазы. С.У. и С.Л. собраны и

обработаны данные HDX-MS. J.N.C. написал первоначальный черновик, а J.N.C., J.J.G.T., M.A.C. и J.S.G.

исправил текст рукописи. J.J.G.T., J.S.G. и M.A.C. внесла вклад в исследование.

Конкурирующие интересы: J.S.G. является членом Научного консультативного совета Oncoceutics

Therapeutics and Domain Inc. Все другие авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов.

Доступность данных и материалов: Все данные, необходимые для оценки выводов в документе

, представлены в документе и / или дополнительных материалах. Дополнительные данные, относящиеся к этой статье

, могут быть запрошены у авторов. Структура комплекса P-Rex1-G и связанные данные

были депонированы в банк данных белков под кодом доступа 6PCV, в банк данных электронной микроскопии

под кодом доступа EMD-20308 и в банк данных Electron

. Публичный архив изображений микроскопии под кодом доступа EMPIAR-10285.Плазмиды и другие реагенты

доступны по обоснованному запросу в J.N.C. или J.J.G.T.

Представлено 1 мая 2019 г.

Принято 22 сентября 2019 г.

Опубликовано 16 октября 2019 г.

10.1126 / sciadv.aax8855

Цитата: JN Cash, S. Urata, S. Li, SK Ravala, LV Avramova, MD Shost, JS Gutkind, JJG Tesmer,

MA Cianfrocco, Криоэлектронная микроскопия, структура и анализ сигнального каркаса P-Rex1-G

.Sci. Adv. 5, eaax8855 (2019).

от 16 октября 2019 г. http://advances.sciencemag.org/Загружено с сайта

Cryo-SOFI, обеспечивающее корреляционную световую и электронную криомикроскопию с малыми дозами сверхвысокого разрешения

Significance

Корреляционная световая и электронная криомикроскопия ( cryo-CLEM), комбинация флуоресцентной криомикроскопии (крио-FM) и электронной криомикроскопии, предлагает в высшей степени дополнительную информацию, одновременно используя преимущества оптимальной структурной консервации за счет стеклования (быстрое замораживание без кристаллов) образца.Внедрение методов сверхвысокого разрешения в крио-ФМ позволяет лучше идентифицировать и локализовать редкие события в зашумленных данных электронной криомикроскопии, но высокая интенсивность лазерного излучения представляет проблему для поддержания застеклованного состояния образца. Современные подходы не подходят для многих потенциальных биологических применений крио-CLEM сверхвысокого разрешения. Мы представляем концепцию крио-ФМ сверхвысокого разрешения, основанную на низкой интенсивности лазерного излучения, которая полностью совместима с электронной криомикроскопией и не требует необычной подготовки образцов.Благодаря своей простоте может быть реализован в любой существующей крио-FM системе.

Abstract

Корреляционная световая и электронная криомикроскопия (крио-CLEM) объединяет информацию из специальной маркировки флуоресцентной криомикроскопии (крио-FM) с высоким разрешением в контексте окружающей среды электронной криомикроскопии (крио-ЭМ) . Использование методов сверхвысокого разрешения для крио-ЧМ является преимуществом, так как позволяет идентифицировать редкие события на фоне окружающей среды крио-ЭМ с чувствительностью и разрешением, превосходящими обычные методы.Однако из-за необходимости в относительно высоких интенсивностях лазерного излучения современные методы крио-CLEM сверхвысокого разрешения требуют криозащитных средств или поддерживающих пленок, которые могут сильно снизить качество изображения в крио-ЭМ и несовместимы со многими образцами, такими как клетки млекопитающих. Здесь мы представляем криогенную визуализацию оптических флуктуаций сверхвысокого разрешения (cryo-SOFI), схему визуализации с низкой дозой сверхвысокого разрешения, основанную на принципе SOFI. Поскольку крио-СОФИ не требует специальной подготовки образцов, он полностью совместим с обычными крио-ЭМ образцами и, что важно, не влияет на качество крио-ЭМ визуализации.Применяя крио-СОФИ к различным примерам биологических применений, мы демонстрируем разрешение до ~ 135 нм, что в три раза больше по сравнению с обычным крио-ФМ, при сохранении образца в застеклованном состоянии для последующей крио-ЭМ. Cryo-SOFI представляет собой общее решение проблемы расстекловывания образцов в крио-CLEM сверхвысокого разрешения. Он не требует сложной оптической настройки и может быть легко реализован в любой существующей крио-FM системе.

Электронная криомикроскопия (крио-ЭМ) - мощный метод визуализации биологических структур в их естественной среде с разрешением ангстрем с оптимальной структурной сохранностью (1, 2).Однако прямая идентификация конкретных белков и структур в естественной, но перегруженной клеточной среде остается чрезвычайно сложной задачей. И наоборот, флуоресцентная криомикроскопия (крио-FM) (3⇓⇓⇓ – 7) лучше всего подходит для локализации меченых белков, но не обладает более высокой разрешающей способностью. Таким образом, корреляционная световая и электронная криомикроскопия (крио-CLEM, т. Е. Использование крио-ФМ для помощи в сборе и интерпретации крио-ЭМ данных) приобретает все большее значение (8, 9). В частности, недавнее внедрение методов флуоресценции сверхвысокого разрешения для крио условий (10–13) открыло новую область криомикроскопии с огромным потенциалом для преодоления разрыва в разрешении между двумя методами визуализации и решения широкий спектр биологических вопросов, которые трудно решить с помощью других методов.Однако также стало ясно, что крио-ФМ сверхвысокого разрешения сталкивается с множеством проблем, особенно с риском расстеклования образца во время сбора данных сверхвысокого разрешения (10, 12, 14, 15). Девитрификация - это переход аморфного льда в кристаллическую форму, который происходит при нагревании образца выше -135 ° C (16) и может привести как к повреждению биологических структур, так и к потере контраста в крио-ЭМ. Стало очевидным, что микроскопия локализации одиночных молекул в криоусловиях (крио-SMLM) приводит к локальному расстеклованию образца даже при применении значительно более низких интенсивностей лазерного излучения, чем те, которые используются при температуре окружающей среды (10, 12).Криопротекторы повышают температурный порог для образования кристаллов льда и успешно используются для визуализации бактериальных клеток (10). Однако криозащитные средства несовместимы с клетками млекопитающих из-за их неблагоприятного осмотического действия и, как известно, снижают контраст в крио-ЭМ. ЭМ сетки с покрытием из формвара были исследованы в качестве альтернативы сеткам с углеродным покрытием из-за более низкого поглощения света, что позволило использовать более высокие интенсивности лазера и, следовательно, более высокое разрешение крио-ФМ сверхвысокого разрешения (12).Однако Formvar очень чувствителен к повреждению, вызванному электронным пучком, которое вызывает пузырение и искажение образца в электронном микроскопе и снижает отношение сигнал / шум и качество изображения (12). Общее решение проблемы расстекловывания во время визуализации сверхвысокого разрешения в настоящее время отсутствует, что серьезно затрудняет его применимость для крио-CLEM.

Мы разработали схему крио-FM визуализации со сверхвысоким разрешением, в которой используется достаточно низкая интенсивность лазера для поддержания образцов ниже пороговой температуры расстекловывания.Метод подготовки проб не отличается от установленных протоколов крио-ЭМ и не влияет на разрешение данных крио-ЭМ. Наш алгоритм реконструкции крио-ЧМ-изображений сверхвысокого разрешения основан на принципе визуализации оптических флуктуаций сверхвысокого разрешения (SOFI) (17), поэтому мы назвали этот метод крио-SOFI. Принцип SOFI использует колебания интенсивности флуоресценции в образце во времени. Если посмотреть на корреляцию этих изменений интенсивности, то только флуктуации интенсивности, возникающие от одной и той же молекулы, сильно коррелированы, поскольку флуоресценция соседних молекул (вне режима резонансной передачи энергии Фёрстера) не зависит друг от друга.Построение кумулянта n -го порядка приводит к изображению с улучшением разрешения до n -кратное для пересчитанных перекрестных кумулянтов (18) по сравнению с обычным изображением. Принцип SOFI особенно привлекателен для крио-CLEM сверхвысокого разрешения, поскольку флуктуации интенсивности флуоресценции обнаруживаются при относительно низких интенсивностях лазерного излучения (17), что снижает риск расстекловывания. В отличие от текущего крио-CLEM сверхвысокого разрешения (10, 12), крио-SOFI не полагается на описанные обходные пути подготовки проб и представляет собой общее решение проблемы расстеклования в крио-CLEM сверхвысокого разрешения.Он может применяться ко всем типам образцов и полностью совместим с широко используемыми флуоресцентными белками. Более того, крио-СОФИ не требует сложной оптической установки. Любая крио-FM-система может быть легко адаптирована для крио-SOFI для обеспечения рабочего процесса крио-CLEM сверхвысокого разрешения ( SI, приложение , рис. S1).

Результаты

Целью крио-CLEM сверхвысокого разрешения является объединение дополнительных функций крио-FM и крио-ЭМ на повышенном уровне информационного содержания путем извлечения информации сверхвысокого разрешения из данных флуоресценции.Чтобы продемонстрировать широкий диапазон применения крио-SOFI в этом контексте, мы выбрали три различных биологических примера и три разных флуоресцентных белка в качестве маркеров. Каждый пример демонстрирует, что крио-SOFI обеспечивает четкую и однозначную корреляцию крио-FM и крио-ЭМ данных (рис. 1 и 2) при сохранении образца в застеклованном состоянии ( SI Приложение , рис. S2).

Рис. 1.

Крио-CLEM сверхвысокого разрешения актина в витрифицированных клетках млекопитающих. ( A и G ) Обзоры клеток XC с меченным Dendra2-Lifeact актином, выращенных на ЭМ сетках из углеродной фольги с регулярным рисунком.Эти изображения являются наложением обычного крио-FM (зеленый) и изображения в отраженном свете (серая шкала). (Масштабные линейки: 20 мкм.) ( B и H ) Наложение срезов томограммы среднего увеличения (номинальное 9300 ×) и обычной крио-FM области, указанной в A и G . (Масштаб: 1 мкм.) ( C и I ) Наложения, соответствующие B и H , с изображениями крио-SOFI (кросс-корреляция третьего порядка и деконволюция).(Масштаб: 1 мкм.) ( D , E , J и K ) Увеличенные изображения областей, указанных на соответствующих изображениях в B , C , H и I ; F и L показывают сечения (толщиной 23 нм) соответствующих томограмм, наложенные на проекцию актинсодержащих объемов (голубые), которые были вручную сегментированы во всех томограммах. Трехмерная реконструкция томограмм в F и L есть в фильмах S1 и S2.(Масштаб: 500 нм.)

Рис. 2.

Крио-CLEM сверхвысокого разрешения митохондрий и ER в витрифицированных клетках млекопитающих. ( A ) Наложение монтажа ПЭМ-изображений среднего увеличения (номинальное значение 9300 ×) и обычного крио-FM меченных mClover-TOM20 митохондрий в витрифицированных клетках XC, выращенных на ЭМ-сетках с кружевным углеродным покрытием. ( B ) Наложение, соответствующее A , с изображением крио-SOFI (взаимная корреляция третьего порядка и деконволюция). (Масштаб: 2 мкм.) ( C и D ) Наложение изображений ПЭМ с большим увеличением (50 000 ×) указанных областей (синие прямоугольники) в A и B с обычными крио-FM и крио -SOFI соответственно.( E ) ПЭМ-изображение с выделенными вручную митохондриями. SI Приложение , рис. S2 содержит срез томограммы, проекционное изображение с большим увеличением и спектр мощности областей, отмеченных звездочками в A и B . Полную томограмму, соответствующую срезу в SI Приложение , рис. S2, можно увидеть в фильме S3. (Масштаб: 250 нм.) ( F ) Наложение монтажа ПЭМ-изображений среднего увеличения (номинальное значение 9300 ×) и обычного крио-FM белка, локализующего ER, слитого с mVenus.(Масштаб: 1 мкм.) ( G - I ) Увеличенные изображения областей, указанных в F . (Масштаб: 250 нм.) ( J - M ) Соответствующие наложения с использованием крио-SOFI (кросс-корреляция и деконволюция четвертого порядка). Крио-SOFI в L и M с измененным динамическим диапазоном по сравнению с изображением крио-SOFI, показанным в J . Звездочки в G , H , K и L отмечают везикулярные структуры с сильно ослабленными флуоресцентными сигналами в крио-SOFI по сравнению с обычным крио-FM.(Масштаб: 250 нм.)

Cryo-SOFI существенно улучшил ограничение флуоресцентных сигналов областями, занятыми актином, на томограммах застеклованных клеток XC (линия клеток саркомы Рауса крысы, выращенных адгезивно), стабильно экспрессирующих Lifeact-Dendra2 (рис. 1) E , F , K и L ). Псевдоподии клеток XC содержат большое количество везикул и митохондрий в непосредственной близости от дорожек микротрубочек, усиленных пучками актина в дополнение к кортикальному актину под плазматической мембраной ( SI Приложение , рис.S3 и фильмы S4 и S5). Сигнал крио-SOFI концентрировался в областях между плазматической мембраной и внутриклеточными пузырьками, тогда как сигнал обычного крио-ФМ распространялся далеко за пределы клеточной границы (рис. 1 D - F и J - L ). В частности, пример, показанный на рис. 1 E , подчеркивает, что меченый актин прошел вокруг двух больших везикул и митохондрии в интересующей области (внизу справа, в центре и вверху слева, соответственно), тогда как с обычным крио-FM (Рисунок.1 D ) сигнал флуоресценции перекрывался с этими структурами. Cryo-SOFI был применен к двум дополнительным биологическим системам, чтобы проиллюстрировать дополнительную корреляционную силу, полученную за счет улучшения разрешения крио-FM: ( i ) клетки XC, трансфицированные митохондриальной меткой mClover-TOM20, и ( ii ) клетки COS7, трансфицированные с белком, локализующим эндоплазматический ретикулум (ER), слитым с флуоресцентным белком mVenus. В обоих случаях структуры (митохондрии или мембранные / везикулярные структуры ЭПР), наблюдаемые на томограммах или микрофотографиях, значительно лучше соответствуют распределению сигналов крио-SOFI, что позволяет лучше интерпретировать данные крио-ЭМ на основе информации, полученной от флуоресценции. маркировка (рис.2 и SI Приложение , рис. S4). Например, применение крио-SOFI показало, что некоторые признаки схожего внешнего вида не имели или имели очень слабый соответствующий флуоресцентный сигнал (сравните структуры со звездочками на рис. 2 G , H , K и L и SI Приложение , рис. S4 C и D ). Это может иметь решающее значение для выбора зон для сбора крио-ЭМ данных, которые иначе нельзя было бы идентифицировать с помощью обычного крио-CLEM.

Сохранение остеклованного состояния образца, возможно, является наиболее важным требованием для крио-CLEM сверхвысокого разрешения. Мы скорректировали интенсивность лазера для сбора данных крио-SOFI до ~ 100 Вт / см 2 , что значительно ниже ранее сообщавшихся подходов крио-CLEM сверхвысокого разрешения [~ 3 раза меньше, чем в подходе Chang et al. (10) и в ~ 15 раз меньше, чем метод, описанный Liu et al. (12)]. При интенсивности ∼100 Вт / см 2 мы не видим признаков расстеклования в образцах, приготовленных без криозащитных средств на стандартных ЭМ решетках с дырочными или кружевными углеродными опорами ( SI Приложение , рис.S2). Увеличение интенсивности лазерного излучения всего в два раза уже привело к очевидным изменениям льда в облученных областях и повреждению образца ( SI Приложение , рис. S5). Мы ограничили лазерное освещение круглой областью диаметром ~ 40 мкм, чтобы избежать ненужного выделения энергии за пределами поля зрения, используемого для крио-SOFI. Для восстановления изображения сверхвысокого разрешения с улучшением разрешения в два-три раза (оценка разрешения приведена в приложении SI , рис.S6) по сравнению с обычным крио-ЧМ, время сбора данных 100 с (2000 кадров) обычно было достаточным. Это соответствует сокращению времени в 5-10 раз по сравнению с ранее опубликованными методами (10, 12). В совокупности крио-SOFI существенно снижает относительную дозу фотонов, попадающих на образец, необходимую для получения информации сверхвысокого разрешения и, следовательно, вероятность расстеклования и повреждения образца.

Метод SOFI в целом очень чувствителен к механической нестабильности установки во время сбора данных (17).Поэтому крайне важно было исправить дрейф образца. Коррекция дрейфа на основе автокорреляции ярких деталей была реализована в cryo-SOFI (подробности см. В Материалах и методах ), что позволяет корректировать даже относительно сильное движение предметного столика микроскопа ( SI Приложение , Рис. S7) . Данные, полученные с помощью крио-FM установок, в отличие от установок при комнатной температуре, более восприимчивы к оптическим аберрациям в функции рассеяния точки (PSF), в основном возникающим из-за несовпадения показателей преломления (19).В SOFI артефакты из-за асимметрии в PSF становятся более выраженными для кросс-корреляций более высокого порядка (более высокое разрешение), поскольку внешние области PSF становятся более актуальными. Взаимная корреляция с повторением (20) (подробности см. В Материалах и методах и SI Приложение , рис. S8) минимизирует расстояние между коррелированными пикселями, что уменьшает различия в интенсивности и, таким образом, уменьшает артефакты, связанные с аберрациями в крио-SOFI изображений.

Сильное подавление фона и оптическое разделение по принципу SOFI (17, 21) делают крио-SOFI особенно интересным для клеточных образцов, где он предлагает еще более явное преимущество перед обычным крио-FM.Фоновые и расфокусированные сигналы устраняются во время обработки данных SOFI, поскольку они демонстрируют минимальные временные флуктуации (17, 21). Этот эффект наиболее выражен при визуализации более толстых областей клетки, где мелкие структурные детали могут быть упущены с помощью обычного крио-FM из-за большого расфокусированного фона. Кроме того, очень слабые флуоресцентные структуры также выигрывают от подавления шума, обеспечиваемого крио-SOFI, как показано на рис. 3 для меченого mVenus ER в цельной витрифицированной клетке COS7.

Рис. 3.

Cryo-SOFI меченых mVenus ER в различных областях клетки. Сравнение обычных крио-FM ( A - D ) и крио-SOFI ( E - G ) в областях ячейки с разными оптическими свойствами: ( B и E ) deep = толстый область вокруг ядра; ( C и F ) неглубокий = тонкая периферия клетки; и ( D и G ) weak = соседняя клетка со слабой флуоресценцией. (Масштабные линейки: A , 5 мкм; B - G , 1 мкм.)

Обсуждение

Таким образом, мы продемонстрировали, что крио-SOFI значительно улучшает разрешение флуоресцентных изображений по сравнению с обычным крио-FM при сохранении образцов стекловидного тела. В каждом приложении с крио-SOFI распределение флуоресценции в крио-FM-изображении значительно лучше соответствует структурам, которые, как ожидается, будут содержать соответствующие флуоресцентные белки в соответствующих данных крио-ЭМ. Крио-СОФИ позволяет четко различать близлежащие структуры, что было бы невозможно при использовании обычного крио-ФМ (рис.2 Ф - М ). Эта разработка улучшает интерпретацию данных крио-CLEM и упрощает соответствующие рабочие процессы. Кроме того, мы продемонстрировали успех крио-SOFI с тремя различными флуоресцентными белками, что послужило основой для многоканальных экспериментов. Многоцветный крио-SOFI позволит проводить более разнообразные биологические эксперименты, расширяя возможности крио-CLEM сверхвысокого разрешения.

Мы показали, что крио-SOFI, по сравнению с обычным крио-FM, особенно эффективен для визуализации структур в более толстых частях клетки из-за его способности подавлять расфокусированные сигналы, тем самым достигая оптического разделения.В целом, высокий фон не является благоприятным для SOFI, но в тех случаях, когда такие области внутри ячейки представляют интерес для крио-ЭМ, крио-SOFI предлагает возможности оптического сечения вдоль оси z , сравнимые с конфигурацией конфокального микроскопа (21). . Кроме того, улучшение разрешения для SOFI может быть расширено для получения полного трехмерного изображения со сверхвысоким разрешением (17, 22). Чтобы также добиться улучшения разрешения по оси z , временные ряды нескольких плоскостей фокусировки должны записываться одновременно (22).Эта схема сбора данных потребует значительно более сложной оптической установки, чем описано здесь, но будет выгодна для крио-FM, поскольку относительная доза фотонов, нанесенных на образец, останется прежней. Это делает крио-SOFI особенно перспективным для получения изображений крио-CLEM в сочетании с методами утонения, такими как измельчение сфокусированным ионным пучком. Здесь высокоточная (~ 100 нм) локализация структур в трехмерном объеме имеет важное значение для надежного нацеливания на интересующие области для последующей крио-ЭМ визуализации с пропусканием (5).

Улучшение разрешения SOFI принципиально не ограничивается дифракцией (17). Чувствительность SOFI находится на уровне одной молекулы, поскольку только сигналы отдельных молекул показывают высокую временную корреляцию (17). Как правило, отношение сигнал / шум флуктуаций интенсивности (количество фотонов на одну молекулу «мигает» по сравнению с фоновым сигналом) является ограничивающим фактором для улучшения разрешения с помощью SOFI в биологических образцах (23), что также верно для крио-СОФИ. Фотообесцвечивание уменьшается на несколько порядков в криоусловиях по сравнению с условиями окружающей температуры (24–26), но сочетание низкой интенсивности флуоресценции при визуализации с малой дозой и низкой числовой апертуры (NA) линз объектива, подходящих для крио -FM установки (14) и высокий автофлуоресцентный фон в клеточных образцах (11, 27) ограничили улучшение разрешения в нашей системе для биологических примеров, показанных здесь, в два-три раза.Нам удалось успешно использовать кросс-кумулянты до четвертого порядка, что дает разрешение до ∼135 нм ( SI Приложение , рис. S6 содержит более подробную информацию). Для высокой плотности флуоресцентных молекул, которые обычно имеют место в биологических образцах, требуется более длительное время сбора данных для восстановления необходимой информации для реконструкций SOFI более высокого порядка (18). Для крио-SOFI более длительное время сбора данных особенно неблагоприятно с точки зрения риска расстекловывания образца.Более высокие порядки теоретически дадут более высокое разрешение, но также более подвержены артефактам, поскольку динамический диапазон обычного широкоугольного изображения имеет тенденцию экспоненциально увеличиваться для реконструкций SOFI, масштабируясь с использованием порядка SOFI. Кроме того, оптические аберрации, которые приводят к асимметричной PSF или несовместимой PSF в поле зрения, а также ошибки в коррекции механической нестабильности с течением времени влияют на результирующее изображение крио-SOFI. Чем выше порядок корреляции, тем большее влияние эти несоответствия оказывают на результирующее изображение.Следовательно, более стабильная установка, специальные линзы криообъективов, а также флуорофоры с улучшенными характеристиками «мигания» в криоусловиях позволили бы использовать более высокие порядки и тем самым дополнительное улучшение достижимого разрешения.

По сравнению с крио-СМЛМ (10⇓ – 12) разрешение крио-СОФИ достигает аналогичного диапазона, но требуемая интенсивность лазера в несколько раз ниже. Лю и др. (12) продемонстрировали, что крио-SMLM имеет потенциал для достижения значительно более высокого разрешения.Однако это потребовало специальной обработки образца и подложки, что не подходит для последующей крио-ЭМ-визуализации (12).

Коррекция механического дрейфа полученных необработанных данных важна для крио-SOFI. Типичные артефакты движения во время сбора данных изображены в приложении SI , рис. S7. Этот тип артефакта может быть идентифицирован путем сравнения крио-SOFI-изображения с обычным крио-FM-изображением. Дополнительные относительно резкие детали ошибочно вводятся в крио-SOFI-изображения по краям флуоресцентных структур в обычных крио-FM-изображениях.Истинные особенности более высокого разрешения должны быть обнаружены в области PSF обычных крио-FM изображений (сравните SI Приложение , Рис. S7 E и H ). Если дрейф в основном однонаправленный, это также отразится на ориентации артефактов и поможет их идентифицировать. Активная коррекция дрейфа во время измерения может еще больше улучшить результаты крио-SOFI, поскольку она уже успешно реализована для крио-SMLM (12). Кроме того, оптические аберрации (например,g., сферические аберрации, кома), вызванные несоответствием показателя преломления (например, при съемке в более толстом льду) или изменениями температуры в линзе объектива (14, 15), могут отрицательно сказаться на качестве всех методов визуализации сверхвысокого разрешения (28). ). В случае крио-SOFI артефакты, вызванные оптическими аберрациями, обычно труднее идентифицировать, поскольку они более тонкие, чем артефакты от механической нестабильности (сравните SI Приложение , рис. S7 и S8). Однако признаком артефактов, возникающих из-за оптических аберраций в изображениях крио-SOFI, являются повторяющиеся небольшие особенности размера SOFI PSF ( SI, приложение , рис.S8). Адаптивная оптическая коррекция может быть непосредственно реализована в специальной установке крио-SOFI таким же образом, как она была успешно реализована в установке SMLM для температуры окружающей среды (29). Это связано с тем, что и SOFI, и SMLM используют обычный широкопольный микроскоп, в котором адаптивная оптическая коррекция необходима только на пути обнаружения. Коррекция оптических аберраций станет еще более важной с появлением крио-иммерсионных линз (19) для крио-ЧМ сверхвысокого разрешения.Faoro et al. (19) недавно продемонстрировали, что небольшие различия в температуре или показателе преломления иммерсионной среды приводят к серьезным аберрациям PSF при использовании криоиммерсионных линз объектива. Хотя разрешение описанной криоиммерсионной линзы объектива с номинальной числовой апертурой 1,15 было аналогично разрешающей способности воздушной линзы с числовой апертурой 0,9 в крио-условиях, эффективность обнаружения была улучшена в 2,7 раза (19). Повышенная эффективность обнаружения улучшит достижимые разрешения как крио-SOFI, так и других подходов крио-FM сверхвысокого разрешения из-за большего количества фотонов на сигнал одной молекулы.

Материалы и методы

Подготовка проб.

Клетки

XC (предоставлены Квентином Саттентау, Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания) и клетки COS7 размножали в Gibco DMEM GlutaMAX (Thermo Fisher) с 10% FCS при 37 ° C и 5% CO 2 . Для создания стабильных клеточных линий, экспрессирующих Dendra2-Lifeact, клетки XC трансфицировали pDendra2-Lifeact-7 [pDendra2-Lifeact-7 был подарком Майкла Дэвидсона, Университет штата Флорида, Таллахасси, Флорида (плазмида Addgene 54694)] с использованием X-tremeGENE Реагент для трансфекции ДНК HP (Sigma), выбранный с помощью G-418 (Sigma).Ячейки, использованные для этого исследования, как правило, избегали роста над отверстиями в углеродной опорной пленке электромагнитных решеток и вместо этого сгруппировались с металлическими стержнями; В результате в крио-ЭМ можно было визуализировать лишь небольшое количество клеток. Чтобы решить эту проблему, листы оксида графена (GO) были нанесены на электромагнитные сетки, чтобы сформировать непрерывную поверхность и лучшую подложку для клеточной адгезии, используя метод, основанный на работе Bokori-Brown et al. (30). Многослойные листы GO флуоресцентны, но их можно удалить центрифугированием, и мы не наблюдали существенного увеличения фоновой флуоресценции на сетках с покрытием GO по сравнению с обычными сетками.Сетки для поиска золота с тлеющим разрядом (Quantifoil) инкубировали с раствором GO, промывали водой и давали высохнуть. Однако мы обнаружили, что GO отделяется от углеродного носителя во время покрытия клеточным адгезионным материалом и последующей культуры клеток. Чтобы предотвратить это, GO был поперечно связан с углеродным носителем с использованием 4% параформальдегида, промыт водой и покрыт фибронектином 50 мг / мл в PBS. Клетки выращивали на решетках с покрытием в течение 24 ч перед погружным замораживанием. Клетки XC трансфицировали плазмидой, содержащей mClover-TOM20 [Clover-TOMM20-N-10 был подарком Майкла Дэвидсона (плазмида Addgene 56307) (31)], и выращивали на золотых решетках с однослойным GO на липкой углеродной подложке ( EM Resolutions), покрытые фибронектином.Для получения клеток COS7 с ER, меченным mVenus, клетки трансфицировали с использованием Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher) плазмидой (предоставленной Еленой Сейрадак, Оксфордский университет, Оксфорд, Великобритания), которая состоит из трансмембранной спирали слитого человеческого RPTPmu. в mVenus. Трансфицированные клетки отделяли трипсином и высевали на сетки, покрытые углеродом (Quantifoil), а затем их выращивали в течение 24 часов перед замораживанием.

Установка Cryo-SOFI и сбор данных.

Мы модифицировали коммерческую крио-FM систему (Cryo CLEM; Leica), оснащенную 50 × 0.Линза объектива 9-NA (Cryo CLEM Objective HCX PL APO 50 × / 0,9; Leica) для визуализации крио-SOFI путем подключения лазеров (iChrome MLE; Toptica) к корпусу микроскопа для возбуждения флуорофора и фотопереключения. Лазерный свет после одномодового волокна коллимировался с помощью ахроматической линзы с фокусным расстоянием 19 мм для получения освещенной области диаметром ∼40 мкм в плоскости объекта. Схематическое изображение дополнительно необходимого оборудования приведено в Приложении SI , рис. S1. Для всех представленных здесь биологических примеров данные были получены с использованием 488-нм лазерного освещения и стандартного куба фильтра GFP системы микроскопа (возбуждение: 470/40; дихроичный: 495 проход нижних частот; излучение: 525/50).Обзорные изображения, записанные с помощью стандартной камеры CCD (DFC365 FX; Leica). Данные Cryo-SOFI были записаны с помощью камеры на ПЗС-матрице с электронным умножением (EMCCD) (iXon Ultra 897; Andor) и с дополнительным 2-кратным увеличением для достижения общего 100-кратного увеличения для соответствия большему размеру пикселей камеры EMCCD. Типичными настройками камеры для сбора данных крио-SOFI было время интегрирования 50 мс на кадр (со скоростью 20 кадров в секунду) для временного ряда из 2000 изображений с коэффициентом усиления ЭМ 20–200.

Крио-SOFI Коррекция дрейфа и реконструкция изображения.

Дрейф и другие механические нестабильности были определены с использованием подхода, основанного на автокорреляции. В качестве эталонных объектов использовались яркие структуры в образце или добавленные реперные маркеры. Какой бы сигнал ни использовался для коррекции дрейфа, важно иметь очень высокую плотность флуоресцентных молекул, чтобы предотвратить ошибки в оценке дрейфа из-за флуктуаций интенсивности. Каждое изображение в стеке данных сравнивалось с первым с помощью процедуры findshift из набора инструментов DIPimage (iplib.org) для MATLAB (Mathworks). Обычно (в зависимости от размера пикселя необработанных данных) для принципа SOFI важно определить дрейф выборки с субпиксельной точностью. Полученные поперечные смещения для каждого изображения в стеке необработанных данных затем используются для коррекции смещения во время сбора данных.

Реконструкция изображения Cryo-SOFI по данным с коррекцией дрейфа была выполнена, как описано ранее для SOFI при температуре окружающей среды (17, 18). Для крио-SOFI, где аберрации в PSF могут быть более серьезными, пристальное внимание нужно было уделять влиянию асимметрии в PSF на кросс-корреляционные изображения SOFI.По сравнению с автокорреляцией SOFI, которая основана на реальных физических пикселях камеры (и ограничена ими), кросс-корреляционная SOFI (XCn) использует виртуальные пиксели между физическими пикселями в необработанных изображениях: XCn (r → 1 ,…, R → n, τ1,…, τn) = ∏j <1nU (r → j − r → ln) ⋅∑i = 1NUn (r → i − ∑k = 1nr → kn) ⋅ϵin⋅ωi (τ1 ,…, Τn), [1]

, где r → - положение коррелированных пикселей, U - PSF исходных изображений, ω - временной весовой коэффициент, а τ - временные задержки между каждым пикселем (17) .Функция PSF в уравнении. 1 подразумевает, что вычисленное положение пикселя r → находится в геометрическом центре коррелированного пикселя. Он также показывает, что каждый пиксель в изображении SOFI зависит от коэффициента коррекции расстояния между пикселями U (r → j-r → ln), который корректирует разницу в интенсивности из-за разницы в расстоянии от коррелированного пикселя (18). Этот коэффициент коррекции пикселей очень чувствителен к оптическим аберрациям в системе. Кросс-корреляционные изображения SOFI можно рассчитать двумя разными способами (20).Один использует только разные пиксели (взаимная корреляция без повторов). Это приводит к большему количеству информации, используемой для вычисления значения пикселя SOFI (20), к большим расстояниям между коррелированными пикселями и, таким образом, к более высокой вероятности аберраций, влияющих на результирующее изображение сверхвысокого разрешения. Это происходит потому, что PSF, сформированный при наличии оптических аберраций, имеет изоповерхность FWHM больше, чем оптимальная PSF (28). Используя разные пиксели, но позволяя повторять некоторые из них, получается взаимная корреляция с повторением (20).Это минимизирует расстояние между коррелированными пикселями, чтобы минимизировать эффекты аберраций в PSF (подробности и пример приведены в SI Приложение , рис. S8). Поправки на расстояние между пикселями вычислялись путем сравнения автокорреляционного изображения второго порядка с изображением, вычисленным с помощью взаимной корреляции второго порядка. Разница между ними заключается в поправочном коэффициенте расстояния между пикселями: U (r → 1-r → 22) с положениями r → 1 и r → 2 пикселей по обе стороны от автокоррелированного пикселя.

PSF, используемый для деконволюции, был получен путем деления изображения SOFI на одно из соответствующих изображений на порядок ниже (сравните уравнение 1 для порядка n и n - 1). Таким образом, фактическая PSF была получена непосредственно из каждого эксперимента. Это минимизирует артефакты, типичные для деконволюции из-за применения неточной PSF. Для всех биологических примеров, показанных здесь, взаимная корреляция SOFI до третьего или четвертого порядка давала хорошие изображения сверхвысокого разрешения.В сочетании с деконволюцией это привело к увеличению разрешения примерно в два-три раза. Код MATLAB для реконструкции изображений cryo-SOFI можно загрузить по следующей ссылке: https://github.com/rainerkaufmann/cryoSOFI/releases.

Крио-ЭМ визуализация.

Микрофотографии были получены на Tecnai F30 «Polara» (FEI), работающем при 300 кэВ с постколоночным энергетическим фильтром QUANTUM 964 (Gatan), работающим в режиме нулевых потерь с использованием энергетической щели 20 эВ и прямого электронного детектора K2 Summit (Gatan). ) работает в режиме счета на 2.Размер пикселя 84, 4,22 или 23,1 Å. Во время сбора данных использовалась апертура C2 размером 70 мкм. По возможности, серии наклона собирались в двух направлениях от -55 ° до 59 ° с шагом 3 ° с 10 кадрами на изображение. Рамки выравнивали с помощью Unblur (32), а томограммы реконструировали с помощью IMOD Etomo (33). Томограммы были разделены на два или восемь раз и отфильтрованы полосой пропускания для визуализации с помощью Bsoft (34). Необработанные томограммы изображений, представленных на рис. 1 D - F и J - L и SI Приложение , рис.S2 B и S3 B и C депонированы как EMD-4471–4473 в EMDB.

Наложение крио-FM и крио-EM изображений.

Наложения крио-FM (обычных и крио-SOFI) и крио-ЭМ изображений были выполнены путем идентификации различных функций, видимых в обоих режимах визуализации, и отметки их положения с помощью инструмента выбора контрольной точки MATLAB (Mathworks). Эти позиции позволили нам определить преобразование между различными системами координат.Для биологических образцов, представленных здесь, можно определить достаточное структурное сходство между крио-FM и крио-ЭМ изображениями для корреляции. В других случаях реперные маркеры, видимые в крио-FM и крио-EM, могут использоваться для определения преобразования координат и наложения изображений (35, 36).

Благодарности

Мы благодарим Э. Ивонн Джонс, Джордана Раффа, Илана Дэвиса и Яна М. Добби за плодотворные обсуждения и постоянную поддержку. Мы признательны за поддержку британскому гранту A17721 по исследованию рака, стипендию 339062 Канадского института исследований в области здравоохранения (Л.AB), Wellcome Trust Grants 107806 / Z / 15 / Z (для KG) и 107457 / Z / 15 / Z (для Micron Oxford), грант Human Frontier Science Program Grant RGP 0055/2015 (для KG) и Freigeist Fellowship Фонда Volkswagen (по РК).

Сноски

  • Автор: К.Г. и Р.К. спланированное исследование; Ф.М., В.П., В.М., Л.А.Б. и Р.К. проведенное исследование; D.M.A. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; Ф.М., В.П., Р.К. проанализированные данные; и F.M., V.P., V.M., D.M.A., L.A.B., C.Х., К.Г. и Р.К. написал газету.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья представляет собой прямое представление PNAS.

  • Размещение данных: Исходные данные томограмм, представленные в этой статье, были депонированы в EMDB (инвентарные номера EMD-4471 – EMD4473).

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.18106/-/DCSupplemental.

  • Авторские права © 2019 Автор (ы).Опубликовано PNAS.

Надежность обнаружения сигналов в криоэлектронной микроскопии с помощью подхода с двумя целевыми функциями | BMC Bioinformatics

Краткий обзор целевых функций, используемых для выравнивания сигналов

В наборе из N одночастичных изображений, каждое из которых является зашумленной, переведенной и повернутой копией базовой 2D-проекционной структуры A , изображение i -е может быть представлено уравнением.

$$ {\ boldsymbol {X}} _ i = R \ left ({\ phi} _i \ right) \ boldsymbol {A} + {\ sigma \ boldsymbol {G}} _ i, \ kern1em i = 1,2, \ точки N, $$

(1)

, где X i - это наблюдаемое i -е изображение, содержащее J пикселей со значениями X ij ; R ( ϕ i ) обозначает преобразование в плоскости, зависящее от вектора параметров ϕ i = ( α i 27, 7 x i , y i ), который включает поворот α i и два смещения x i и y i по двум ортогональным направлениям ; A - базовый сигнал со значениями пикселей A j , который является общим для всех изображений; G i - шум гауссова распределения со стандартным отклонением единицы, дополнительно масштабируемый скалярным коэффициентом σ . 2 $$

(4)

Локальная минимизация этой функции может быть получена путем итеративного максимизации взаимной корреляции между каждым изображением и средним значением.NP \ left ({\ boldsymbol {X}} _ i | \ varTheta \ right) $$

(6)

, где P ( X i | Θ ) - это функция плотности вероятности, наблюдаемая для изображения X i с учетом набора параметров модели Θ = A , σ , ξ ), где ξ характеризует статистику R ( ϕ i ).N \ ln \ int P \ left ({\ boldsymbol {X}} _ i | \ phi, \ varTheta \ right) P \ left (\ phi | \ varTheta \ right) d \ phi $$

(7)

Локальный максимум функции логарифма правдоподобия L ( Θ ) может быть получен путем нахождения значения Θ , при котором частные производные L ( Θ ) равны нулю. {- 1} \ left (\ phi \ right) {\ boldsymbol {X}} _ i d \ phi $$

(11)

Все остальные параметры модели в Θ ( n + 1) обновляются на M-шаге аналогично средневзвешенным значениям [24].

Также необходимо учитывать математические взаимосвязи и различия между подходами к выравниванию изображений. Во-первых, при восстановлении сигнала A последний подход использует взвешенное по вероятности среднее вместо детерминированного среднего, используемого в первом подходе, как показано различиями между уравнениями. (2) и (11). Во-вторых, если предположить, что оценка скрытой переменной Φ является детерминированной, а не вероятностной, P ( ϕ i | X i , Θ , Θ , n ) ) принимает форму δ-функции Дирака.При этом условии максимизация логарифмической функции правдоподобия, показанная в уравнении. (9) упрощается до минимизации цели наименьших квадратов, показанной в выражении (5), вместо цели наименьших квадратов с вероятностью в уравнении. (9). В то же время оценка сигнала по ур. (11) можно свести к ур. (2). В-третьих, несмотря на эту условную эквивалентность с точки зрения численной оптимизации, два подхода принимают существенно разные целевые функции, которые включают разные переменные и параметры, что подтверждается сравнением уравнений.(5) и (8). Важно отметить, что все параметры модели Θ = ( A , σ , ξ ) переоцениваются во время каждой итерации оптимизации в последнем подходе, тогда как только один тип параметра модели, A , переоценивается в ходе оптимизации в первом подходе.

Ранее предложенные решения проблемы сбора частиц в основном основывались на подходе, основанном на взаимной корреляции. В типичном случае локально нормализованная корреляционная функция вычисляется между поисковым объектом S (шаблон) и целевой микрофотографией T под отпечатком маски M [8]:

$ $ {C} _L (x) = \ frac {1} {P} {\ sum} _ {k = 1} ^ J \ frac {\ left ({S} _k- \ overline {S} \ right) {M } _k \ left ({T} _ {k + x} - \ overline {T} \ right)} {\ sigma_S {\ sigma} _ {MT} (x)} $$

(12)

, где \ (\ overline {S} \) и σ S - среднее и стандартное отклонение поискового объекта S k ; \ (\ overline {T} \) и σ MT - это локальное среднее значение и стандартное отклонение T в пределах зоны покрытия маски M ; x - это положение контура маски M , а P - общее количество ненулевых точек внутри маски.2 $$

(14)

Эта и другие аналогичные реализации стратегии выбора частиц в совокупности называются «сопоставлением с шаблоном». Поскольку размер изображения S намного меньше, чем размер изображения T , локальная взаимная корреляция вычисляется с помощью маски M растрового сканирования по всей микрофотографии для получения взаимной корреляции. карта. Локальный максимум на карте корреляции идентифицируется, ранжируется и используется для указания положения выбранного изображения частицы-кандидата.Функция FLC, выраженная в ур. (13) привело к более эффективной реализации вычислительной процедуры отбора частиц [8, 12, 13].

Как объяснялось выше, функция FLC заметно отличается от MLE в распознавании сигналов в их математической форме. В отсутствие шума функция взаимной корреляции и MLE должны привести к одному и тому же решению проблемы совмещения изображений [24]. Однако в присутствии шума FLC и MLE ведут себя по-разному [24]. FLC очень быстр и эффективен в вычислениях.Тем не менее, он демонстрирует возрастающую склонность к идентификации ложноположительных частиц или к неправильному выравниванию по мере уменьшения отношения сигнал / шум [8, 12, 13]. Напротив, за счет значительно большей вычислительной мощности исчерпывающий поиск вероятностей в пространстве параметров в MLE существенно снижает влияние ложных срабатываний на итерациях алгоритма максимизации ожидания. Средние, взвешенные по вероятности, дополнительно ограничивают вклад ложных срабатываний и несовпадения в оценку сигнала.Следовательно, FLC и MLE дополняют друг друга в их реакциях на шум, а также в их вычислительной эффективности.

Процедура BOF-подхода

На протяжении всего этого исследования следующая процедура, основанная на BOF, применялась к 26 наборам данных либо чистого шума, либо смоделированных микрофотографий тримерного эктодомена гликопротеина гемагглютинина (HA) гриппа [44], а также набор экспериментальных данных микрофотографий фокальных пар комплекса глюкозоизомеразы 173 кДа.Стратегия BOF и реализация процедуры BOF показаны на рис. 1, a и b, соответственно.

Рис. 1

Стратегия и реализация подхода BOF. a Подход BOF предполагает использование двух разных целевых функций. Первая целевая функция связана с обнаружением частиц, а вторая - с проверкой частиц. b BOF-подход, использованный в этом исследовании, сочетает целевые функции FLC и MLE, которые не являются математически эквивалентными или коррелированными.Определяемые пользователем шаблоны / ссылки показаны в пунктирных прямоугольниках, обозначенных номенклатурой, используемой в этой рукописи.

Шаг 1: Отбор частиц с помощью быстрой локальной взаимной корреляции

Мы использовали сопоставление шаблонов с помощью FLC, реализованное в SPIDER, для отбора частиц [45 ]. Система SPIDER представляет собой комплексный программный пакет для обработки изображений, который поддерживает быстрое создание сценариев для обработки пакетной обработки крио-ЭМ данных [45]. Сценарий SPIDER lfc_pick.spi уже был применен к рибосоме [12] и послужил контролем для недавней разработки подхода безреференсного сбора частиц [35].Эта процедура применяет функцию FLC к распознаванию частиц [8]. В этом исследовании мы отбирали частицы, используя отдельные 2D-шаблоны, как описано в конкретных экспериментах ниже. Обратите внимание, что предыдущие исследования показали, что с помощью функции FLC с одним шаблоном можно выбрать множество видов частиц [12]. Тем не менее, было высказано предположение, что использование большего количества шаблонов потенциально может уменьшить количество выбираемых ложных срабатываний [8, 12, 13].

Шаг 2: Выбор частиц-кандидатов с использованием порога ранжирования пиков корреляции и ручное отклонение очевидных артефактов

Программа сбора частиц SPIDER lfc_pick.spi сортирует и ранжирует отобранные частицы в соответствии с их пиками корреляции, от высоких до низких значений пиков. После сортировки и ранжирования потенциальные истинные частицы часто появляются при более высоких значениях пиков корреляции, а изображения чистого шума - при более низких пиках корреляции. Порог, который приблизительно разграничивает границу между потенциальными истинными частицами и чистым шумом, может использоваться для выбора исходных частиц-кандидатов с последующей проверкой каждой частицы вручную и отклонением очевидных артефактов.Отказ от предполагаемых артефактов и ложных срабатываний может быть выполнен в пакетном режиме, если отобранные частицы сгруппированы во многие 2D-классы с помощью многомерного статистического анализа или неконтролируемой кластеризации [15, 19, 46, 47].

Этап 3: Подтверждение соответствия частиц путем согласования MLE с несколькими классами

Сходство изображения, измеренное с помощью вероятности на основе MLE, и впоследствии рассчитанные средние значения классов, полученные путем интегрирования по всем вероятностям, более чувствительны к наличию истинных сигналов [24 ].Частицы, принадлежащие к классу средних значений, которые четко демонстрируют ожидаемые характеристики сигнала, выбираются для дальнейшей обработки; затем можно отбросить частицы среднего класса, которые являются подозрительными или явно ошибочными. Этот шаг обеспечивает удобную контрольную точку для эффективного удаления нечастиц в пакетном режиме.

BOF тестирование смоделированных и экспериментальных микрофотографий шума

Для проведения базового контроля мы сначала смоделировали 200 микрофотографий, содержащих только гауссов шум, с помощью команды MO SPIDER (опция R с гауссовым распределением).Каждая микрофотография имела размеры 4096 × 4096 пикселей. Затем мы использовали одну проекцию тримера оболочки гликопротеина (Env) вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) ~ 11 Å [28] в качестве шаблона для отбора частиц из смоделированных микрофотографий с гауссовым шумом. Размер бокса составлял 256 × 256 пикселей. Хотя микрофотографии могут быть объединены в два или четыре раза для ускорения вычислительной процедуры отбора частиц с помощью FLC, необходимо извлекать частицы из исходных микрофотографий без объединения, поскольку они требуются для 3D-реконструкции с высоким разрешением на более поздних этапах реального сценария. определения структуры [48].На каждой микрофотографии было выбрано около 20-25 изображений наивысших локальных корреляционных пиков, чтобы собрать стопку частиц из 4485 изображений. После сбора и выбора частицы изображение каждой частицы масштабировалось 4 раза до 64 × 64 пикселей с помощью xmipp_scale и нормализовалось с помощью xmipp_normalize [49]. Последующее выравнивание MLE с использованием xmipp_ml_align2d было повторено с тремя разными начальными эталонами: (1) изображение шума, случайно выбранное из всего стека изображений, которое содержит слабый сигнал, который, вероятно, внесет некоторую ошибку инициации; (2) гауссовский круг, который следует гауссовскому распределению по радиальной интенсивности и не вносит никакого предварительного смещения в эталон; и (3) среднее значение случайного подмножества невыровненных изображений, которое копирует шаблон, используемый для отбора частиц, который можно использовать для проверки эталонной зависимости выравнивания MLE.Сравнение этих трех случаев позволит нам изучить, влияет ли и как исходный эталон, используемый для MLE, на потенциальную способность MLE подавлять эталонную зависимость, возникающую во время отбора частиц на основе FLC.

Чтобы повторить вышеупомянутый BOF-тест на реальном экспериментальном ледяном шуме, мы визуализировали криосетку, которая была мгновенно заморожена из буфера, не содержащего образца белка. Состав буфера: 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 300 мМ NaCl и 0,01% Cymal-6 (Anatrace, США).Это был тот же самый буфер, который использовался для витрификации тримера Env ВИЧ-1 для его крио-ЭМ структурного анализа [28, 32]. Криосетка была изготовлена ​​из углеродной сетки с отверстиями в форме буквы С с использованием прибора FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, США). Данные собирали на микроскопе FEI Tecnai G2 F20 (Thermo Fisher Scientific, США) при напряжении 120 кВ, оснащенном CCD-камерой Gatan Ultrascan 4096 × 4096 пикселей (Gatan, США), при номинальном увеличении 80 000 ×. Мы отобрали 218 микрофотографий чистого ледяного шума, полученных за один сеанс крио-ЭМ.Та же процедура отбора частиц, что и для микрофотографий смоделированного гауссова шума (см. Выше), была применена к экспериментальным микрофотографиям ледяного шума с тем же шаблоном тримера Env ВИЧ-1. После сбора частиц очевидные примеси ледяных кристаллов были вручную отброшены из набора частиц, оставив только изображения аморфного ледяного шума. Путем выбора только приблизительно 10-25 изображений в рамке с наивысшими локальными корреляционными пиками из каждой микрофотографии, была собрана стопка частиц из 4591 изображения, которая была подвергнута такому же выравниванию MLE, как описано выше для данных из микрофотографий смоделированного гауссова шума.Эти тесты BOF как на смоделированных, так и на экспериментальных микрофотографиях чистого шума (рис. 2) служили в качестве контроля для последующего изучения подхода BOF.

Рис. 2

Результаты конвертерного конвертера для смоделированных и экспериментальных данных чистого шума. a Схематическая блок-схема, показывающая, что «частицы» были взяты с помощью FLC из микрофотографий чистого шума, с использованием одной проекции тримера оболочки гликопротеина (Env) ВИЧ-1 в качестве матрицы. Отобранные частицы были подвергнуты выравниванию MLE с использованием различных исходных эталонов. b - d Набор частиц, отобранный FLC, полученный из микрофотографий с моделированием гауссовского шума, был выровнен с помощью MLE, начиная с изображения шума, случайно выбранного из набора частиц ( b ), гауссовского круга ( c ) или среднее значение отобранных частиц ( d ). Начальная ссылка для оптимизации MLE показана в первом столбце. Каждая строка показывает историю средних значений классов, согласованных с MLE, на указанных итерациях оптимизации, заканчиваясь соответствующими средними конвергентными классами в крайнем правом столбце. e - g Набор частиц, подобранный FLC, полученный из экспериментальных микрофотографий ледового шума и выровненный с помощью MLE, начиная с изображения шума, случайно выбранного из набора частиц ( e) , гауссова окружность ( f ) или среднее значение отобранных частиц ( г, ). Средние значения, показанные в ( d ) и ( g ), выглядят как созданная FLC копия 2D-шаблона, используемого для отбора частиц

BOF-тестирование смоделированных микрофотографий

На протяжении всего этого исследования SNR определялось как отношение дисперсии сигнала к дисперсии шума [3, 50],

$$ \ mathrm {SNR} = {\ sigma} _ {Signal} ^ 2 / {\ sigma} _ {Noise} ^ 2 $$

(15)

Когда среднее значение фонового шума равно нулю, его мощность P Шум равна его дисперсии \ ({\ sigma} _ {Noise} ^ 2 \).2 \), и отношение мощности сигнала к шуму, таким образом, равно отношению дисперсии. SNR микрофотографии рассчитывали как отношение мощности сигнала от всех частиц к фоновому шуму на этой микрофотографии. Для отношения сигнал / шум изображения с одной частицей дисперсия шума была рассчитана на обведенной рамкой фоновой области без каких-либо частиц, а дисперсия сигнала была рассчитана на изображении частицы того же размера коробки без фонового шума.

Мы смоделировали 120 микрофотографий бесшумных частиц, соответствующих кристаллической структуре гликопротеинового эктодомена гемагглютинина (НА) вируса гриппа А (PDB ID: 3HMG), используя xmipp_phantom_create_micrograph [44].Моделирование предполагало размер пикселя 1,0 Ангстрем и размеры микрофотографии 4096 × 4096 пикселей. Чтобы смоделировать эффект аберрации линзы объектива в электронной микроскопии, функция передачи контраста (CTF) была применена в преобразовании Фурье смоделированных бесшумных микрофотографий с использованием отдельного скрипта SPIDER. Моделирование CTF предполагало ускоряющее напряжение 200 кВ, дефокусировку -1 мкм, сферическую аберрацию Cs 2,0 мм, коэффициент контрастности амплитуды 10% и полуширину огибающей по Гауссу равную 0.333 Å - 1 . На каждой смоделированной микрофотографии было 323 молекулы НА, которые принимали случайные ориентации. Чтобы добавить различные уровни гауссовского шума к бесшумным микрофотографиям, стандартное отклонение фона каждой микрофотографии было вычислено и использовано в качестве входных данных для моделирования фонового изображения гауссовского шума, которое было добавлено к бесшумным микрофотографиям. Смоделированные микрофотографии с гауссовым шумом аддитивно дали ОСШ 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002, 0,001 или 0,0005. Типичная серия, состоящая из смоделированной бесшумной микрофотографии и полученных зашумленных микрофотографий при различных ОСШ, показана в Дополнительном файле 1: Рисунок S1.Сравнение соответствующего поведения спектров мощности в пространстве Фурье показано на рис. 3. Обратите внимание, что ОСШ, вычисленное для всей микрофотографии, часто ниже, чем ОСШ, вычисленное из изображений одиночных частиц в рамке, поскольку имеется больше пустых областей фона. на микрофотографии, чем на изображениях отдельных частиц, помещенных в прямоугольную рамку.

Рис. 3

Фурье-поведение смоделированных микрофотографий. a Спектры мощности смоделированных микрофотографий с различным отношением сигнал / шум. b Вращательные средние спектра мощности бесшумной микрофотографии до и после применения эффекта CTF. c Вращательные средние спектров мощности смоделированных зашумленных микрофотографий. d Спектральные отношения сигнал / шум (SSNR) смоделированных зашумленных микрофотографий

Для смоделированных микрофотографий при каждом значении SNR мы провели BOF-тесты с использованием трех различных шаблонов для сбора частиц: гауссовского круга, одного проекционного изображения тример HA вируса гриппа отфильтрован до 30 ангстрем, а один вид в проекции тримера Env ВИЧ-1 отфильтрован до 30 ангстрем (рис.4). Каждый набор микрофотографий с заданным SNR и выбранным конкретным шаблоном отбора частиц рассматривался как отдельный случай. Таким образом, в наших BOF-тестах было изучено и сопоставлено 8 × 3 = 24 случая. Для каждого случая набор из 38 760 изображений частиц был собран из 120 смоделированных микрофотографий, исходя из порога отбора 323 частиц на микрофотографию. Исходный размер окна для сбора частиц составлял 180 × 180 пикселей. После сбора и выбора частиц каждое изображение частицы сначала масштабировалось 3 раза до размера 60 × 60 пикселей, нормализовалось для фонового шума и подвергалось многоканальной классификации MLE на 5 классов с использованием двух разных исходных эталонов: (1) среднее от случайно выбранного подмножества частиц (рис.5) и (2) гауссовский круг, который следует гауссовскому распределению по радиальной интенсивности (рис. 6). При экстраполяции к SNR изображений отдельных частиц, SNR всей микрофотографии необходимо умножить на коэффициент (> 1), который зависит от плотности частиц и размера ящика частиц, чтобы сделать его эквивалентным SNR изображения. одночастичные изображения. Учитывая вышеупомянутые параметры, отношения сигнал / шум смоделированных микрофотографий при 0,1, 0,05, 0,02, 0,01, 0,005, 0,002, 0,001 и 0,0005 соответствуют отношениям сигнал / шум одиночной частицы равным 0.16, 0,08, 0,032, 0,016, 0,008, 0,0032, 0,0016 и 0,0008 соответственно. В остальной части этой статьи, если явно не указано иное, «SNR» относится к смоделированным микрофотографиям, а не к SNR для отдельных частиц.

Рис. 4

Графики ранжирования корреляционных пиков и дифференциация истинно-положительных и ложноположительных частиц в автоматизированном отборе частиц на основе FLC. Графики ранжирования пиков корреляции, соответствующие разным SNR, полученные с использованием трех разных шаблонов отбора частиц: ( a ) круг Гаусса, ( b ) одна проекция тримеров HA вируса гриппа и ( c ) одна проекция тримера ВИЧ-1 Env.Шаблоны сбора частиц показаны на вставках. Все графики взяты из микрофотографий зашумленных частиц, полученных из одной смоделированной бесшумной микрофотографии тримера HA вируса гриппа. Обратите внимание, что положение спада в значениях пика корреляции соответствует 323, что является числом реальных тримеров HA вируса гриппа на смоделированных микрофотографиях. ( d ) Частота ложных положительных результатов при захвате частиц. Показаны графики зависимости ложноположительной фракции от SNR при отборе частиц с использованием трех различных шаблонов, что указывает на то, что специфичность отбора частиц FLC сильно зависит от SNR, а также в меньшей степени зависит от выбора 2D-шаблона.Ниже критического диапазона SNR (0,002–0,005) процент ложных срабатываний значительно возрастает.

Рис. 5

Влияние шаблона для сбора частиц, используемого в FLC, и SNR микрофотографий на оптимизацию MLE. Шумные микрофотографии, показывающие тримеры HA вируса гриппа с различными SNR, были подвергнуты BOF-тестированию с использованием различных шаблонов для отбора частиц. Соответствующие SNR микрофотографий, из которых были взяты наборы частиц, составляли 0,005 ( a , b и c ), 0.002 ( d , e и f ), 0,001 ( g , h и i ) и 0,0005 ( j , k и l ). Для отбора частиц использовались следующие шаблоны: круг Гаусса ( a , d , g и j ), один вид в проекции тримера HA вируса гриппа ( b , e , h ). и k ) и один вид в проекции тримера Env ВИЧ-1 ( c , f , i и l ).Частицы, отобранные FLC, были случайным образом разделены на пять классов и усреднены. Полученные «средние по классам» показаны в крайнем левом столбце каждой панели ( a - l ). Каждая сборка наборов данных была подвергнута классификации MLE с несколькими ссылками с использованием случайных средних значений классов в качестве исходных ссылок. На каждой панели пять рядов серий изображений соответствуют пяти классам ориентации частиц, сгенерированным MLE, при этом начальная ссылка (S. Ref) и средние по классам итераций этапов (1-я, 10-я, 50-я и 100-я) показаны в строке. .Результаты тестирования BOF показывают, что оптимизация MLE может восстановить слабый сигнал тримера HA вируса гриппа, если изображения имеют достаточно высокий SNR.

Рис. 6

Эффекты использования круга Гаусса в качестве отправной точки для оптимизации MLE. Процедуры, показанные на рис. 5, были повторены с гауссовым кругом в качестве начального ориентира для всех наборов данных в классификации MLE с множеством ссылок. Соответствующие отношения сигнал / шум микрофотографий, из которых были выбраны наборы частиц, были равны 0.005 ( a , b и c ), 0,002 ( d , e и f ), 0,001 ( g , h и i ) и 0,0005 ( j ) , k и l ). Для отбора частиц использовались следующие шаблоны: круг Гаусса ( a , d , g и j ), один проекционный вид тримеров HA вируса гриппа ( b , e , h ). и k ), и один вид в проекции тримера Env ВИЧ-1 ( c , f , i и l ).На каждой панели пять рядов серий изображений соответствуют пяти классам ориентации частиц, сгенерированным MLE, со средними значениями классов итераций этапов (1-я, 10-я, 50-я, 100-я, 500-я), показанными в строке. При SNR 0,002 и выше шаблон для сбора частиц не воспроизводится оптимизацией MLE, когда в качестве исходного ориентира используется гауссов круг.

BOF-тесты на экспериментальных данных крио-ЭМ

Мы собрали экспериментальный набор данных крио-ЭМ. комплекса глюкозоизомеразы 173 кДа (Hampton Research, Калифорния, США).Каплю 2,5 мкл раствора глюкозоизомеразы с концентрацией 3 мг / мл наносили на С-плоскую решетку с тлеющим разрядом (R 1,2 / 1,3, 400 меш, Protochips, Калифорния, США) и мгновенно замораживали в жидком этане с помощью FEI Vitrobot Mark IV (Thermo Fisher Scientific, США). Криосетку получали на микроскопе FEI Tecnai Arctica (Thermo Fisher Scientific, США) при номинальном увеличении 21000 × и ускоряющем напряжении 200 кэВ. Мы отобрали 95 фокальных пар микрофотографий, полученных с помощью прямой детекторной камеры Gatan K2 Summit (Gatan Inc., Калифорния, США) с разницей расфокусировки 1,5 мкм и размером пикселя 1,74 Å. Фактические значения дефокусировки микрофотографий были определены с помощью CTFFind3 [51]. Первая экспозиция была сделана при расфокусировке от –1,0 до –3,0 мкм. В этом диапазоне расфокусировки видимость комплексов была предельной, что затрудняло идентификацию частиц вручную. Вторая экспозиция была сделана при расфокусировке от -3,0 до -5,0 мкм. В этом диапазоне расфокусировки частицы были более заметными. Затем мы использовали FLC для отбора частиц непосредственно из микрофотографий первой экспозиции и использовали вторую экспозицию, чтобы вручную проверить выбор частиц из первой экспозиции.Использование первой экспозиции при более низкой дефокусировке, что дает более низкие отношения сигнал / шум одиночных частиц, обеспечивает более строгий тест на надежность подхода BOF, чем использование второй экспозиции при более высокой дефокусировке.

Для проведения кислородно-конвертерных испытаний этих крио-ЭМ данных мы собрали три стопки частиц (включающие 22 298, 20 632 и 22 828 частиц соответственно), используя три различных шаблона для отбора частиц, то есть гауссов круг, одно проекционное изображение глюкозоизомеразы кристаллическая структура (PDB ID: 10AD) отфильтрована до 30 Å, и одна проекция тримера Env ВИЧ-1 отфильтрована до 30 Å.Изображения частиц размером 90 × 90 пикселей, отобранные FLC, были перевернуты по фазе, чтобы частично исправить эффект CTF. Три стопки частиц были нормализованы по фоновому шуму и подверглись классификации MLE с множеством эталонов на 5 классов с использованием двух различных исходных эталонов: (1) среднее значение случайно выбранного подмножества частиц; и (2) гауссовский круг, который следует гауссовскому распределению по радиальной интенсивности.

Coot-Cryo-EM-v9.md

Ана Касаньял и Пол Эмсли

Цель: подобрать домен фактора расщепления и полиаденилирования

1: Настройка

1.1 Получите файлы

С помощью веб-браузера загрузите комплект для EMD-3908

Переместите этот tar-файл сюда и извлеките его.

Скачиваем последовательность фрагмента конструкции:

Переместите этот файл последовательности в текущий каталог (для облегчения доступа).

Start Coot :

$ coot --map EMD-3908 / map / emd_3908.map

1.2 Манипуляции с картой

Давайте посмотрим подробнее на карте

  • Изменить Параметры карты Радиус карты 70
  • ОК

Давайте использовать более гладкие карты

  • Вычислить Модули Cryo-EM
  • Cryo-EM Многозубая…
  • Используйте 10 уровней до 200
  • ОК
  • {wait}
  • При чтении нового файла mtz:
    - В амплитудах: выберите FoutBlur_20.0
    - ОК
  • Перечитайте файл mtz, но на этот раз:
    - В Amplitude: выберите FoutBlur_200.0
    - Использовать Expert Mode? , чтобы сократить предел высокого разрешения до 4,0 Å

Сравните эти карты и затем удалите 1-ю карту (mrc).

Выбираем карту FoutBlur_200.0 для примерки (на данный момент):

  • Карта → {Выберите FoutBlur_200.0} → OK

Изменить шаг контура для новых карт:

Диспетчер отображения Свойства Изменение по среднеквадратическому значению 0.33 ОК

Как показывает опыт, хороший уровень контура составляет 5,5 среднеквадратичного значения, но для размытой карты мы должны использовать около 0,03 В (9,4 среднеквадратичного значения).

1.3 Получить гомолог:

  • Файл Получить модель с использованием кода доступа… 6f9n

Вернуться к середине карты с помощью Undo Navigation:

Если вы не перемещали вид, вы должны оказаться в центре карты: (112, 112, 112). Если центр переехал, вам может потребоваться небольшая помощь вручную:

  • Панорамируйте вид так, чтобы середина карты находилась посередине экрана
  • Теперь переместите гомолог в центр карты:
  • Вычислить Переместить сюда молекулу
  • Установите флажок «: позволить большим молекулам перемещаться »
  • Выберите выделение атома / фрагмент молекулы
  • Переместите его

2: Покачивание

  • Morph Подгоните эту молекулу

Теперь он должен примерно соответствовать.Если этого не произошло, попробуйте еще раз покачать один, два или, возможно, несколько раз (либо это, либо вы не выполнили инструкции 😄).

В этом случае вам следует искать оценку соответствия более 1000.

Извлечь наиболее подходящий (WD40) домен:

  • Используя Jones ’Rainbow , найдите номера начального и конечного остатков домена
  • Представим, что вы думаете, что это 517 и 1011:
  • Редактировать Копировать фрагмент → [Использовать выделение атома:] // A / 517-1011 OK

Давайте поработаем над фрагментом:

  • Диспетчер отображения Только последние

Удалим боковые цепи из молекулы выбора атома (обычно номер 4):

  • Вычислить Моделирование Удалить боковые цепи для активной цепи

Для последней модели используйте

  • C-альфа / Магистраль + лиганды
  • OK [Закрыть Диспетчер отображения]

4: Настройка уточнения

Нам нужно настроить вес карты для модели:

Давайте добавим несколько локальных ограничений расстояния:

  • Вычислить Модули ProSMART
  • Обычно 5.0 - хорошо
  • ProSMART Создание самоограничений всех молекул 5.0
  • Просмотрите их, затем отмените отображение:
  • ProSMART Отменить отображение ограничений дополнительного расстояния
  • Уточнить Установить альфа Гемана-МакКлюра 0,01

5: Уточнение

  • Уточнение Уточнение цепи
  • {подожди и смотри, можешь перевернуть взгляд, если хочешь}

Когда в диалоговом окне уточнения появится сообщение «Успешно», изучите модель, стараясь случайно не потянуть за атом.Может быть, вы увидите, что есть домен, который не подходит, если да, дерните наихудший CA и перетащите его туда, где, по вашему мнению, он должен быть.

  • Двойной щелчок по атому снимает ограничитель тяги

Когда вы будете довольны, закройте диалоговое окно «Уточнение»:

5.1 Повторить

Может быть нетривиальной задачей решить, что нужно переместить и как это переместить. Стоит отменить ваши модификации и снова доработать для практики.

На этот раз, возможно, без снятия ограничений:

  • Отменить
  • set_draw_moving_atom_restraints (0)
  • Уточнить Уточнить цепи
  • дергать по необходимости
  • ОК

… или с другой отсечкой для ограничений Geman-McClure, или с другим альфа для ограничений Geman-McClure, или с другим весом для карты.Или другое размытие для карты. Вы можете удалить текущие дополнительные ограничения с помощью ProSMART Удалить все дополнительные ограничения .

  • Тестируйте, играйте, дорабатывайте, дергайте, пока не получите удовлетворение.

Сбросить альфа Гемана-МакКлюра на 1.

6: Проверка и корректировка

При просмотре вы заметите, что некоторые части модели
не подходят для карты. Попробуйте дергать их с помощью Tandem Refine. Другие части модели
не имеют плотности - поэтому удалите диапазон остатков - это поможет выравниванию, которое мы собираемся сделать.

Может быть, будет полезен диалог проверки соответствия плотности? Вам понадобится
для сброса веса:

  • Редактировать Настройки Установить плотность по графику Вес 0,3 OK
  • Подтвердить Анализ подгонки плотности

7: Мутант

  • Вычислить Сценарии Python
  • print_sequence (4) Примечание: номер молекулы, полученный в результате «Копировать фрагмент»
  • Откройте веб-браузер, чтобы:
  • Вставьте последовательность из CPF-X-домена.seq
  • Вставьте вывод последовательности из print_sequence () выше
  • Примечание: важен их порядок
  • Измените вывод на «Pearson / FASTA»
  • Отправить
  • Сохраните выравнивание в a1-align.fasta (скажем)
  • В окне сценариев Python:
  • associate_pir_alignment_from_file (4, «A», «a1-align.fasta») Примечание: используйте номер молекулы, полученный в результате «Копировать фрагмент»
  • Вы можете сказать, что это сработало, потому что в терминале есть информация о выравнивании.
  • apply_pir_alignment (4, "A")
  • simple_fill_partial_residues (4)
  • {wait}
  • Уточнить Уточнить цепи
  • ОК

(Примечание: этот интерфейс изменится в ближайшем будущем)

8: Проверить и изменить

Перебрать остатки конструкции за остатками в поисках вещей, которые нужно исправить

  • Отсутствующие боковые цепи
  • Отсутствующие петли
  • Петли со слишком большим количеством остатков в модели
  • Плохие ротамеры
  • Плохие пептиды
  • Столкновения
  • Использование: Проверить выравнивание vs.PIR… , чтобы помочь вам скорректировать остаточные числа

Будут места, где нужно замкнуть (или разомкнуть) цикл, перенумеровав остатки.

9: Теперь вернемся к демонстрационной коробке

  • Вычислить Выполнить скрипт demo-box-of-buttons-madrid.scm
  • Открыть карту EM (Baton Building)
  • Используйте Multi-Sharpen (как указано выше, Раздел 1.2), чтобы сделать карту размытой на 10 A² на основе карты, которая только что была прочитана.
  • Выберите эту карту для здания
  • Встроить дубинкой Здание:
  • Calculate Другие инструменты моделирования C-alpha Baton Mode…
  • Скелетировать размытую карту
  • Отрегулируйте уровень скелетонизации:
  • Редактировать Параметры скелета … → Уровень скелета : → 0.08
  • Добавьте позиции CA на кончике стрелки - Счастливого строительства!
    • По правде говоря, это требует определенных навыков, но полезно для построения моделей de novo , когда ничто другое не помогает
  • Когда вы построили (скажем) 40 центров сертификации:
  • Зона CA → Основная цепь
  • Какое направление правильное? Как вы можете сказать?

11: Готово

Помимо выравнивания в Разделе 8, вы можете, немного попрактиковавшись, с комфортом выполнить оба этих урока менее чем за полчаса.У вас может быть некоторый опыт работы с Coot , а теперь вы уже дошли до него, поэтому попробуйте уточнить (с помощью вашей любимой программы уточнения макромолекул) домен, который вы только что смоделировали. Используйте проверку и исправьте некоторые проблемы. Вы можете использовать валидационный анализ Coot :

  • Вычислить → Сценарии → Схема
  • Используйте что-то вроде:
  • (диалог проверки-выбросов 4 1)
  • Где 4 - номер молекулы модели, а 1 - номер молекулы карты
  • {wait}
  • Нажмите на злодеев
  • Обратите внимание, что анализ скручивания и корреляционный анализ плотности полезны только на самых лучших крио-ЭМ картах.
Опубликовано в категории: Разное

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *