Дт 70 кт 68 проводка: Дебет 70 / Кредит 68

Похожие страницы

Результаты пробных расчетов для LCA и Scope 3

MIL-DTL-26482 Тип реверсивной байонетной муфты с

КУПЕР AGW-21/2

Разъемы для высокоскоростной передачи данных «DataLink»

HRS DF19G-14S-1C

HRS NX1BL-32T-KT9B

NEC UPD750004GB

HRS 3560A-16P-CV

HRS DX30AM-14P

VECTRON TFS326A

NEC UPD750108CU-XXX

HRS GT11N-2PP-HU

HRS IC1K-68RD

HRS MQ172X-3PA-CV

MIL-DTL-5015 Тип обратного байонетного соединения USB-B

MA-COM 10EHT1

HRS DF25G-20S-0.5F / SD-GND

ВИШАЙ СТ

FAIRCHILD FM809

NEC UPD75036

NEC UPD75004CU

NEC UPD75068GB

dtsheet © 2021 г.

Страница не найдена — Keystone Technologies

Это юридическое соглашение («соглашение») между вами (или организацией, от имени которой вы лицензируете изображения («вы» или «ваш») и Keystone Technologies.Загружая изображения («изображения») с keystonetech.com или любой другой из наших платформ, обслуживающих наши изображения («Сервис»), вы соглашаетесь соблюдать настоящее соглашение, а также нашу Политику конфиденциальности и Условия обслуживания. Если вы не согласны, не загружайте и не используйте эти изображения.

Нам может потребоваться время от времени изменять это соглашение, и вы соглашаетесь соблюдать обязательства в отношении будущих версий.

Пожалуйста, не разглашайте свой пароль. Они предназначены только для вашего использования.

1.Право собственности: Все изображения защищены законом об авторском праве США и международными соглашениями об авторских правах. Мы оставляем за собой все права, не предоставленные в этом соглашении.

2. Лицензия: В соответствии с условиями этого соглашения Keystone Technologies предоставляет вам неисключительное, непередаваемое, постоянное всемирное право на использование и воспроизведение этих изображений в любых коммерческих, художественных или редакционных целях, не запрещенных в это соглашение.

3. Ограничения:
НЕЛЬЗЯ:
1.Распространять или использовать любое изображение способом, который конкурирует с Keystone Technologies. В частности, вы не можете сублицензировать, перепродавать, назначать, передавать, передавать, делиться или предоставлять доступ к изображениям или каким-либо правам на изображения, кроме тех, которые разрешены в этом соглашении.
2. Используйте изображение для представления любых продуктов или услуг, не принадлежащих Keystone Technologies.
3. Добавьте изображение в любой логотип, товарный знак, фирменный стиль или знак обслуживания.
4. Используйте изображение любым незаконным образом или любым способом, который разумный человек может счесть оскорбительным или который может нанести ущерб репутации любого лица или собственности, отраженного на изображении.
5. Ложно представить, что вы являетесь первоначальным создателем изображения.
6. Используйте изображение в любом сервисе, претендующем на получение прав на изображение.
7. Нарушать права на товарный знак или интеллектуальную собственность какой-либо стороны или использовать изображение для вводящей в заблуждение рекламы.
8. Удалите или измените любую информацию об управлении авторскими правами Keystone Technologies (например, логотип Keystone) из любого места, где она есть или встроена в изображение.

4. Возможность передачи; Производные работы: Конечным пользователем работы, которую вы создаете с изображением, должен быть вы сами или ваш работодатель, клиент или заказчик.Только вам разрешено использовать отдельные изображения (вы не можете продавать, сдавать в аренду, одалживать и т. Д. Третьим лицам). Вы можете передавать файлы, содержащие изображения, клиентам, поставщикам или интернет-провайдерам для целей, предусмотренных настоящим соглашением. Вы соглашаетесь принять разумные меры для защиты изображений от извлечения или кражи. Вы незамедлительно уведомите нас о любом неправильном использовании изображений. Если вы передаете изображения, как указано выше, принимающие стороны должны согласиться защищать изображения в соответствии с требованиями настоящего соглашения. Даже при использовании в производной работе наши изображения по-прежнему принадлежат Keystone Technologies.

5. Обзор и записи: С разумным уведомлением вы предоставите Keystone Technologies образцы использования изображений. Вы должны вести учет всего использования изображений, включая подробную информацию об использовании клиентом. Keystone Technologies может периодически запрашивать и проверять такие записи. Если будет обнаружено, что изображения использовались вне рамок данного соглашения, вы удалите изображения в соответствии с предпочтениями Keystone Technologies.

6. Заявления и гарантии: Мы заявляем и гарантируем, что изображения, предоставленные для загрузки, неизмененные и используемые в полном соответствии с настоящим соглашением, не будут нарушать авторские права, права на товарные знаки или другие права интеллектуальной собственности, а также права третьих лиц на неприкосновенность частной жизни. или гласность.

ПРЕДОСТАВЛЯЮТСЯ «КАК ЕСТЬ», БЕЗ КАКИХ-ЛИБО ГАРАНТИЙ, ЯВНЫХ ИЛИ ПОДРАЗУМЕВАЕМЫХ, ВКЛЮЧАЯ, НО НЕ ОГРАНИЧИВАЯСЬ ​​ПОДРАЗУМЕВАЕМЫМИ ГАРАНТИЯМИ ОТСУТСТВИЯ НАРУШЕНИЙ, КОММЕРЧЕСКОЙ ЦЕННОСТИ ИЛИ ПРИГОДНОСТИ ДЛЯ КОНКРЕТНОЙ ЦЕЛИ.

7. Ваше возмещение убытков: Вы соглашаетесь возмещать, защищать и удерживать Keystone Technologies, ее аффилированных лиц, участников, аффилированных лиц, лицензиаров и их соответствующих директоров, должностных лиц, сотрудников, акционеров, партнеров и агентов (совместно именуемые «Keystone Technologies» Стороны ») безвредны по любым претензиям, ответственности, убыткам, убыткам, затратам и расходам (включая разумные судебные издержки на адвокатской и клиентской основе), понесенных любой Стороной Keystone Technologies в результате или в связи с (i) любое нарушение или предполагаемое нарушение вами или кем-либо, действующим от вашего имени, любого из условий настоящего соглашения, включая, помимо прочего, любое использование нашего веб-сайта или любого изображения, кроме случаев, прямо разрешенных в этом соглашении; (ii) любое сочетание изображения с любым другим контентом или текстом, а также любые модификации или производные работы на основе изображения.

8. Ограничение ответственности: Keystone Technologies не несет ответственности по настоящему соглашению в той мере, в какой это связано с изменением изображений, использованием в любых производных работах, контекстом, в котором используется изображение, или вашим (или третьим сторона действует от вашего имени), нарушение данного соглашения, халатность или умышленное нарушение.

В САМОЙ ПОЛНОЙ СТЕПЕНИ, РАЗРЕШЕННОЙ ЗАКОНОДАТЕЛЬСТВОМ, НИ KEYSTONE TECHNOLOGIES, НИ КАКИЕ-ЛИБО ИЗ ЕЕ СОТРУДНИКОВ ИЛИ ПОСТАВЩИКОВ НЕ НЕСЕТ ОТВЕТСТВЕННОСТИ ЗА ЛЮБЫЕ ОБЩИЕ, КАЧЕСТВЕННЫЕ, СПЕЦИАЛЬНЫЕ, ИЛИ КОСВЕННЫЕ ИЛИ КОСВЕННЫЕ УСЛУГИ ЛЮБЫЕ ДРУГИЕ УБЫТКИ, ЗАТРАТЫ ИЛИ УБЫТКИ, ВЫЗВАННЫЕ ВАМИ ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИЗОБРАЖЕНИЙ, ВЕБ-САЙТА, ​​НАРУШЕНИЯ ДАННОГО СОГЛАШЕНИЯ КОМПАНИИ KEYSTONE TECHNOLOGIES ИЛИ ИНАЧЕ, ЕСЛИ ЯВНО НЕ ПРЕДУСМОТРЕНО, ДАЖЕ ЕСЛИ KEYSTONE TECHNOLOGIES ПРЕДНАЗНАЧЕНА УБЫТКИ, ИЗДЕРЖКИ ИЛИ УБЫТКИ.

9. Прекращение действия: Настоящее соглашение действует до тех пор, пока у вас есть учетная запись, если оно не будет прекращено, как указано ниже. Вы можете прекратить действие любой лицензии, предоставленной в соответствии с настоящим соглашением, уничтожив изображения и любые производные от них работы, а также любые копии или архивы вышеупомянутых или сопроводительных материалов (если применимо) и прекратив использовать изображения для любых целей. Лицензии, предоставленные по настоящему соглашению, также прекращают действие без уведомления Keystone Technologies, если вы в какой-то момент не соблюдаете какое-либо из условий этого соглашения.Keystone Technologies может расторгнуть настоящее соглашение, а также вашу учетную запись и все ваши лицензии с уведомлением вас или без него, если вы не соблюдаете условия этого соглашения. После прекращения действия вашей лицензии вы должны немедленно прекратить использование изображений для любых целей; уничтожать или удалять все производные работы с изображениями, а также копии и архивы изображений или сопутствующих материалов; и, если потребуется, подтвердите Keystone Technologies в письменной форме, что вы выполнили эти требования.ПРЕДУСМОТРЕННОЕ ПРЕКРАЩЕНИЕ ДОПОЛНИТЕЛЬНО ДОПОЛНИТЕЛЬНО ДРУГИЕ ЗАКОННЫЕ И / ИЛИ КАПИТАЛЬНЫЕ ПРАВА Keystone Technologies. Keystone Technologies НЕ НЕСЕТ НИКАКИХ ОБЯЗАТЕЛЬСТВ ПО ВОЗВРАТУ КАКИХ-ЛИБО ПЛАТЕЖНЫХ КОМИССИЙ В СЛУЧАЕ ПРЕКРАЩЕНИЯ ДЕЙСТВИЯ ВАШЕЙ ЛИЦЕНЗИИ ИЛИ УЧЕТНОЙ ЗАПИСИ ПО ПРИЧИНЕ ВАШЕГО нарушения

10. Сохранение прав после прекращения действия: Следующие положения и условия остаются в силе после прекращения или истечения срока действия настоящего соглашения: условия, применимые к лицензиям на изображения, предоставленным по настоящему соглашению, остаются в силе в отношении оставшихся в силе лицензий при условии, что настоящее соглашение не будет прекращено как результат вашего нарушения, и что вы всегда будете соблюдать его условия.

11. Удаление изображений с keystonetech.com: Keystone Technologies оставляет за собой право удалить изображения с keystonetech.com, отозвать любую лицензию на любые изображения по уважительной причине и принять решение о замене такого изображения альтернативным изображением. После уведомления об отзыве лицензии на любое изображение вы должны немедленно прекратить использование таких изображений, принять все разумные меры для прекращения использования замененных изображений и проинформировать об этом всех конечных пользователей и клиентов.

12. Разное: Настоящее соглашение представляет собой полное соглашение сторон в отношении предмета настоящего Соглашения. Стороны соглашаются, что любое существенное нарушение Раздела 3 («Ограничения») нанесет непоправимый ущерб Keystone Technologies, и что судебный запрет в суде компетентной юрисдикции будет уместен для предотвращения первоначального или продолжающегося нарушения такого Раздела в дополнение к любому Компания Keystone Technologies может иметь право на другие льготы. Если нам не удается обеспечить соблюдение каких-либо частей этого соглашения, это не означает, что от таких частей отказываются.Это соглашение не может быть передано вами без нашего письменного разрешения, и любая такая предполагаемая передача без разрешения является недействительной. Если какая-либо часть этого соглашения будет признана незаконной или не имеющей исковой силы, эта часть должна быть изменена, чтобы отразить наиболее полное юридически исполнимое намерение сторон (или, если это невозможно, удалена), не влияя на действительность или исковую силу остальной части. Любые судебные иски или разбирательства, касающиеся наших отношений с вами или настоящего соглашения, должны быть поданы в суды штата Пенсильвания в графстве Монтгомери или Соединенных Штатов Америки в Восточном округе Пенсильвании, и все стороны соглашаются с исключительная юрисдикция этих судов, отказавшись от каких-либо возражений против уместности или удобства таких мест.Конвенция Организации Объединенных Наций о договорах международной купли-продажи товаров не применяется к настоящему соглашению и не влияет на него иным образом. Действительность, толкование и приведение в исполнение настоящего соглашения, вопросы, возникающие из настоящего соглашения или связанные с ним или их заключением, исполнением или нарушением, а также связанные с этим вопросы, регулируются внутренним законодательством штата Пенсильвания (без ссылки на доктрину выбора права. ). Вы соглашаетесь с тем, что обслуживание процесса в отношении любых действий, разногласий и споров, возникающих из настоящего соглашения или связанных с ним, может осуществляться путем отправки его копии заказным или заказным письмом (или любой другой по существу аналогичной формой почты) с предоплатой почтовых расходов другой стороне. тем не менее, ничто в данном документе не влияет на право осуществлять судебное разбирательство любым другим способом, разрешенным законом.

Прежде чем продолжить, вам необходимо прочитать эти положения и условия до конца.

Связывание клонов нейронов и специфичность разводки

Abstract

Функционирование мозга требует точной сборки нейронных цепей во время развития. Установление функциональной цепи включает множество скоординированных шагов, начиная от спецификации судьбы нервных клеток и заканчивая правильным соответствием между пре- и постсинаптическими партнерами. Как нейрональное происхождение и время рождения влияют на специфичность проводки, остается открытым вопросом.Недавние открытия предполагают, что отношения между происхождением, временем рождения и специфичностью разводки различаются в разных нейронных цепях. В этом обзоре мы суммируем наше текущее понимание клеточных, молекулярных и онтогенетических механизмов, связывающих нейрональные клоны и время рождения со специфичностью проводников в нескольких конкретных системах у Drosophila и мышей, а также рассматриваем различные методы, используемые для изучения этих механизмов.

Введение

Множественные процессы развития, включая клеточную спецификацию, нацеливание на аксоны и дендриты, а также сопоставление синаптических партнеров, должны быть тесно скоординированы, чтобы гарантировать точную сборку нервных цепей.Соответственно, многие исследования были сфокусированы на изучении механизмов развития, лежащих в основе специфичности проводников, раскрывая за последние несколько десятилетий многочисленные молекулярные и клеточные механизмы, которые регулируют спецификацию судьбы нервных клеток, ведение аксонов и морфогенез дендритов [1-3]. Сопоставление синаптических партнеров, заключительный этап сборки цепей, остается относительно плохо изученным, а лежащие в основе молекулы и механизмы только раскрываются [4-7].

В этом обзоре мы обсуждаем, как нейрональные клоны и время рождения связаны со специфичностью проводников на клеточном и молекулярном уровнях.Предшественники претерпевают серию событий клеточной пролиферации и дифференцировки в процессе генерации постмитотических нейронов. Клеточная линия обозначает эту серию событий для отдельной клетки или типа клеток. Здесь мы используем термин lineage для обозначения последних нескольких раундов клеточных делений, которые генерируют постмитотические нейроны из проксимального предшественника. Многие молекулярные факторы и клеточные механизмы взаимодействуют друг с другом, чтобы гарантировать, что каждый шаг, от пролиферации предшественников до соединения незрелых нейронов, строго контролируется.В некоторых нейронных системах разные нейрональные подтипы последовательно генерируются из одного предка или пула общих предшественников, и порядок рождения или время рождения могут предсказать судьбы их клеток и схемы разводки; мы классифицируем такие связанные с клонами процессы, которые определяют судьбу и проводку нейрональных клеток, как внутренних механизмов . Было продемонстрировано, что в других нейронных системах судьба клеток и последующие паттерны разводки не зависят от клонов. Поскольку было показано, что такие процессы, как латеральное торможение, внеклеточная индукция и стохастическая регуляция, играют важную роль в подключении этих цепей, мы классифицируем их как внешние механизмы и стохастические механизмы .В этом обзоре мы обсуждаем, как внутренние, внешние и стохастические механизмы вносят вклад в специфичность проводников в клонах как у Drosophila , так и у нервных систем мыши, используя данные шести относительно хорошо изученных систем и разделяя эти данные на внутренние и внешние / стохастические разделы. на основе нашего текущего понимания. Мы отмечаем, что различные комбинации внутренних, внешних и стохастических механизмов могут использоваться в большинстве или во всех развивающихся нейронных системах; наша категоризация конкретной системы как использующей внутренние или внешние / стохастические механизмы ниже отражает либо предвзятое использование одного механизма по сравнению с другим, либо то, что наше понимание одного механизма более полное, чем наше понимание другого в этой системе.

Внутренняя регуляция нейронных проводников, зависящих от времени рождения

Некоторые нейронные цепи, по-видимому, в значительной степени полагаются на внутренние механизмы в установлении специфичности проводников. Здесь мы рассмотрим, как внутренние факторы, связанные со временем рождения, направляют развитие специфичности проводки в нескольких модельных системах, включая Drosophila, нейроны обонятельной проекции (PN), нейроны грибовидных тел (MB) и возбуждающие нейроны коры головного мозга мышей. При обзоре результатов каждой системы мы сначала описываем установленные отношения между клеточным происхождением или временем рождения и специфичностью проводников, а затем суммируем потенциальные механизмы на молекулярном и клеточном уровнях, лежащие в основе такой регуляции.

Дрозофилы обонятельные проекционные нейроны

В обонятельной системе Drosophila 50 классов обонятельных рецепторных нейронов (ORN) образуют взаимно однозначные связи с 50 классами проекционных нейронов второго порядка (PN) в антеннальной доле в 50 дискретные клубочки [8–10]. Каждый класс PN ограничивает свои дендриты одним клубочком и имеет стереотипный паттерн ветвления аксонов в боковом роге, высшем мозговом центре, который обрабатывает обонятельную информацию [11-15]. Drosophila PN представляют собой отличную систему для исследования взаимосвязи между клеточным происхождением и специфичностью разводки. Исследования этой системы продемонстрировали, что нацеливание дендритов на разные классы PN может быть полностью предсказано на основании порядка их рождения или времени в пределах клонов PN [12, 16, 17].

Используя мозаичный анализ с маркером репрессируемых клеток (MARCM; см. Вставку), Jefferis et al. обнаружили, что PN происходят от трех отдельных клонов нейробластов, названных антеродорсальными, латеральными и вентральными клонами в соответствии с положением их клеточных тел относительно антеннальной доли [12].Антеродорсальные и латеральные PN (adPNs и lPN) представляют собой возбуждающие нейроны, которые посылают свои дендриты в отдельные отдельные клубочки, тогда как вентральные PN (vPN) представляют собой тормозные ГАМКергические нейроны, которые посылают свои дендриты в один или несколько клубочков [13, 18]. Внутри каждой линии один нейробласт многократно подвергается асимметричному делению, давая начало новому нейробласту и материнской клетке ганглия, которая снова делится, чтобы генерировать два нейрона (Рис.). В линиях adPN и vPN только один из двух постмитотических нейронов выживает и развивается в PN, тогда как в линии lPN выживают оба постмитотических нейрона, развиваясь в один PN и один локальный интернейрон [17, 19].

Внутренняя регуляция нервной системы, зависящей от времени рождения. a и b В Drosophila различные типы нейронов обонятельной проекции (PNs; a ) и клетки Кеньона грибовидного тельца (MB) (KCs; b ) последовательно рождаются из общего нейробласта (NB) стереотипно. В клане антеродорсальной PN (adPN) один из постмитотических нейронов подвергается апоптозу, так что только одна PN генерируется из одной материнской клетки ганглия (GMC; обозначена как G).Различные классы PN посылают свои дендриты в определенные области (клубочки) в антеннальной доле. В линии KC оба постмитотических нейрона, возникшие в результате деления GMC, выживают и проецируют свои аксоны на одну и ту же долю MB. D: спинной; L: боковой. c В развивающейся коре головного мозга мыши радиальная глия в желудочковой зоне (VZ) асимметрично делится, давая начало новорожденным проекционным нейронам, которые постепенно заселяют более поверхностные слои зрелой коры и промежуточных предшественников в субвентрикулярной зоне (SVZ), которые сами по себе далее делить для генерации проекций новорожденных нейронов.Кортикокортикальные проекционные нейроны в слоях II / III и разбросанные по слоям V и VI проецируются внутри коры; субцеребральные проекционные нейроны, преимущественно занимающие слой V, проецируются на подкорковые структуры, такие как верхний холмик, мост и спинной мозг; проекционные нейроны кортикоталамуса, в основном занимающие слой VI, проецируются в таламус. Лучевая глия производит астроциты в последнюю очередь после заполнения коры проекционными нейронами. Стрелки обозначают постмитотическое потомство; стрелки с пунктирными линиями представляют возможное постмитотическое потомство.СП: плита; ПП: предварительная плита; EX (например, E13.5): эмбриональный день X (дни после зачатия, например, эмбриональный день 13,5) у мыши

Поскольку MARCM позволяет контролировать во времени индукцию клонов одиночных клеток, меченных mCD8GFP [20], исследуя положение тела клетки и Целевой выбор одиночных PN, индуцированных в разное время, позволил исследователям соотнести классы PN с их происхождением и порядком рождения. Интересно, что внутри каждой линии разные классы PN рождаются последовательно в стереотипном порядке [12].Два более поздних исследования с использованием двухточечной MARCM, которая позволяет маркировать сестринские клоны от общего предка двумя разными флуоресцентными белками [21], более полно охарактеризовали порядок рождения adPN и lPN. Авторы захватили каждый отдельный нейрон из одной линии на основе порядка рождения и идентифицировали несколько дополнительных классов PN в обеих линиях, ранее не охарактеризованных [16, 17]. Между тем, двухточечный MARCM позволил авторам определить количество ячеек в отдельных классах PN, обнаружив, что каждый класс содержит стереотипное количество ячеек в диапазоне от одной до семи.В соответствии с предыдущими открытиями, оба исследования показали, что клонирование и порядок рождения предсказывают судьбу PN-клеток и нацеливание на дендриты.

Стереотипный порядок рождения различных классов PN предполагает, что должны существовать связанные с клонами внутренние факторы, контролирующие клеточные судьбы PN и их нацеливание на дендриты. Что это за внутренние факторы? Широко распространено мнение, что факторы транскрипции и молекулы с клеточной поверхности / секретируемые являются ключевыми факторами, регулирующими судьбу клеток и специфичность проводников, соответственно.Соответственно, было показано, что различные факторы транскрипции и клеточная поверхность / секретируемые молекулы играют решающую роль в регулировании нацеливания на аксоны / дендриты PN [5]. Недавние открытия подтверждают, что факторы транскрипции действуют в пределах каждого клона, чтобы специфицировать разные классы PN, а молекулы на клеточной поверхности / секретируемые молекулы действуют ниже транскрипционных факторов, чтобы непосредственно выполнять молекулярные процессы, лежащие в основе специфичности проводников [22].

Напр., Abnormal Chemosensory jump 6 (Acj6) и отсутствие вентральных вен (Vvl, также называемое Drifter), два фактора транскрипции домена POU, как было показано, являются факторами, специфичными для клонов для adPNs и lPNs, соответственно [23].Acj6 и Vvl не только демонстрируют специфичные для клонов паттерны экспрессии, но также необходимы для нацеливания на дендриты adPN и lPN, соответственно. Потеря Acj6 в adPN или потеря Vvl в lPN вызывает значительные дефекты нацеливания на дендриты. Неправильная экспрессия Acj6 в lPN или Vv1 в adPN ведет к аберрантному нацеливанию дендритов PN на клубочки, обычно занятые другим клоном PN. Acj6 также контролирует ветвление терминалов аксонов adPN в латеральном роге, указывая тем самым, что один фактор транскрипции может влиять на проводку как дендритов, так и аксонов в одном и том же типе клеток.Кроме того, Lim1, др. Фактор транскрипции домена POU, экспрессируется и необходим для нацеливания на дендриты vPNs, но не для двух др. Клонов [24]. Так как каждая линия генерирует несколько классов PN, индивидуальных факторов происхождения недостаточно для определения разных классов PN и соответствующего нацеливания на аксоны / дендриты. В самом деле, были идентифицированы дополнительные клон-специфические факторы транскрипции, экспрессируемые в субнаборе клеток внутри клона, такие как Islet и C15 [22, 24].

Различные уровни экспрессии одного и того же фактора транскрипции также могут помочь определить классы PN.Напр., Временной градиент Chinmo, фактора транскрипции BTB-Zinc finger, управляет назначением нейрональной идентичности как в клонах PN, так и в клонах грибовидных тел (см. Ниже) [25]. Потеря Чинмо приводит к трансформации судьбы ранних нейронов в судьбы поздних нейронов, а неправильная экспрессия Чинмо вызывает противоположные эффекты. Интересно, что недавнее исследование показывает, что в дополнение к клоноспецифическим факторам транскрипции, два РНК-связывающих белка, мРНК-связывающий белок IGF-II (Imp) и Syncrip (Syp), также могут действовать как внутренние факторы, определяющие идентичность PN [26 ].Imp и Syp демонстрируют противоположные временные градиенты по мере развития клонов как PN, так и грибовидных тел (см. Ниже), и они способствуют ранней и поздней судьбе нейронов, соответственно. Имп и Сип, по-видимому, управляют судьбами височных нейронов, по крайней мере частично, через Чинмо. Другое недавнее исследование показывает, что фактор транскрипции Seven-up (Svp) является критическим для установления временных градиентов Imp / Syp [27]. Итак, PN определенных классов, которые нацелены своими дендритами на определенные клубочки, рождаются в инвариантном порядке, и этот процесс, по-видимому, контролируется комбинацией факторов транскрипции и РНК-связывающих белков.

грибовидное тело дрозофилы Клетки Кеньона

Как и дрозофила нейроны обонятельной проекции (ПН), различные типы собственных нейронов грибовидного тела (МБ) дрозофилы , также известные как клетки Кеньона (КК), также рождаются последовательно и в инвариантный порядок (Fig.), подтверждая, что внутренние факторы, связанные с клонами, также влияют на прогрессию клонов MB. Drosophila MB — это центр высшего порядка для обонятельного обучения и памяти, а также других функций мозга, таких как сон и ухаживание [28–32].МБ состоит из четырех основных частей: сомы, чашечки, цветоноса и долей. Сомы KC группируются в задних дорсальных отделах головного мозга и направляют отростки кпереди, образуя дендритные ветви, которые составляют чашечку, а затем сходятся, образуя ножку. Пучок аксонов разветвляется на переднем конце ножки с образованием дорсальной (α и α ’) и медиальной (β, β’ и γ) долей (рис.). KC классифицируются как нейроны γ, α ’/ β’ или α / β в зависимости от долей, в которых заканчиваются их аксоны. Все KC происходят из четырех нейробластов в каждом полушарии, и каждый нейробласт генерирует неразличимый набор KC.Клональный анализ с использованием MARCM показал, что эти три типа нейронов последовательно рождаются из этих общих нейробластов в стереотипном порядке [33].

γ-нейронов рождаются первыми, до стадии средней личинки; затем, на поздних личиночных стадиях, рождаются α ’/ β’ нейроны; наконец, на стадии куколки рождаются α / β нейроны [33]. В головном мозге личинки и γ-, и α ’/ β’ нейроны посылают аксоны как в дорсальную, так и в медиальную доли. В то время как α ’/ β’ сохраняют свои раздвоенные ветви аксонов во время метаморфоза, раздвоенные аксоны γ-нейронов дегенерируют на ранней стадии куколки, а фрагменты аксонов фагоцитируются глиальными клетками.γ-нейроны затем расширяют аксоны только медиально, чтобы сформировать взрослую γ-долю [33–36]. Дендриты KC интегрируют входные данные от проекционных нейронов, кодирующие обонятельные, тепловые, вкусовые и зрительные стимулы [32, 37, 38], тогда как выходные нейроны MB вырабатывают сегрегированные дендриты, которые формируют 15 отдельных компартментов в долях MB [32, 39]. Итак, три класса KCs формируют связи с вышестоящими и нижележащими партнерами, и текущие доказательства подтверждают, что информация о клонах полностью предсказывает клеточную судьбу и специфичность проводников.

Внутренние факторы, такие как Chinmo, Imp и Syp, которые определяют судьбы PN, также определяют судьбы нейронов в клонах MB [25, 26]. Интересно, что исследования эмбрионального вентрального нервного канатика Drosophila подтверждают, что последовательная экспрессия др. Набора транскрипционных факторов (Hunchback / Hb, Kruppel / Kr, Pdm и Castor / Cas) управляет спецификацией судьбы временных клеток [40]. Эти факторы временно экспрессируются в нейробластах; наследование постмитотическими клетками — вот что в конечном итоге определяет клеточную идентичность [40, 41].Недавние исследования также показали, что нейробласты зрительных долей используют сходную стратегию формирования временного паттерна с использованием еще одного набора молекул для контроля нервной судьбы в продолговатом мозге [42, 43]. Эти находки подтверждают, что разные нейрональные системы в развивающейся центральной нервной системе Drosophila используют аналогичные стратегии формирования временного паттерна, которые, тем не менее, используют разные наборы молекул.

Несколько вопросов относительно развития PN и KC Drosophila остаются без ответа.Какие другие внутренние факторы и механизмы контролируют спецификацию нейронов? Как несколько факторов взаимодействуют, чтобы определить разные классы нейронов? Как внутренние механизмы в конечном итоге контролируют специфичность разводки? Одно недавнее исследование, в котором применялось одноклеточное РНК-секвенирование к Drosophila PNs, пролило свет на эти вопросы, предполагая, что комбинации факторов транскрипции и молекул клеточной поверхности могут играть критическую роль в определении разных подтипов PN [22]. Однако остается неясным, как эти два набора молекул взаимодействуют друг с другом, и его следует изучить в будущих исследованиях.

Кортикальные возбуждающие нейроны млекопитающих

Внутренние механизмы также регулируют зависимые от времени рождения нейронные проводники в развивающемся мозге млекопитающих. Роль времени рождения в организации нейронных проводников млекопитающих, возможно, нигде более очевидна, чем в развивающейся коре головного мозга [44–48], которая на протяжении эмбрионального и постнатального развития формирует структуру, состоящую из шести слоев возбуждающих нейронов, которые в значительной степени проецируются на различные экстракорковые мишени (рис.). Асимметричные подразделения индивидуальной радиальной глии (RG), первичных нервных клеток-предшественников в развивающейся коре [49], генерируют новорожденные возбуждающие нейроны, которые мигрируют из зоны желудочков вдоль радиальных глиальных волокон, приводя к образованию кортикальных столбов [50].RG также генерируют промежуточные клетки-предшественники, которые также в конечном итоге дифференцируются в нейроны [51-53]. Поскольку кора головного мозга развивается наизнанку, так что ранее рожденные нейроны населяют более глубокие слои, а более поздние нейроны постепенно заполняют все более поверхностные слои, большая работа была исследована взаимосвязь между временем рождения и возможным положением клеток в различных корковых слоях. . Астроциты рождаются последними, после того как рождаются корковые нейроны. Важно отметить, что проекционные нейроны, которые занимают разные слои, проецируются на разные цели: кортикокортикальные проекционные нейроны слоев II / III, V и VI проецируются на контралатеральную кору; таламореципиентные нейроны слоя IV получают входные данные от таламуса и транслируют выходные данные другим слоям (в первую очередь слою II) проксимальной коры; субцеребральные проекционные нейроны слоя V проецируются на подкорковые мишени, такие как верхний бугорок, мосты и спинной мозг; нейроны проекции кортикоталамуса VI слоя проецируются в таламус [54, 55].Таким образом, эти базовые паттерны проекции, специфичные для слоев, иллюстрируют влияние времени рождения как на судьбу клеток, так и на нейронную проводку возбуждающих нейронов коры.

Механизмы, лежащие в основе специфичной для слоя спецификации нейронов, по-видимому, сильно зависят от внутренних свойств клеток-предшественников, и текущая работа исследует, применяются ли эти свойства единообразно ко всем RG. Две крайние модели постулируют, что а) время является единственным фактором, определяющим потенциал данной клетки RG, или б) заранее заданные, ограниченные по потенциалу подтипы RG предпочтительно генерируют нейронные подтипы с определенными паттернами проекции.Самая экономная модель предполагает, что все предки имеют равный потенциал, и, таким образом, время рождения является единственным фактором, влияющим на компетентность предков. Эта модель подтверждается исследованиями ранней трансплантации, в которых предшественники на ранних стадиях, трансплантированные в кору на поздних стадиях, могли продуцировать все нейрональные подтипы, но предшественники на поздних стадиях, трансплантированные в кору на ранних стадиях, могли производить только подтипы поверхностного слоя [56-59]. . Эти исследования показали, что компетентность данной RG становится все более ограниченной по мере развития коры, хотя более поздние исследования трансплантации показали, что как внутренние, так и внешние сигналы контролируют компетентность RG [60, 61].Исследования ретровирусного мечения, в которых ранние вирусные инъекции приводили к маркировке нейронов всех слоев, а более поздние вирусные инъекции приводили к маркировке нейронов поверхностного слоя, подтвердили эти результаты [62–65]. Наконец, различные подходы in vitro воспроизвели зависимое от времени рождения наслоение корковых процессов развития [61, 66–68]. Взятые вместе, эти исследования предполагают, что дата рождения нейронов является важной детерминантой позиционирования нейронов в коре и, следовательно, паттернов разводки, но не рассматривает возможность различий в относительной численности предварительно заданных, потенциально ограниченных клеток-предшественников.

Альтернативная модель, которая все еще включает в себя внутренние механизмы, зависящие от времени рождения, будет предполагать, что потенциально ограниченные предшественники предпочтительно генерируют разные нейрональные подтипы, так что некоторые предшественники рождают нейроны, которые преимущественно населяют нижние слои, а другие рождают нейроны, которые преимущественно заселяют более поверхностные слои. Редкая экспрессия подтип-специфичных факторов транскрипции, таких как Fezf2, который определяет взрослые подкорковые проекционные нейроны [69–71], и Cux1 / Cux2, которые определяют взрослые нейроны мозолистой проекции, предполагает, что разные подмножества предшественников могут быть, по крайней мере, частично вовлечены в создание разных подтипы нейронов [72, 73].Дальнейшие исследования этой гипотезы использовали линии трансгенных мышей Cre / CreER (см. Вставку) для отслеживания клонов Cux2 ⁺ и Fezf2 ⁺ , чтобы исследовать возможные положения нейронов, происходящих от предшественников Cux2 ⁺ и Fezf2 ⁺ . Эти исследования дали противоречивые результаты: в первом исследовании сообщалось о популяции кортикальных предшественников, которые преимущественно генерируют нейроны, населяющие более поверхностные слои [74], и в последующем исследовании другой группы с использованием аналогичных подходов, включая эксперименты с использованием некоторых из тех же мышей с разным генетическим фоном. , сообщая о противоположных результатах [75].Взятые вместе, эти результаты подчеркивают необходимость тщательного проведения и интерпретации экспериментов по картированию судеб с использованием генетических инструментов мышей [76, 77]. Дополнительное исследование с использованием клонального мечения на основе MADM предоставило доказательства того, что RG делятся стереотипным образом в соответствии с более скупой, строго зависимой от времени моделью кортикального нейрогенеза [78], но результаты таких исследований на основе MADM могут потенциально страдать от предубеждений из-за геномному позиционированию кассет MADM; некоторые локусы могут быть более восприимчивыми к рекомбинации в определенных типах клеток, чем другие.Таким образом, хотя расположение возбуждающих нейронов коры, по-видимому, в значительной степени определяется датой рождения, степень, в которой продукция различных подтипов проекционных нейронов ограничивается заранее определенными предшественниками, остается областью активных исследований.

Недавние исследования возбуждающего коркового нейрогенеза сосредоточились на функциональных последствиях клон-зависимого позиционирования клеток. Сестринские возбуждающие нейроны в онтогенетических радиальных клонах, помеченные внутриутробной внутрижелудочковой инъекцией экспрессирующих eGFP ретровирусов, например, предпочтительно связаны и имеют более сильные связи на второй и третьей постнатальных неделях, чем неродственные нейроны [79].Кроме того, щелевые соединения опосредуют временное электрическое соединение между сестринскими возбуждающими нейронами и необходимы для развития этих предпочтительных связей и последующего подобия свойств функционального ответа между сестринскими нейронами [80, 81], как предсказывают предсказательные исследования по отслеживанию красителей [82–85] . Такое функциональное сходство может быть наиболее заметно в нейронах, родившихся очень близко во времени и, следовательно, наиболее тесно связанных по происхождению [86, 87], хотя другие факторы, такие как расстояние между клонами и, следовательно, степень их общего микроокружения развития, могут также прогнозировать функциональные схемы подключения.Определить относительный вклад родословной и местных факторов окружающей среды будет сложно. Наконец, поскольку в нескольких отчетах отмечалось, что нейроны со сходными характеристиками ответа, как правило, преимущественно связаны [88–91], возможно, что происхождение и время рождения предсказывают предпочтительную связь, установленную щелевыми соединениями вместе с общими характеристиками ответа, обусловленными таламокортикальной специфичностью и пластичностью. -опосредованное созревание функциональных кортикокортикальных связей в незрелой коре [92].Однако молекулярные механизмы, лежащие в основе этих процессов, которые, как полагают, выполняются в масштабе длины шипов [91], остаются плохо изученными. Взятые вместе, эти результаты показывают, что время рождения смещает положение и проводку возбуждающих кортикальных нейронов, и что родственные связи могут предсказать функциональную связность и свойства ответа.

Кортикальные интернейроны, однако, развиваются из разных ветвей, берущих начало в возвышении медиального ганглия, возвышении каудального ганглия и преоптической области [93, 94].В то время как несколько групп активно изучали возможную клональную зависимость ингибирующего позиционирования интернейронов с использованием комбинации вирусной флуоресцентной маркировки и штрих-кодирования [95-101], различные результаты и разные интерпретации общих наборов данных подчеркивают необходимость осторожного применения инструментов отслеживания клонов ( см. вставку), а также аналитические и статистические определения и процедуры. Таким образом, возможная линейная зависимость позиционирования и проводки корковых интернейронов стала предметом интенсивных исследований; Кроме того, любая возможная зависимость положения и проводки кортикальных интернейронов от времени рождения до конца не изучена и также требует дальнейшего изучения [102, 103].Наконец, исследования развивающейся сетчатки позвоночных также предоставили ценную информацию о внутренних механизмах, лежащих в основе зависимой от времени регуляции клеточной судьбы и специфичности проводников, которые были подробно рассмотрены [104].

Внешняя и стохастическая регуляция нейронных проводников

В других нейронных системах время рождения и клеточное происхождение, по-видимому, не сильно ограничивают паттерны проводников, предполагая, что внешние и / или стохастические механизмы играют более доминирующую роль в регулировании специфичности проводников в этих системах .Здесь мы обсуждаем, как такие механизмы влияют на специфичность проводников Drosophila фоторецепторных клеток и обонятельных рецепторных нейронов (ORNs) и мышиных гранулярных клеток мозжечка (GCs).

Фоторецепторы дрозофилы

Сетчатка дрозофилы представляет собой мощную модельную систему для изучения спецификации клеточных судеб и специфичности проводников. Современные модели предполагают, что спецификация клеточной судьбы фоторецепторных клеток Drosophila включает серию межклеточных взаимодействий и некоторые случайные процессы (рис.).

Внешнее и стохастическое регулирование нейронной проводки. a В сетчатке Drosophila фоторецепторы R7 и R8 (и R1-R6; не показаны) продуцируются из пула предшественников. Межклеточные взаимодействия (синие стрелки) и стохастические механизмы (красные стрелки) играют критическую роль в спецификации клеточных судеб. Зрелые клетки R7 и R8 проецируют свои аксоны на слои 6 и 3 мозгового вещества соответственно. Родопсин: Rh. b В клоне обонятельных рецепторных нейронов (ORN) Drosophila одна клетка-предшественник в каждой сенсилле претерпевает несколько раундов асимметричного деления, давая начало четырем не нейрональным поддерживающим клеткам и от одного до четырех ORN в зависимости от других событий, таких как как гибель клеток и усыновление глиальной судьбы.Активация передачи сигналов Binary Notch используется итеративно, и латеральное ингибирование (красные столбцы) необходимо для определения судьбы клетки. ORN Notch-ON (N ⁺ ) и Notch-OFF посылают свои аксоны в разные клубочки в антеннальной доле. D: спинной; L: боковой. c В развивающемся мозжечке мыши предшественники гранулярных клеток (GCP) во внешнем наружном зародышевом слое (oEGL) претерпевают устойчивую пролиферацию в процессе, поддерживаемом Shh, полученным из клеток Пуркинье, и производным от GCP Jag1. GCPs во внутреннем наружном зародышевом листе (iEGL) подвергаются быстрому взрыву клеточного деления перед терминальной дифференцировкой, процессу, который стимулируется Wnt3 (экспрессируемым клетками Пуркинье), BMP и proNT3.Затем мигрирующие гранулярные клетки (GC) распространяют свои параллельные аксоны волокон в молекулярный слой (ML), где они контактируют с дендритными ветвями развивающихся клеток Пуркинье (повернутых на 90 градусов). Клоны зрелых GC, которые рождаются примерно в то же время, проецируют свои аксоны параллельных волокон на ограниченную глубину ML. Таким образом, параллельные волокна ранних GC занимают самые глубокие глубины ML, в то время как волокна поздних GC занимают самые поверхностные глубины ML. PCL: слой клеток Пуркинье; IGL: внутренний слой гранул

Составной глаз Drosophila состоит из примерно 800 идентичных единиц, называемых омматидиями, и каждый омматидий содержит восемь фоторецепторов (R1-R8), расположенных в стереотипном узоре [105].Фоторецепторы R1-R6 располагаются на периферии каждого омматидия и проецируют аксоны на пластинку, первый слой под сетчаткой, где они образуют синаптические связи с нейронами пластинки. Фоторецепторы R7 и R8 находятся в центре омматидия и проецируют свои аксоны на слои M6 и M3 мозгового вещества, ганглия ниже пластинки, где они синапсируют с трансмедуллярными нейронами, которые отправляют визуальную информацию в комплекс лобулы, более высокий зрительный центр. . При развитии омматидий восемь R-нейронов генерируются в следующем порядке: R8, R2 / R5, R3 / R4, R1 / R6 и R7 [105, 106].Интересно, что хотя восемь классов фоторецепторов продуцируются в фиксированном порядке, генетический мозаичный анализ показал, что нет родственных отношений между разными классами [107]. Эти данные предполагают, что индуктивные механизмы, а не клеточные клоны, определяют судьбы R-клеток Drosophila . Ниже мы рассмотрим, как межклеточные взаимодействия и стохастические механизмы определяют судьбы клеток R7 и R8, поскольку эти клетки обладают наиболее хорошо охарактеризованными механизмами развития.

Два гена, sevenless и невеста из sevenless ( boss ), являются критическими для спецификации R7, поскольку мутация любого из них приводит к полной потере клеток R7 во всех омматидиях [106, 108].Мозаичный анализ, позволяющий удалить определенные гены в одной или нескольких конкретных клетках, но не в соседних клетках, выявил более подробные механизмы. Делеция sevenless в клетках, отличных от R7 R, не влияет на развитие клеток R7, тогда как делеция sevenless в клетках R7 всегда вызывает трансформацию клеток R7 в ненейронные клетки, что указывает на то, что sevenless действует на клеточную автономно. Напротив, босс действует неавтономно: его экспрессия в клетках R8 необходима для развития R7.Дальнейшие молекулярные исследования идентифицировали Boss как 7-трансмембранный лиганд, экспрессируемый в клетках R8, и Sevenless как рецепторную тирозинкиназу, экспрессируемую в R7 (и некоторых других типах клеток). Более того, каскад киназ Ras / Raf / MAP действует ниже тирозинкиназного пути рецептора Sevenless, который активирует R7-специфические гены [109, 110].

После того, как клетки R7 и R8 обретают свою судьбу, в этих клетках избирательно экспрессируются белки родопсина (Rh), специфичные для клеточного типа, что позволяет им обнаруживать свет с разными длинами волн.Клетки R7 и R8 содержат два подтипа, экспрессирующих Rh: клетки R7 могут экспрессировать Rh4 или Rh5, тогда как клетки R8 могут экспрессировать Rh5 или Rh6. Эти подтипы спарены точно в омматидиях: 30% омматидий содержат Rh4-экспрессирующий R7 в паре с Rh5-экспрессирующим R8; 70% омматидиев содержат Rh5-экспрессирующий R7 в паре с Rh6-экспрессирующим R8. Интересно, что распределение подтипов R7, по-видимому, регулируется стохастической экспрессией транскрипционного фактора Spineless в клетках R7 [111]. Spineless активирует Rh5 и подавляет экспрессию Rh4 в R7 и подавляет неизвестный сигнал, необходимый для индукции экспрессии Rh5 соседних клеток R8.Напротив, Spineless-отрицательные клетки R7 экспрессируют Rh4 и побуждают соседние клетки R8 экспрессировать Rh5. Следовательно, экспрессирующие Rh4 клетки R7 всегда спариваются с экспрессирующими Rh5 клетками R8, тогда как Rh5-экспрессирующие клетки R7 всегда спариваются с экспрессирующими Rh6 клетками R8 [111, 112].

Поскольку и индуктивный, и стохастический механизмы управляют спецификацией клеточной судьбы Drosophila R7 и R8 клеток, как тогда спецификация клеточной судьбы связана с нацеливанием на аксоны? Было показано, что несколько молекул регулируют нацеливание на аксоны R-клеток, включая trio, dock, Pak, рецептор инсулина (InR), Dscam, N-cadherin, Lar, Netrin / Frazzled и Capricious [113–119].Хотя большинство из этих факторов не связаны с механизмами клеточной спецификации, Capricious предоставляет пример молекулы, участвующей в обоих процессах [120]. Capricious — это богатый лейцином трансмембранный белок с повторами, экспрессируемый в клетках R8, но не в клетках R7. Анализ усиления и потери функции предполагает, что Capricious регулирует ведение аксонов в клетках R8. Поразительно, но Capricious активируется фактором транскрипции, называемым Senseless, который специфически экспрессируется в клетках R8 и действует как ключевой детерминант судьбы клеток R8, стимулируя R8-специфические родопсины и ингибируя R7-специфические родопсины [120].Клетки R7 экспрессируют Prospero, другой фактор транскрипции, но расположенные ниже молекулы, направляющие аксоны, еще предстоит идентифицировать [120].

Эти находки предлагают модель, в которой факторы спецификации клеточной судьбы постоянно гарантируют, что каждый тип клеток экспрессирует уникальный набор молекул, направляющих аксоны, которые управляют специфичностью проводников. Однако текущие исследования в основном сосредоточены на изучении предполагаемых факторов спецификации или конечных молекул проводников. Мы ожидаем, что будущие исследования, объединяющие различные методы (см. Вставку), помогут объединить исследования обоих классов молекул.

нейронов обонятельных рецепторов дрозофилы

нейронов обонятельных рецепторов (ORN) являются первичные сенсорные нейроны обонятельной системы дрозофилы . Существует 50 классов ORN Drosophila (~ 1300 клеток), чьи клеточные тела расположены в антенне или верхнечелюстном щупике. Каждый класс ORN определяется экспрессией одного обонятельного рецептора ( или ) или уникальной комбинацией ионотропных рецепторов и клубочком, на который нацелены их аксоны в антеннальной доле [121–125].Остается решить два фундаментальных вопроса, касающихся развития и связывания ORN Drosophila : как гены или регулируются в разных классах ORN? И как регуляция или координируется со стереотипным нацеливанием на аксоны? Одно простое решение — использовать обонятельные рецепторы для нацеливания на аксоны; действительно, эта стратегия, по-видимому, управляет развитием обонятельной системы мышей [126–129]. Однако оказалось, что гены или не управляют нацеливанием на аксоны у Drosophila [130].Ниже мы обсуждаем эти два события по отдельности, а затем размышляем о том, как они могут быть связаны.

Спецификация ORN, по-видимому, использует комбинацию внутренних, внешних и стохастических механизмов и состоит из нескольких последовательных этапов: предварительное формирование паттерна имагинального диска антенн с помощью факторов формирования паттерна личинок и куколок, включая Hedgehog, Wingless и Decapentaplegic [131]; назначение сенсиллярных факторов транскрипционными факторами Lozenge, Atonal и Amos [132–134]; и окончательная спецификация с помощью дополнительных механизмов, таких как латеральное ингибирование посредством передачи сигналов Notch, эпигенетических процессов и дополнительных факторов транскрипции [135–137].Сенсиллы — это волосяные структуры, покрывающие антенны и верхнечелюстные щупики, а также ОРН хозяина и поддерживающие клетки. Поскольку разные сенсиллы и их подтипы стереотипно распределены на антеннах и верхнечелюстных щупиках и связаны со специфическими типами ORN, спецификация сенсилл, вероятно, контролируется внутренними факторами. Однако дальнейшая спецификация типов ORN внутри отдельных сенсилл включает внешние факторы. Здесь мы обсуждаем последний этап спецификации ORN, который приводит к выражению или .

Внутри каждой сенсиллы одна мультипотентная клетка-предшественник претерпевает несколько раундов асимметричного деления, давая от одного до четырех полностью дифференцированных ORN и четырех поддерживающих клеток (рис.). Бинарная сегрегация активности Notch (ON или OFF) итеративно используется во время каждого раунда деления, чтобы регулировать временные и конечные судьбы клеток [138], повторяя механизм, который, как сообщается, управляет развитием периферической соматосенсорной системы Drosophila [139]. Во время начального деления дочерняя клетка Notch-ON приобретает судьбу предшественников поддерживающих клеток, а дочерняя клетка Notch-OFF приобретает судьбу предшественников нейронов.Последний раунд деления в линии предшественников нейронов продуцирует два разных ORN, один Notch-ON и другой Notch-OFF, экспрессирующие два разных обонятельных рецептора и отправляющие аксоны в разные клубочки в антеннальной доле. Генетическая активация или ингибирование активности Notch приводит к образованию двух ORN Notch-ON или двух ORN Notch-OFF соответственно. Напр., Мутация Notch-позитивного эффектора , вдохновителя приводит к генерации двух Notch-OFF ORN, которые проецируются в один и тот же клубочек.Напротив, мутация антагониста Notch numb приводит к образованию двух ORN Notch-ON, которые также проецируются в один и тот же клубочек. Таким образом, передача сигналов Notch необходима для спецификации судеб ORN, вероятно, посредством латерального ингибирования [138]. Точное количество ORNs в одной сенсилле варьируется и, по-видимому, регулируется другими механизмами, такими как гибель клеток и усыновление глиальной судьбы [140]. Таким образом, поскольку разные классы ORN не рождаются последовательно, время рождения и родословная не предсказывают судьбу ORN, как в случае PN и KC; вместо этого спецификация судьбы ORNs, рожденных в одной сенсилле посредством асимметричного деления общего предшественника, включает латеральное ингибирование, опосредованное передачей сигналов Notch [138].

Передача сигналов Notch происходит во всех сенсиллах, но ORN присваивается только двум классам: Notch-ON и Notch-OFF. Т.о., должны существовать дополнительные контекстно-зависимые факторы, которые дополняют передачу сигналов Notch, обеспечивая каждому предшественнику возможность приобретать разную судьбу. Одна возможность состоит в том, что исходная или промежуточная клетка-предшественник сохраняет внутреннюю клеточную память, на которую передача сигналов Notch действует во время каждого клеточного деления. Действительно, два недавних исследования показали, что клеточная память может быть отпечатана на предшественниках посредством эпигенетической регуляции.Одно исследование обнаружило, что модификатор хроматина Hamlet модулирует клеточные ответы на передачу сигналов Notch контекстно-зависимым образом и контролирует выбор экспрессии или . Hamlet выполняет локус-специфические модификации метилирования гистонов и плотности гистонов, чтобы контролировать доступность связывающего ДНК белка в промоторных областях-мишенях Notch [141]. Другое исследование показало, что транскрипционный корепрессор Atrophin регулирует или гены в ORN Notch-ON, контролируя ацетилирование гистона 3 [142].Таким образом, эти данные подтверждают, что регуляция хроматина и эпигенетического статуса обеспечивает более разнообразные контексты для передачи сигналов Notch, позволяя специфицировать больше классов ORN. Мы ожидаем, что более всестороннее исследование статуса хроматина ORN и их предшественников, например, на уровне отдельных клеток, значительно улучшит наше понимание эпигенетической регуляции этих процессов.

Факторы транскрипции также играют критическую роль в регуляции экспрессии Or в постмитотических ORN, демонстрируя, что внутренние и стохастические Notch-опосредованные механизмы вместе управляют спецификацией ORN.Acj6 был впервые идентифицирован с помощью обонятельного поведенческого скрининга, в котором мутант acj6 обнаружил пониженные реакции прыжка на запаховые стимулы [143]. Acj6 экспрессируется в ORN взрослых антенн и верхнечелюстных щупиков и необходим для экспрессии или в подмножестве классов ORN [144, 145]. Более поздняя работа идентифицировала 13 альтернативных сплайсированных изоформ acj6 , а сверхэкспрессия разных изоформ в фоновом мутанте acj6 показала, что разные изоформы специфицируют разные ORN [146].Отдельные изоформы могут положительно или отрицательно регулировать экспрессию определенных генов или . Pdm3, другой фактор транскрипции домена POU, продемонстрировал широкую экспрессию в ORN, но он специфически необходим для активации одного гена Or , Or42a [147]. Интересно, что Acj6 также необходим для экспрессии Or42a , а acj6 и pdm3 , по-видимому, взаимодействуют генетически. Эти данные предполагают, что комбинаторный код различных факторов транскрипции может регулировать экспрессию генов или .Соответственно, другое исследование идентифицировало шесть новых факторов транскрипции, которые в комбинации с Acj6 регулируют экспрессию или в различных ORN [148].

Как факторы транскрипции регулируют экспрессию или в постмитотических ORN? Если факторы транскрипции непосредственно регулируют экспрессию специфических обонятельных рецепторов, должны быть связывающие мотивы в промоторных областях или . Эту идею поддерживают три линии доказательств. Во-первых, искусственный промотор Or , слитый с репортером, может повторять экспрессию эндогенного Or , даже если слитый с промотором репортер не был вставлен в эндогенный локус [149], что позволяет предположить, что цис- -регуляторных элементов в Или промотор регулирует экспрессию или .Во-вторых, было показано, что несколько промоторов или имеют общий связывающий мотив, который может связываться активатором или репрессором в зависимости от положения мотива внутри промотора [149]. В-третьих, было показано, что конкретный набор генов или имеет мотив связывания acj6 [150].

Взятые вместе, эти исследования подтверждают, что спецификация судьбы клеток ORN включает взаимодействие между внутренними, внешними и стохастическими факторами. Хотя мы обсудили, как различные механизмы управляют спецификацией ORN, остается неясным, как эти механизмы связаны с нацеливанием на аксоны ORN на более ранних стадиях развития.До сих пор было показано, что ряд сигнальных путей и молекул, включая передачу сигналов Sema-2b / PlexB и Hh и N-кадгерин, Dscam, Robo, Ten-a / Ten-m и Toll-6 / Toll-7, регулируют Ориентация на аксоны ORN [5, 6, 151–156]. Однако не было показано, что большинство из этих факторов регулируют судьбу ORN. Интересно, что Acj6, помимо регуляции экспрессии определенных генов или , также регулирует нацеливание на аксоны некоторых классов ORN [157]. Точный механизм, лежащий в основе такой регуляции управления аксонами, остается неясным и предположительно не зависит от регуляции экспрессии или .Другое исследование показало, что передача сигналов Notch в Notch-ON ORNs супрессирует экспрессию Sema2b, ключевого регулятора выбора траектории аксонов ORN [152]. Поскольку выбор траектории является критическим шагом в процессе специфичности проводки ORN, это открытие связывает определение судьбы ORN и специфичность проводки.

Остается много интересных вопросов: какие еще факторы транскрипции независимо регулируют гены или ? Какой комбинаторный код регулирует выражение или ? Существуют ли общие вышестоящие факторы, которые регулируют как экспрессию или , так и специфичность связывания молекул? Мы ожидаем, что систематический анализ отдельных транскриптомов ORN во время разработки поможет ответить на эти вопросы.

Гранулярные клетки мозжечка млекопитающих

Доказано, что индуктивные факторы регулируют процессы дифференцировки, миграции и образования проводников во время развития мозжечка млекопитающих. Как и кора головного мозга, мозжечок представляет собой слоистую структуру с разными типами клеток, расположенными в разных слоях. Примечательно, что гранулярные клетки мозжечка (GC), небольшие возбуждающие нейроны, упакованные во внутренний слой гранулярных клеток, составляют более половины всех нейронов в мозге млекопитающих. ГК отправляют аксоны параллельных волокон к молекулярному слою, где они синапсируют с дендритными шипами, усеивающими плоские дендритные ветви клеток Пуркинье, тормозных выходных проекционных нейронов коры мозжечка (рис.).

Во время пренатального развития мозжечка ромбическая губа генерирует предшественники гранулярных клеток (GCP), которые мигрируют и подвергаются длительной клональной экспансии во внешнем зародышевом слое перед выходом из клеточного цикла. GCPs затем мигрируют через развивающийся молекулярный слой, чтобы сформировать внутренний слой гранул, установить параллельные синапсы волокон с клетками Пуркинье и получить входящие в состав мшистые волокна через специализированные дендритные когти (Fig.; [158, 159]). Как и в случае развития коры головного мозга, развитие коры мозжечка происходит «наизнанку», поскольку ранее рожденные ГК проецируют свои аксоны на более глубокие части молекулярного слоя, а более поздние ГК проецируют свои аксоны на все более поверхностные глубины [160]. –162].Экспансия GCP, по-видимому, происходит с постоянной скоростью, примерно на одно или меньше делений в день, с последующим быстрым ростом клонально-связанных GCPs незадолго до дифференцировки и миграции [163].

Интересно, что одиночные GCP, помеченные в моменты времени уже на E13.5, дают начало клонам, которые проецируют свои аксоны на ограниченную глубину молекулярного слоя, что указывает на то, что эти клоны дифференцируются в ограниченном временном окне (Рис.; [164]) . Это открытие предполагает, что клонально связанные GC могут иннервировать близлежащие области данного дендритного ответвления клетки Пуркинье [163], и хотя функциональное значение такой связанной с клональной клональной системой кластеризации аксонов остается неизвестным, в одном исследовании сообщается о пространственно сгруппированных моделях активности параллельных волокон во время сенсорный процессинг, который может способствовать генерации дендритных шипов, нелинейной постсинаптической передаче сигналов кальция и синаптической пластичности в клетках Пуркинье [165].В то время как аксоны GCs, рожденные примерно в то же время, проецируются на ограниченные глубины молекулярного слоя, остается неизвестным, получают или нет GCs, связанные с клонированием или временем рождения, общие входы в виде мшистых волокон. Чтобы ответить на этот вопрос, в будущих исследованиях следует разработать стратегии доступа к ранним и поздним гранулярным клеткам и охарактеризовать их входящие в состав мшистые волокна.

Было показано, что несколько секретируемых факторов регулируют дифференцировку GCP и, таким образом, регулируют глубину, на которую GCs потомства проецируют свои аксоны.Одним из наиболее изученных факторов является звуковой еж (Shh), происходящий из клеток Пуркинье, который служит для продления пролиферации GCP и ингибирования дифференцировки GC [166–168]. Мутации в Shh и его последующих эффекторах наблюдались при различных формах детской медуллобластомы, наиболее распространенной детской опухоли головного мозга, которая вызывается чрезмерной пролиферацией GCP. Shh передает сигналы через свой канонический рецептор Ptch2 и корецепторы Boc / Cdon и Gas1, которые высвобождают передачу сигналов Smo в GCPs, что приводит к активации транскрипции посредством факторов транскрипции Gli1 и Gli2 [169–172].Кроме того, исследования in vitro показали, что происходящий из GCP Jag1 активирует передачу сигналов Notch3, что также поддерживает пролиферацию [173].

Кроме того, исследования in vitro выявили секретируемые факторы, которые способствуют дифференцировке и миграции GCP. Напр., Передача сигналов BMP ингибирует пролиферацию GCP in vitro и индуцирует дифференцировку за счет опосредованной протеасомами деградации Math2, фактора транскрипции, активного в пролиферирующих GCPs, и эта передача сигналов нарушается в мышиных моделях медуллобластомы [174].Wnt3, который экспрессируется в развивающихся и взрослых клетках Пуркинье [175], также подавляет пролиферацию GCP и ингибирует рост медуллобластомы, и делает это путем ингибирования транскрипционной реакции как на Shh, так и на Math2 [176]. Интересно, что экспрессия Wnt3 в клетках Пуркинье увеличивается постнатально и теряется у мутантов, лишенных GCs, это означает, что экспрессия Wnt3 зависит от взаимодействий между GCs и клетками Пуркинье [175]. Наконец, proNT3 способствует дифференцировке путем ингибирования Shh-индуцированной пролиферации после активации рецептора пан-нейротрофина p75 [177].Исследования in vitro показали, что proNT3 предотвращает Shh-индуцированную пролиферацию GCP и активацию путей Shh, а генетическая делеция p75 в GCP приводит к увеличению пролиферации GCP [177]. Однако клеточный источник proNT3, необходимого для этого процесса, остается неясным. Интересно, что происходящий из GC NT3 также необходим для собственно дендритного морфогенеза клеток Пуркинье [178], подчеркивая многофункциональность передачи сигналов NT3 в развитии мозжечка. Взятые вместе, эти исследования выявили несколько секретируемых факторов, которые способствуют дифференцировке и миграции GCP, но в первую очередь относятся к экспериментам in vitro, оставляя клеточные источники этих факторов неопределенными [179–182].В будущем необходимо проводить эксперименты с потерей функции in vivo с использованием линий Cre, специфичных для определенного типа клеток, и флоксированных генов, чтобы повторить описанные in vitro фенотипы.

Таким образом, было показано, что различные внеклеточные факторы, секретируемые из различных источников, регулируют пролиферацию и дифференцировку GC и, следовательно, также время рождения и глубину проекции аксонов, поскольку клонально связанные GC выходят из клеточного цикла примерно в одно и то же время и, таким образом, также проецируются. их аксоны на ограниченную глубину молекулярного слоя.В частности, эти исследования предполагают, что GCP, в отличие от корковых предшественников, которые делятся асимметрично, что приводит к спецификации положения постмитотических клеток и проводки, в значительной степени основанной на времени рождения (см. Исследования трансплантации, описанные выше), очень чувствительны к различным локальным сигналам окружающей среды, секретируемым клетками Пуркинье. и сами GCP. Такие сигналы либо положительно, либо отрицательно регулируют пролиферацию и дифференцировку GCP, и будущие исследования должны быть сосредоточены на однозначной идентификации клеточных источников этих сигналов и соответствующих вышестоящих механизмов, которые, в свою очередь, регулируют активацию этих сигналов.

Вставка: Методы отслеживания клонов в развивающихся нервных цепях

Для выяснения роли, которую клоны нейронов играют в установлении специфичности проводников в развивающейся нервной цепи, нейроны, принадлежащие к определенной линии, должны быть однозначно помечены на определенных этапах развития, что позволит впоследствии охарактеризовать морфология нейронов и проводка. Более того, нарушение гена в целевой популяции нейронов позволяет исследователям обратиться к молекулярным механизмам, лежащим в основе сборки цепей.Здесь мы рассмотрим несколько эффективных подходов к отслеживанию происхождения при разработке нейронных цепей и обсудим, как они могут сочетаться с новыми методами для характеристики организации цепей.

Новаторские методы отслеживания нейрональных клонов включают трансплантацию тканей и мечение ретровирусов [57, 183–187]. До развития генетических подходов трансплантация тканей позволяла отслеживать судьбы нервных клеток в развивающихся нервных системах in situ. Однако исследования трансплантации часто требуют сложных, инвазивных хирургических манипуляций на эмбрионе, что ограничивает их разрешение, гибкость и применимость.Стратегии ретровирусного мечения включают ретровирус, который инфицирует нейробласт и интегрирует свой собственный геном в геном клетки-хозяина, что приводит к наследованию вирусной нагрузки всем потомством в клеточном клоне. Недавние подходы к ретровирусной маркировке часто используют штрих-кодовые последовательности в качестве маркеров клеток, увеличивая пропускную способность отслеживания вирусных клонов и сводя к минимуму вероятность ложного клонального отнесения. Следовательно, ретровирусное мечение все еще широко используется для отслеживания нейронального происхождения в развивающихся нервных системах млекопитающих.

Прототипные и последующие генетические методы клонального мечения в основном основывались на ферментативной рекомбинации ДНК, чаще всего с помощью рекомбиназ Flp и Cre. Эта рекомбинация состоит из удаления последовательностей терминаторов транскрипции, фланкированных однонаправленными последовательностями-мишенями (варианты FRT и lox, соответственно), или инверсии таких последовательностей, фланкирующих ORF инвертированного репортерного гена, что приводит к экспрессии репортерных генов, таких как β-галактозидаза (β-gal ) или флуоресцентные белки (рис.). Рекомбинация ДНК, таким образом, представляет собой простой и мощный генетический трюк, широко используемый как у беспозвоночных, так и у позвоночных генетических модельных организмов для отслеживания нейрональных клонов [188–196].

Генетические стратегии для анализа происхождения. a A терминатор транскрипции (STOP), фланкированный однонаправленными сайтами FRT / lox, блокирует экспрессию эффекторного / репортерного гена, такого как GFP. В клеточной популяции, экспрессирующей Flp / Cre, рекомбиназа удаляет терминаторную последовательность, чтобы активировать экспрессию эффектора / репортера. b MARCM использует GAL80 для подавления экспрессии маркеров, управляемой бинарной системой экспрессии GAL4-UAS. Аллель дикого типа (WT), но не мутантный (MUT) интересующего гена связан с GAL80. После Flp-опосредованной митотической рекомбинации только гомозиготное потомство MUT теряет GAL80 и метится по экспрессии маркерного гена. c В исходной конфигурации MADM N-концевые и C-концевые кодирующие области GFP и RFP разделены на гомологичных хромосомах. Cre-опосредованная митотическая рекомбинация воссоздает эти кодирующие области с образованием четырех различных типов потомства (только GFP ⁺ , только RFP ⁺ , GFP ⁺ / RFP ⁺ дважды-положительный и немеченый), в которых флуоресцентная метка соответствует к клеточному генотипу

В основные стратегии, основанные на рекомбиназе, было внесено много улучшений.Напр., В то время как многие ранние генетические стратегии основывались на экспрессии β-gal, которая делает возможной чувствительную, надежную гистологическую маркировку клонов, β-gal локализуется в основном в соматах нейронов и не надежно маркирует аксоны и дендриты. Слияние кодирующей последовательности тау, белка, связывающего микротрубочки, с β-gal приводит к улучшению мечения аксонов [197, 198]. Кроме того, флуоресцентные белки, такие как GFP и tdT, легче диффундируют в нейронные отростки, а их связанные с мембраной производные, такие как mCD8-GFP и mtdT, обильно диффундируют в нейронные отростки из-за высокого отношения площади поверхности к объему этих компартментов. [20, 189], что позволяет картировать морфологию нейронов с разрешением одного процесса.Активность рекомбиназы также может быть направлена ​​на конкретные популяции клеток и временные точки развития. Например, экспрессия Flp / Cre, управляемая конкретными энхансерами, промоторами и генетическими локусами, обеспечивает генетический доступ к целевым популяциям клеток. Кроме того, экспрессия Flp, управляемая промотором теплового шока (hs-Flp) в Drosophila , позволяет контролировать временное окно и масштаб клональной индукции тепловым шоком в разные моменты времени и с различной продолжительностью. Аналогичного временного контроля над активностью Cre-рекомбиназы можно достичь с помощью CreER, слитого с рецептором эстрогена, и определения времени инъекции и дозировки агонистов [199].Более того, основанные на рекомбиназе интерсекционные методы обеспечивают большую генетическую специфичность, тем самым повышая разрешение картирования судеб нейронов [200-203]. Наконец, основанные на рекомбиназе стратегии клонального мечения, сочетающие мозаичный генетический анализ и отслеживание клонов, такие как мозаичный анализ с маркером репрессируемых клеток (MARCM) у Drosophila [20] и мозаичный анализ с двойными маркерами (MADM) у мышей [164] , широко используются для изучения развивающихся нейронных цепей.

MARCM использует преимущества бинарной системы экспрессии дрожжей GAL4 / UAS, в которой экспрессия белка GAL4 приводит к экспрессии генетического элемента, расположенного ниже восходящей активаторной последовательности (UAS), и соответствующего супрессорного белка GAL80, а также Flp / FRT-опосредованная межхромосомная митотическая рекомбинация для создания генетически различных дочерних клеток / клонов: гомозиготные мутантные клетки лишены GAL80, в то время как гетерозиготные и гомозиготные клетки дикого типа (WT) экспрессируют GAL80.Таким образом, экспрессия маркерного белка, управляемого UAS, может быть ограничена мутантной гомозиготной линией (рис.), Что позволяет проводить мозаичный анализ морфологии и проводников нейронов [12, 20, 21, 23, 204]. Существует несколько вариантов MARCM, включая обратный MARCM, в котором большинство клеток имеют нарушение данного гена и только несколько меченых клеток остаются диким типом [205]; двойная точка MARCM, в которой представляющие интерес клоны и сестринские клоны визуализируются с помощью дополнительных флуоресцентных маркеров [21]; и Q-MARCM, который использует Q-репрессируемую двоичную систему, ортогональную системе GAL4 / UAS [206, 207].MARCM широко использовался для разрозненного и одноклеточного мечения для клонального анализа, а также для анализа автономных и не автономных клеток функций генов. Поскольку различные драйверные линии GAL4 и Flp могут указывать цели MARCM клеточного типа и / или стадии развития, MARCM обеспечивает значительную специфичность клеточного типа и временное разрешение и, таким образом, большую гибкость для использования в различных нервных системах Drosophila для изучить сборку схемы в условиях WT и оценить функцию гена в развитии, учитывая обилие GAL4 и Flp линий драйвера, доступных сообществу Drosophila .

MADM использует митотическую межхромосомную рекомбинацию для восстановления кодирующих областей двух отдельных эффекторных генов, которые наследуются отдельными сестринскими клетками. Эти гены обычно представляют собой флуоресцентные белки, которые позволяют генерировать цветовой код, представляющий генетический статус последующих дочерних клеток или клонов; в исходной конфигурации MADM6, например, гомозиготные мутантные клетки имеют зеленый цвет, гомозиготные клетки WT — красные, а гетерозиготные клетки желтые или немеченые (рис.) [164, 208]. Таким образом, этот метод позволяет клеточно-автономный анализ нарушений генов в редко меченых клетках, экспрессирующих один из двух флуоресцентных репортеров (например, GFP и tdTomato). Поскольку MADM требует, чтобы две разные генные кассеты были вставлены в гомологичные хромосомные локусы около центромер, он ограничен генами, расположенными дистальнее этих кассет на хромосомах, в которые эти кассеты были интегрированы, с созданием соответствующих мышей MADM. MADM-опосредованный клональный анализ часто выполняется с использованием управляющих линий CreER и получения импульсов тамоксифена или его химических аналогов на определенных стадиях развития.Эта адаптация увеличивает временной контроль над MADM-опосредованной клональной маркировкой и генетическими манипуляциями. Более того, использование различных линий Cre расширяет специфичность клеточного типа к MADM. Наконец, аллели MADM могут также экспрессировать эффекторные гены, такие как белок-трансактиватор тетрациклина, вместо флуоресцентных маркеров, что позволяет, например, одновременно генерировать линию, неправильно экспрессирующую интересующий ген, и гомозиготную родственную линию мутантного родства [208]. MADM применялся для изучения множества развивающихся нервных структур, включая развивающуюся кору, гиппокамп, таламус, мозжечок и кишечную нервную систему [78, 98, 163, 178, 208–219], а также взрослые нервные стволовые клетки [220] .Наконец, создаются мыши, чтобы предоставить MADM доступ ко всем аутосомам (С. Хиппенмейер, личные сообщения).

После маркировки и генетических манипуляций данной линии, оценка нейронных связей может принимать различные формы. Флуоресцентная визуализация и физиологическая запись являются распространенными и дополнительными способами описания паттернов нейронных проводов. Живое изображение может также применяться для мониторинга динамики помеченных клонов в реальном времени [104, 221–224]. Методы многоцветной стохастической маркировки, такие как Brainbow, dBrainbow и MCFO, позволяют анализировать архитектуру нейронной сети в большом масштабе [225–229].Последние инновации в световой микроскопии, методах очистки тканей, обработке и регистрации изображений позволяют выполнять автоматизированную высокопроизводительную реконструкцию интактного мозга мышей [230–244]. Эти новые технологии могут позволить обнаруживать и характеризовать клоны после чрезвычайно редкого клонального мечения и, таким образом, могут затмить традиционные, более трудоемкие методы в образцах тканей большого объема. Используя стратегию секвенирования штрих-кода, в двух недавних исследованиях было достигнуто крупномасштабное картирование клонов in vivo [245, 246], которое можно было сочетать с появляющимися методами секвенирования РНК in situ [247, 248], чтобы обеспечить профилирование нейронных клонов в масштабах всего мозга и соединения.Помимо анатомического анализа, функциональная визуализация in vivo с помощью генетически закодированных датчиков кальция и напряжения широко используется для изучения физиологии нейронов [80, 249–255], предлагая дополнительные средства для решения функциональной ассоциации родственных нейронов в дополнение к более традиционным физиологические подходы [79, 81]. Более того, секвенирование одноклеточной РНК применялось к развитию мозга для идентификации молекулярных сигнатур разных типов нейронов и их транскриптомной динамики [22, 256–258], что позволяет систематически исследовать, как нейрональное происхождение определяет молекулярный консорциум, контролирующий специфичность проводки.Сочетание передовых генетических стратегий с масштабируемыми методами профилирования предоставляет беспрецедентную возможность открыть новые принципы сборки нейронных цепей, зависящей от происхождения.

Страница не найдена — Stephenson Equipment

, четверг, 16 июля 2020 г., в штаб-квартиру Stephenson Equipment в Гаррисберге, штат Пенсильвания, асфальтоукладчик «Stars & Stripes» был доставлен компании Hoffer Paving на пожертвование в размере 25 150 долларов США.00 был представлен в поддержку Фонда Гэри Синиза.

Было проведено небольшое социально дистанционное мероприятие, на котором собрались друзья и семья Stephenson Equipment, которые сделали возможным создание первого в мире асфальтоукладчика LeeBoy в тематике Stars & Stripes. Вместе с лидерами отрасли собрались службы быстрого реагирования, ветераны, медицинские работники, пожарные и полиция. «Мы хотели объединить героев нашего сообщества», — сказал Чарли Уолш, исполнительный вице-президент по продажам и маркетингу Stephenson Equipment. «Благодаря нашему пожертвованию, направленному на поддержку кампании по оказанию чрезвычайной помощи в связи с COVID-19, проводимой Фондом Синиз, мы хотели провести это небольшое мероприятие, чтобы не только отметить доставку асфальтоукладчика и пожертвование, но и дать первым респондентам возможность рассказать о том, как это пандемия влияет на их повседневный рабочий день.”

Конгрессмен США и отставной бригадный генерал Национальной гвардии Скотт Перри получил известие о мероприятии по доставке и хотел присутствовать на нем. Перри выступил на мероприятии: «Если вы меня знаете, вы знаете, что я люблю оборудование, обычно, когда вы видите асфальтоукладчик, он покрыт асфальтом, это прекрасная возможность увидеть этот красивый асфальтоукладчик в чистоте». «Мы ценим лидерство Стивенсона, усердную работу Hoffer Paving и Фонда Гэри Синиза».

Компания Hoffer Paving, базирующаяся в Аннвилле, штат Пенсильвания, впервые услышала об асфальтоукладчике Stars & Stripes от Скотта Шатца, территориального менеджера Стивенсона в их районе.На мероприятии были представлены брусчатки Hoffer, и Линда Хоффер, выступая на мероприятии, упомянула своего мужа Джо, который начал бизнес в 2002 году, их сына Джоуи, второго поколения компании, и их сотрудников, «чья самоотверженность и упорный труд сделали Hoffer Paving что это сегодня ». Она также добавила: «Для нас большая честь, что Stephenson Equipment предложила нам асфальтоукладчик LeeBoy Stars & Stripes, мы были основаны в 2002 году, и Stephenson является нашей компанией по производству оборудования с самого начала, а LeeBoy — нашим любимым асфальтоукладчиком.”

Стивенсон был дилером LeeBoy в течение почти 30 лет, и два лидера отрасли уже объединились, как это раньше, еще в 2016 году вместе они собрали и пожертвовали 100000 долларов Американскому онкологическому обществу в рамках своего проекта Pink Paver Project. Кристи Харрис, директор по маркетингу LeeBoy, присутствовала на мероприятии вместе с менеджером по северо-восточной территории LeeBoy Джимом Харкинсом. Кристи отметила это; «Когда Стивенсон обратился к нам по поводу этого начинания, мы с гордостью сказали« да »».

Еще не поздно сделать пожертвование. Если вы или ваша компания хотели бы участвовать в этом захватывающем проекте «Звезды и полосы», посетите страницу пожертвований и внесите свой вклад, чтобы общая сумма выросла!
Чтобы сделать пожертвование, перейдите по адресу: https: // donate.garysinisefoundation.org/StephensonandLeeBoy. Подарки могут быть сделаны в честь / в память о человеке или организации, установив флажок посвящения во время процесса онлайн-пожертвования.
В связи с продолжающимся распространением коронавируса (COVID-19) по стране Фонд Гэри Синиза предоставляет гранты службам быстрого реагирования, нуждающимся в средствах индивидуальной защиты, при ответах на обращения в службу поддержки COVID-19. Фонд также оказывает финансовую помощь медицинским работникам, военнослужащим, ветеранам, службам быстрого реагирования и их семьям, пострадавшим от нового коронавируса.

Мхандо мабхизимиси квема вари чизвидавирире незвазвинорева пачиеро пепа

Блок управления двигателем nhoroondo iri kutengesa.Chinhu chiitiko chaicho chinokonzera kuchinja mune Zvinoumba yesangano uye Manyuko ayo inotungamirwa. Звакаванда памусоро чии мхандо дзебхизимиси квема ири кубвунзва звинйорва дзирипо уйе кодзеро яво кути ваите, веренга памусоро.

kuchinja

Kuti zvakanaka aite basa, zvinokosha kuti mashoko ose zvoupfumi nevasori, evo mamiriro, nzvimbo, Manyuko inotungamirwa uye zvakataurwa kushandiswa. Данные звук изви звинонёрва нечиеро пепа. Это ачивака памусоро хуньямбири бок звинху: весангано пфума (звинху) уйе манюко айо инотунгамирва (мунатаисирева).звинху звосе изви звиноратидза пачиеро ири мари.

kupinda kaviri

mhando dzose dzebhizimisi kwema var chizvidavirire zvinyorwa zviri kuchinja mune Zvinoumba kuita uye munataisireva. Кана изви звайтва мукова кавири нечиеро джира: дебет уе звикверети. Ава нхорондо мбири дзакасияна. Информация chakanyorwa munhevedzano yokuverengwa kwenguva. Под mumwe kutengeserana apedza anofanira kuva muvhidhiyo uchapupu.

Обычно mumwe oparesheni rakakamurwa muzvikamu zviviri: Kutsunga runoenzanirana nhoroondo (zvakadzokororwa) uye kufungisisa zviri mwero mumatanda (проводка).Ekupedzisira akanyorwa basa cherogi kana chirangaridzo murayiro. Kuti zviite muitiro uyu, mumwe nyaya mari basa nhamba, iyo iri wiring. makamuri izvi yakabatanidzwa uye dzinoenderana zita nepakati papepa zvinhu. Нокути якарурама куратидзва опарешени звакакоша кунзвисиса кути мумве кутенгесерана ринованика муна мавири кана купфуура ньяя, аси звакаензана.

мхандо

Экономический машандиро аногона чете куканганиса кунобацира (А), пуса чете (П) кана чете пфума уйе кутамбира мари звинёрва.Tinzwe chaiwo kutengeserana inogona kuratidzei pakuenzanisa nenzira yakadai:

A + = Заглавная zvekushandisa mberi + + wazvipira.

Zvichienderana nokuchinja zvinhu uye munataisireva vachava govera kwemarudzi aya dzebhizimisi kwema iri kubvunzwa zvinyorwa:

• Kuchinja chete twa;
• кусандура чете мунатаисирева;
• Лист kuwedzera pamwe pakuenzanisa kuchengetedza;
• kuderera mune midziyo uye munataisireva kubva pachiyero kuchengetedzwa.

Купатсанура пакати квема аногона условно инопива дзири уравнения:

A «+» uye «-«;
N «+» P «-«;
A «+» P «+»;
А «-» П «-«.

Нгатионгорорей наво звизере.

mhando remapazi okutanga

Pakuenzanisa zvebhizimisi vanofanira kuratidza kushanda aibuda mari var mari kubva rokubhengi kubhadhara. Heano Nyaya mbiri sei twa. На звакаензана кунодерза ньяя «Текущий счет» уе акаведзера «кешия».Цаураниса джира звачосе хаана кучинджа. Paro zvingasanganisira:

• pakukurukura zvinoreva kubva chikwereti;
• звидуку мари дзосера цва;
• купарадзирва незвинху мукурима;
• zvigadzirwa anotumirwa, uye zvichingodaro. d.

Бизнес kwema kuchinja Zvinoumba wokutanga mhando pfuma kwete kukanganisa pakuenzanisa nhamba. Ваногона куниорва мучимиро мукана вокути ванху ванга ичи:

A + X — n = X, sezvamakaropafadzwa X — читсама кутенгесерана.

akavhiyiwa izvi kutora aitungamirira basa zvoupfumi basa. Chero kugadzira muitiro pasi Kuwanikwa mari uye basa pacharo. Восе звинху изви вари кунобацира.

Мхандо ремапази йечипири

Пакуэзаниса звебхизимиси ванофанира куратидза нокушанда кубхадхара звикверети кути бхизимиси тичирегередза бханги мбири муне мари мамириони 20,

pusa mbiri Nyaya Pano. Zvikwereti chikwereti kubhengi sangano kuwedzera uye chikwereti kune bhizimisi ungaderedza.Цаураниша джира нхамба кумбочинджа. ачинима мутеро аногона кунзи кунэ чете кусандисва, кутунгамирирва хвакаисвонака куна Резервный фонд, нйора курэ чикаму мари йембери звездинда сака. d.

Mhando idzi basa kwema iri kubvunzwa zvinyorwa sei chete Manyuko pfuma. Ваногона куниорва мучимиро мукана вокути ванху ванга ичи:

А = P + X — X.

Chechitatu mhando remapazi

To ichi mhando zvinosanganisira mabasa umo anochinja panguva kushingaira uye pusa mwero.Кана kuenzana ichi anodzokororwa pakati pavo. Somuenzaniso, aibuda zvikwereti kuvabhadhara, Os chionekeso somupiro guru mvumo, uye zvichingodaro. Д. Звинху уйе мунатаисирева пакати пачиеро папепа кучинджа нокада звакаензана. kwacho kunogona kunyorwa sechinhu mukana wokuti vanhu vanga:

А + Х = С + Н.

Мхандо чечина опарешени

Пакуэнзаниса звебхизимиси ванофанира куратидза кусханда чикверети муцивидзо ири уванду мамирийони 2 рубля. Somugumisiro pane rutapudzo zvinoreva «Current Nhoroondo» uye rutapudzo «Краткосрочные ссуды».Мидзиё уйе мунатаисирева пачиеро дзира вари кудередзва звакаензана, сака немиво академередза мари пачиеро;

A — X = R — H.

Мы фунга звосе сей куратидза звири-руоко мхандо дзосе дзебхизимиси квема.

Mienzaniso vanoshingaira remapazi

The mari kubva munhoroondo akagamuchira mari iri uwandu 150 zviuru. Kwiza nechekuzasi. Somugumisiro kuvhiyiwa uku, zvinoderedza pakuenzanisa kubhangi nhoroondo (KT51) uye anowedzera pakuenzanisa mari mazita (DT50).Бухгалтерские записи bhizimisi kwema: DT50 KT51 — 150 zviuru руб ..

Pakuenzanisa kutengeserana dzaitaurwa zvinotevera tafura.

Pakuenzanisa kutengeserana dzaitaurwa zvinotevera tafura.

Mienzaniso pusa remapazi

Personal mari mutero kundinyima kubva mari iri uwandu 20 zviuru.Kwiza nechekuzasi. Izvi mabhizimisi oparesheni kunotungamirira zvinoderedza chikwereti kune vashandi (KT68). Panguva iyoyo yakawedzera chikwereti kuna bhajeti (DT70). Электропроводка: DT70 KT68 — звиуру 20 руб ..

Pakuenzanisa kutengeserana dzaitaurwa zvinotevera tafura.

Pakuenzanisa kutengeserana dzaitaurwa zvinotevera tafura.

Mienzaniso tichishingaira-pusa akavhiyiwa

The mhando wechitatu.Panguva yokuchengetera zvinhu vakapiwa zvinhu kubva mutengesi Ари uwandu 320 zviuru. Кузора. нокути васингабхадхарви мари. Опарешени анэ симба памусоро есангано уе мунатаисирева:

• kuwedzera zvinhu aripo: KT10 320 zviuru рублей ..
• misha vane bhizimisi uye Подрядчики: KT60 320 zviuru рублей ..

Электропроводка: DT10 KT60 — 320 zviuru рублей ..

Pakuenzanisa kutengeserana dzaitaurwa zvinotevera tafura.

Pakuenzanisa kutengeserana dzaitaurwa zvinotevera tafura.

Мхандо Вечина.Sangano yakadzorerwa kune mutengesi ari uwandu 500 zviuru. Kwiza nechekuzasi. Опарешени анэ симба памусоро есангано уе мунатаисирева:

• misha vane bhizimisi uye Подрядчики: DT60 -500 zviuru руб ..
• kuderedza uwandu mari mubhengi nhoroondo: DT51 -500 zviuru рублей ..

Электропроводка: DT60 KT51 — 5001400uru ..

Pakuenzanisa kutengeserana dzaitaurwa zvinotevera tafura.

Pakuenzanisa kutengeserana dzaitaurwa zvinotevera tafura.

Muzviitiko zvose izvi, Kuchinja nzvimbo zvakaenzana.Tsauranisa jira zvachose iri kugadziridzwa ne zvakaenzana.

Kukosha nepakati

Zvakakosha kutevedza zvose zvinodiwa akanyorwa pachiyero pepa. Zvakajeka zvinoratidza dzemari sangano, zvinoratidza uyo paakapiwa sezvo ivo vanoiswa uye zvikwereti zviri yakasimbiswa. Aongorora nengaidzo anoverengeka yakareba, zvinokwanisika kufungidzira simba pamusoro sangano uye kuona kana zvinhu anoshandiswa zvakanaka. Kuvapo zvakanaka paainyora mashoko anobvumira maneja kufunga zvose zvakaipira sangano, nokungwaririra kuchengeta imba, vanotsvaka pezviri резервы.

Сезво рокузвидавирира гваро, пачиеро рине машоко анокоша. sangano rake kuzvidavirira kuna Dare miviri mutero kutarisira nhamba, chikwereti masangano. Zvichienderana noruzivo nechiyero jira nemamwe nhau mhando rinowanikwa mambure purofiti, akaisa kukosha kwemitero, mutemo unoti mipiro uye kubhadhara.

Balance pakutsvakurudza ndiyo pfupiso chairo, hurongwa mashoko ari pfuma mamiriro, zvoupfumi basa, statics uye nesimba netumedu mapurazi. Pasina kwazvo tsvakurudza uye kunyatsodzidza izvi mishumo kwakaoma zvisingaiti kugadzirisa nzira inobudirira kukura uye kuzoita upfumi zvavo uye zvikurukuru sangano zvikurukuru.

Центр прогнозирования штормов Вчерашние отчеты о штормах