Производство рвд: Производство и изготовление РВД

Содержание

Производство и изготовление РВД

Одним из направлений нашей деятельности является изготовление рукавов высокого давления.
Наша компания имеет множество собственных производственных участков, а наши специалисты, прошедшие стажировку в Италии, обладают многолетним опытом в производстве рукавов высокого давления. Изготовление готовых изделий осуществляется с учетом всех требований к технологиям производства, с использованием только высококачественных комплектующих, а также гарантированным контролем качества на всех этапах производства.



  Первый опрессовочный участок по производству рукавов высокого давления был открыт в 2005 году на территории склада ООО «Гидравия» в Санкт-Петербурге, второй — в 2010 году на территории склада в Москве. Помимо дополнительных участков по опрессовке РВД в Санкт-Петербурге, Бобруйске, Челябинске, Мурманске, Оленегорске, Апатитах мы рады предложить вам обратиться к любому из участников проекта H-POINT — везде вы получите одинаковый сервис и качество.

   

Все производственные комплексы по опрессовке РВД оснащены оборудованием для производства РВД итальянской компании OP S.r.l. 
Выбор оборудования определяется высоким качеством продукции данной компании, простотой в использовании, надежностью и долговечностью.


Производственная линия включает в себя:

Каждая производственная линия позволяет изготавливать до 30 000 РВД в месяц всех наиболее востребованных диаметров. Максимальный диаметр шестинавивочного рукава 2″, а промышленного рукава 4″. На заключительном этапе производства РВД вся готовая продукция проходит испытание статическим и импульсным давлением при помощи испытательного стенда, способного подавать четырехкратное рабочее давление.

Высокое качество готовых РВД гарантировано:

  • качественными комплектующими ведущих европейских производителей 

  • входным и выходным контролем качества продукции на соответствие всем необходимым стандартам

  • высокой квалификацией и опытом персонала

Большие складские запасы, наличие широкого ассортимента рукавов высокого давления и концевой арматуры различного ценового сегмента обеспечивают оперативность изготовления, поставки РВД по вашему индивидуальному заказу.

Срочный ремонт РВД, мастерская по производству РВД

Мы также оказываем услуги по сервисному обслуживанию и оперативному ремонту РВД . Для этого в 2010 году мы открыли первую мастерскую по ремонту рукавов высокого давления H-POINT. 


На сегодняшний день наша сеть насчитывает более 35 мастерских H-POINT расположенных в городах: Ульяновск, Волгоград, Старый Оскол, Екатеринбург, Дзержинский, Кемерово, Сосновый Бор, Белореченск, Бобруйск, Пенза, Пермь, Тула, Печора, Самара, Хабаровск, Нягань, Курган, Омск, Санкт-Петербург, Москва и многих других.

Обратившись в мастерскую H-POINT, вы в короткие сроки получите качественный и проверенный продукт, соответствующий всем необходимым стандартам. 

Информацию о мастерской в вашем городе вы можете найти на сайте www.h-point.org в разделе контакты.  Если вам нужно срочно изготовить или произвести ремонт РВД в Санкт-Петербурге, обратитесь в нашу мастерскую по адресу:  Парашютная ул., 43, стр. 2 • пом. 4-Н, тел.: +7 (812) 703-41-91  

Производство РВД

Производство рукавов высокого давления оснащено современным высокотехнологичным комплексом оборудования немецкого производителя UNIFLEX. Эта марка является мировым лидером на рынке станков для изготовления РВД.

Наши рукава высокого давления — надежные изделия качественной сборки, производящиеся с соблюдением всех необходимых стандартов производства, что гарантирует безопасную работу и полное соответствие продукции заявленным техническим параметрам

Используемые материалы:

Рукава резиновые – бренд Semperit (Чехия – Австрия), бренд Verso (Италия) и проверенных российских производителей

Фитинги и втулки – бренд Cast (Италия), Vitillo (Италия) и проверенных российских поставщиков

В наличии гидравлические фитинги для сборки РВД импортных и Российских стандартов: DK, DKI, BSP, DKOS, DKOL, JIS, JIC, DKI, ORFS, NPTF, BSPT, SFS, SFL, BANJO

В наличии рукава высокого давления в широком ассортименте: 1SN, 2SN, 2SC, 2SN-K, SPC3 4SP, 4SH и других типов

Контроль качества:

Контроль внутреннего диаметра обжима каждого фитинга с помощью специальных калибров

Периодический контроль качества изделий на гидравлических испытательных стендах

Обязательная очистка рукава от инородных частиц и герметизация фитингов от попадания пыли

Упаковка и маркировка каждого произведенного РВД

 

Мы предлагаем:

  • Срочное изготовление РВД  (в том числе по образцам, чертежам или параметрам Заказчика и в присутствии заказчика)
  • Ремонт поврежденных РВД
  • Изготовление РВД выполняется квалифицированными и обученными специалистами
  • Минимальные сроки оформления и отправки заказа
  • Изготовление РВД для различной техники российского и импортного производства
  • Гарантия на произведенную продукцию – 12 месяцев
  • Всегда в наличии большой ассортимент готовых РВД для техники JCB
  • Дополнительно с РВД мы предлагаем: БРС, защитные спирали,  резьбовые адаптеры и переходники, гидравлические жидкости

Для удобства соединения навесного оборудования и базовой машины предлагаем гидравлические быстроразъемные соединения (БРС) различных типов

Наиболее распространенные и надежные в эскплуатации БРС типа FIRG / FLAT FACE, которые применяются при подключении гидромолота к гидросистемам дорожно-строительной техники

 

Защитные спирали:

Дополнительные защитные спирали предотвращают рукава высокого давления от внешних механических повреждений и износа от трения. Материал спиралей — твердый износостойкий полиэтилен, либо металлическая нержавеющая проволока.

 

Заказать РВД или получить квалифицированную консультацию можно по телефону: 8 800 700 5 066
Также можно отправить заявку на электронную почту: [email protected]
Или приехать и выбрать РВД из наличия и оформить заказ по адресу: п. Большой Исток, ул. Свердлова, 42а

Производство РВД. Оборудование. Этапы производства.

Рукава высокого давления – специальные гибкие шланги, обеспечивающие подачу под высоким давлением различных жидкостей, газов и эмульсий. РВД довольно широко применяются во многих сферах народного хозяйства – машиностроении, сельском хозяйстве, строительстве и металлургии. Соответственно, высокий спрос на этот материал только стимулирует рост предложений. Компания КАСКАД является официальным дистрибьютором таких брендов, как PARKER, UNIFLEX, FINN POWER — мировых лидеров в производстве оборудования для изготовления шлангов высокого давления.

 

 

Несмотря на то что производство РВД весьма трудоемкая деятельность, такой бизнес сейчас очень перспективен в плане высокой прибыли. А поскольку особой конкуренции в этой нише пока нет, самое время задуматься о собственном небольшом предприятии. Так же организация участка по обжиму РВД может заинтересовать организации, обслуживающие парк дорожной, строительной, коммунальной или сельскохозяйственной техники.

Технология изготовления рвд.

Прежде чем заказывать у поставщиков комплект оборудования для производства РВД необходимо определиться с направлением деятельности. Составьте список изделий, которые планируете выпускать. Именно от этого будут зависеть ваши дальнейшие действия.

Определите следующие параметры производимых рукавов высокого давления:

максимальный диаметр,

вид и число оплеток,

предельное значение рабочего давления,

виды фитингов.

В зависимости от перечисленных параметров, можно выделить несколько типов рукавов, которые вы при должном техническом оснащении сможете выпускать:

Рукав в оплетке.

Резиновый рукав.

Политетрафторэтиленовый рукав.

Рукав из термопласта.

Как показывает практика, оптимальный вариант – это производство РВД в оплетке, поскольку благодаря своим характеристикам они могут использоваться в любых гидравлических системах, а потому более всего востребованы среди потребителей. Но со временем ассортимент готовых изделий можно расширять, выпуская и прочие виды продукции. Так вы сможете наладить сотрудничество с крупными компаниями, нуждающихся и в других РВД.

 

 

Этапы производства рукавов высокого давления.
  1. Нарезка шланга согласно требуемым размерам. На данном этапе очень важно получить идеально ровный срез, чтобы гарантировать изделию герметичность. Здесь же подбираются и комплектующие к рукавам (муфты, фитинги, переходники и адаптеры).
  2. Обработка рукавов, их сборка и прессование. На этой стадии на специальном аппарате тем или иным способом (поперечным или продольным) происходит обжимание рукава. Специальный обжимной станок для производства РВД обеспечивает достаточную герметичность изделию и его плотное сцепление с муфтами.
  3. Контроль качества. Без некоторых процедур проверки качества не должен обходиться даже мини-завод. Испытание, как правило, производится с помощью подачи в шланг жидкости под большим давлением.

Техническое оснащение участка производства РВД.

В бизнес план производства РВД обязательно должен быть включен пункт, посвященный выбору технологической линии. Сейчас многие поставщики предлагают к продаже как отдельные аппараты для выпуска шлангов, так и уже собранные линии. То, какое оборудование для производства РВД выберите вы, будет зависеть от планируемой мощности предприятия, финансовых возможностей и вида изделий, которые собираетесь изготавливать.

В стандартную линию входит следующее оборудование для производства РВД:

  • Прессы для обжима – у нас можно подобрать станки различной производительности, питающиеся от сети, аккумуляторной батареи или с пневмоприводом.
  • Отрезные автоматы.
  • Обдирочный (окорочный) аппарат для зачистки слоя резины внутри и снаружи.
  • Маркировочный автомат.
  • Дополнительное оборудование, без которого не обойтись в цехе: станина для пресса, роллы для разматывания бухт со шлангами, приспособление для смены кулачков, испытательный стенд высокого давления.

Компания КАСКАД предлагает широкую линейку оборудования для производства РВД ведущих мировых производителей PARKER, UNIFLEX. Представлены обжимные прессы, как для промышленного серийного производства, так и для небольших участков обжима РВД, сервисных центров. Не забывайте, что качественная линия – залог изготовления качественных рукавов!

 

 

Расходные материалы для изготовления РВД.

После того как вы приобрели станок для производства РВД и прочие составляющие линии, необходимо подумать о подготовке сырьевой базы для организации работы цеха. Сотрудничайте только с надежными поставщиками. Только так можно обеспечить бесперебойный процесс изготовления шлангов РВД. Тут важно высокое качество комплектующих.

Сырье не отличается высокой стоимостью. Минимизировать расходы вы сможете, договорившись с продавцами о регулярных оптовых поставках.

Основные комплектующие для производства РВД, которые потребуются при работе:

  • рукава высокого давления,
  • муфты обжимные,
  • штуцеры,
  • ниппели,
  • переходники и вставки различного типа,
  • трубные соединения.

Под хранение материалов понадобится отдельное помещение. Впрочем, в целях экономии на аренде производственных площадей хранить и сырье, и готовую продукцию можно на одном складе. В нашем каталоге (раздел сайта — Продукция) представлен широкий выбор расходных материалов для производства шлангов высокого давления. Компания КАСКАД является официальным дистрибьютором ведущих мировых производителей, цены вас приятно удивят! 

 

 

Возможно Вам будут интересны следующие материалы сайта:

Рукава высокого давления   Оборудование для производства РВД   Фитинги для шлангов высокого давления

Изготовление рукавов высокого давления (РВД) в Москве

Рукава высокого давления — это особые трубопроводы, предназначенные для подачи и транспортировки жидкостей различной плотности и вязкости под высоким давлением. Если вы купите РВД, их можно будет использовать при работе с различными маслами, нефтью, газом, разнообразным топливом и химическими веществами.

Шланги РВД применяются в химической, нефтяной и пищевой промышленности, в сталелитейном производстве, сельском хозяйстве и строительстве для подачи и транспортировки нефтяных продуктов, кислот и щелочей, абразивных веществ, горячей и холодной воды, пара, пищевых жидкостей и спирта.

Компания «УДРБРОКК» занимается производством РВД следующих типов:

  • оплеточные;
  • навивочные;
  • штуцерованные арматурой.

Наиболее распространенными являются РВД с оплетками, которые по своей конструкции делятся на четыре вида: 1ST, 2ST, 1SN и 2SN. Эти рукава высокого давления в основном используются при работе с жидкостями в широком температурном диапазоне, ознакомиться вы можете с ними в каталоге ниже.

В каталоге ниже представлены некоторые типы РВД, которые изготавливает и предлагает купить наша компания:

Рукава высокого давления серии SN

РВД DIN 1 SN диаметр 6 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 225 атмосфер, радиус изгиба 100 мм.

РВД DIN 1 SN диаметр 8 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 215 атмосфер, радиус изгиба 115 мм.

РВД DIN 1 SN диаметр 10 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 180 атмосфер, радиус изгиба 130 мм.

РВД DIN 1 SN диаметр 12 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 160 атмосфер, радиус изгиба 180 мм.

РВД DIN 1 SN диаметр 16 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 130 атмосфер, радиус изгиба 200 мм.

РВД DIN 1 SN диаметр 20 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 105 атмосфер, радиус изгиба 240 мм.

РВД DIN 1 SN диаметр 25 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 88 атмосфер, радиус изгиба 300 мм.

РВД DIN 1 SN диаметр 32 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 63 атмосфер, радиус изгиба 420 мм.

РВД DIN 1 SN диаметр 38 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 200 атмосфер, радиус изгиба 500 мм.

РВД DIN 1 SN диаметр 50 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 40 атмосфер, радиус изгиба 630 мм.

Рукава высокого давления серии 2 SN

РВД DIN 2 SN диаметр 6 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 400 атмосфер, радиус изгиба 100 мм.

РВД DIN 2 SN диаметр 8 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 350 атмосфер, радиус изгиба 115 мм.

РВД DIN 2 SN диаметр 10 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 330 атмосфер, радиус изгиба 130 мм.

РВД DIN 2 SN диаметр 12 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 275 атмосфер, радиус изгиба 180 мм.

РВД DIN 2 SN диаметр 16 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 250 атмосфер, радиус изгиба 200 мм.

РВД DIN 2 SN диаметр 20 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 215 атмосфер, радиус изгиба 240 мм.

РВД DIN 2 SN диаметр 25 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 165 атмосфер, радиус изгиба 240 мм.

РВД DIN 2 SN диаметр 32 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 125 атмосфер, радиус изгиба 420 мм.

РВД DIN 2 SN диаметр 38 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 90 атмосфер, радиус изгиба 500 мм.

РВД DIN 2 SN диаметр 50 мм.

Двухоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 80 атмосфер, радиус изгиба 630 мм.

Рукава высокого давления серии 4 SH

РВД DIN 4 SH диаметр 10 мм.

Четырехоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 445 атмосфер, радиус изгиба 180 мм.

РВД DIN 4 SH диаметр 12 мм.

Четырехоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 415 атмосфер, радиус изгиба 230 мм.

РВД DIN 4 SH диаметр 16 мм.

Четырехоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 350 атмосфер, радиус изгиба 250 мм.

РВД DIN 4 SH диаметр 20 мм.

Четырехоплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 350 атмосфер, радиус изгиба 300 мм.

РВД DIN 4 SH диаметр 25 мм.

Однооплеточный рукав высокого давления. Рабочее давление составляет 280 атмосфер, радиус изгиба 340 мм.

Рукава высокого давления PTFE (термостойкие)

Тефлоновый PTFE рукав SAE 100 R14 гофра диаметр 10 мм.

Тефлоновый PTFE рукав 100 R14 гофра диаметр 12 мм.

Тефлоновый PTFE рукав SAE 100 R14 гофра диаметр 16 мм.

Тефлоновый PTFE рукав SAE 100 R14 гофра диаметр 20 мм.

Четыре вида навивочных РВД

  • 4SP – используются для транспортировки специальных жидкостей под средним давлением.
  • 4SH – используются при высоком давлении.
  • R12 – используются для продолжительных работ под средним давлением и при высокой температуре.
  • R13, R15 – используются в самых тяжелых условиях и опасной среде, под высоким давлением и большой нагрузке.

Штуцерованные арматурой РВД применяются в основном в гидросистемах и трансмиссиях, используются в самой разной технике (автомобильная, промышленная, строительная).

Компания «УДРБРОКК» занимается ремонтом РВД и изготовлением РВД на заказ. Благодаря нам, вы можете купить необходимые вам РВД в Москве по низкой цене. Вся продукция, произведенная «УДРБРОКК» имеет ряд преимуществ:

  • Гарантия от 1 месяца
  • Высокое качество (производим шланги РВД на оборудовании европейского уровня)
  • Повышенная стойкость к механическим воздействиям (многослойная конструкция позволяет выдерживать большие нагрузки)
  • Доступная стоимость

Наши работы

Изготовление рукавов высокого давления: 4 этапа производства РВД

Рукав высокого давления РВД — это гибкая часть трубопровода, которая используется в гидравлических коммуникациях для стыковки подвижных элементов и подвода к ним рабочих жидкостей (машинное масло, смазки и т. д.). Из названия понятно, что такие изделия способны выдерживать высокие показатели давления. Они способствуют снижению вибрационных воздействий на конкретные детали гидроконструкций.

Технология производства РВД зависит от типа изделия и его характеристик

Разновидности РВД

Самые простые, с конструктивной точки зрения, рукава высокого давления представляют собой шланги, оснащённые стальной оплёткой. Такие изделия являются неармированными, однако, за счёт оплётки способны выдерживать большое давление рабочей среды. Помимо этого, существуют и другие РВД, на которые стоит обратить внимание.

Рукав в оплётке. Отличается высоким коэффициентом гибкости, что позволяет использовать такой РВД практически во всех современных гидравлических конструкциях. Рукава, оснащённые оплёткой, применяются в трубопроводных конструкциях для подачи рабочей среды под давлением. Такие изделия состоят из 3 основных слоёв:

  • внутренний;
  • средний;
  • внешний.

Обратите внимание! Шланги в оплётке способны функционировать в тяжёлых эксплуатационных условиях. Температурный диапазон таких изделий составляет от −70 до +70 °C.

Резиновые шланги состоят из нескольких слоев разных материалов, это придает изделию высокую прочность

Резиновый спиральный шланг. Основная функция такого приспособления заключается в подаче рабочих жидкостей (эмульсий или масел). Доставка рабочих жидкостей производится там, где их подача сопровождается импульсами. С конструктивной точки зрения, такие рукава являются более сложными, чем предыдущий тип. Рассмотрим основные конструктивные элементы, которые входят в состав таких шлангов:

  • внешняя проволочная спираль;
  • проволочная спираль, располагающаяся внутри шланга;
  • текстильная прослойка;
  • резиновая прослойка;
  • непосредственно текстиль.

Сложность конструкции этого РВД позволяет ему осуществлять ещё одну важную функцию — отвод статического электричества, которое возникает в гидравлических конструкциях.

Политетрафторэтиленовый (ПТФЭ). Такие изделия отличаются резистентностью к агрессивным химическим соединениям. Как правило, они используются в конструкциях со средними показателями давления.

Рукав из термопласта. Внешняя прослойка такого изделия изготавливается из устойчивых к температурным колебаниям материалов. РВД такого типа способны выдерживать температуру от −40 до +100 °C. Кроме этого, он обладает высокими прочностными характеристиками.

Помимо этого, РВД классифицируется на два основных вида:

  • изделия, оснащённые металлическими навивками;
  • изделия с оплёткой из металла.

Рукава в оплетке — наиболее популярный тип подобных изделий

Кроме вышеуказанных типов РВД, существуют и другие, однако, они имеют узкоспециальную эксплуатационную область и применяются очень редко.

Конструктивные особенности рукавов высокого давления

На сегодняшний день наиболее распространёнными считаются РВД с оплёткой. Рукава высокого давления состоят из отдельных конструктивных элементов. Рассмотрим три основные части, которые включают в себя эти приспособления:

  • сильфонная часть;
  • оплётка;
  • наконечник.

Сильфонная часть — это гибкий отрезок трубопровода, который отличается своим ребристым исполнением. Существует несколько вариантов классификации сильфонных гофротрубок. В зависимости от структуры сильфонные трубки подразделяются на 2 типа:

  • состоящие из одного слоя;
  • двухслойные.

Кроме этого, сильфонные трубки разделяют ещё по одному важному параметру — форма рёбер. В зависимости от формы рёбер сильфонные трубки могут быть 2 типов, а именно:

  • параллельные;
  • винтовые.

Оплётка — конструктивный элемент большинства шлангов высокого давления, который является металлической проволокой, усиливающей прочностные характеристики рукавов.

Полезная информация! В соответствии с нормами толщина проволоки, которая используется для оплётки РВД, должна быть не менее 0,3 мм. Одна полоса оплётки, как правило, включает в себя от 6 до 12 проволочных нитей.

Рукава оснащаются разными типами наконечников для соединения с различным оборудованием

Помимо усиления прочностных характеристик РВД, оплётка также позволяет им выдерживать более высокие показатели давления во время эксплуатации.

Наконечник — это конструктивный элемент рукава высокого давления, который выполняет соединительные функции. Наконечник представляет собой штуцер (в некоторых случаях гайку) и используется для стыковки РВД с остальными частями коммуникации.

Достоинства РВД

Рукава высокого давления отличаются от обычных труб, которые используются в гидравлических коммуникациях, поэтому необходимо знать их отличительные черты. Рассмотрим основные технические характеристики шлангов высокого давления:

  • все конструктивные элементы, которые входят в состав шлангов высокого давления отличаются хорошей устойчивостью к коррозийным воздействиям и агрессивным химическим веществам. Благодаря этому их можно использовать в системах, где в качестве среды выступают различные жидкости;
  • внутренний и наружный слои РВД обладают хорошей сопротивляемостью к воздействию низких, а также высоких температур. РВД можно использовать в тяжёлых эксплуатационных условиях;
  • ещё одним достоинством этих изделий является высокий коэффициент гибкости;
  • как правило, фитинги и опрессовка шлангов, которые используются в системах с высокими показателями давления, отличаются хорошим качеством;
  • высокое качество уплотнительных элементов, используемых при монтаже РВД, тоже является залогом надёжности;
  • хорошая резистентность к механическим воздействиям.

Такие изделия пользуются популярностью в различных эксплуатационных сферах. Рассмотрим некоторые из них:

  • металлургия;
  • нефтяная отрасль;
  • химические производства;
  • строительная сфера.

Процесс производства рукавов включает в себя несколько этапов, последовательность которых строго соблюдается

Изготовление рукавов высокого давления — серьёзное мероприятие, которое проходит в 4 этапа:

  1. Подготовительный этап.
  2. Обжим.
  3. Испытания РВД.
  4. Нанесение специальной маркировки.

Подготовка к изготовлению шлангов высокого давления

Перед тем как приступить к изготовлению рукавов высокого давления РВД, необходимо произвести подготовительные работы. Подготовка к производству РВД включает в себя:

  • подбор конструктивных элементов для выполнения таких шлангов;
  • настройка производственного оборудования.

Важно! Соединительные элементы (фитинги) для шлангов высокого давления подбираются в зависимости от показателя сечения изделия. От этого геометрического параметра также зависит выбор переходных элементов и разного рода адаптеров.

Далее необходимо ориентируясь на размеры фитинга, подобрать специальные детали — кулачки для обжима. После подготовки обжимных кулачков производится настройка обжимного пресса на нужный диаметр. Следующий этап — подготовка обрезного станка и обрезка рукава высокого давление. Это необходимый процесс, посредством которого получают изделия необходимой длины. Срез, выполненный при помощи такого станка, получается максимально ровным, что является очень важным для дальнейших манипуляций. В случае необходимости торцы РВД дополнительно зачищаются.

При необходимости выполняется зачистка рукава на специальном окорочном станке

Затем необходимо удалить со шланга наружный слой, который состоит из резины. Удаление резиновой прослойки выполняется до оплётки посредством специального станка, который называется окорочным. Не для всех типов шлангов требуется зачистка резины (например, для рукавов 2SN).

Параллельно с удалением резинового слоя собирается муфта ниппельного типа. Далее, эту соединительную деталь надевают на шланг высокого давления, а затем вставляются фитинги необходимых размеров, подобранные ранее для конкретного РВД. В конце производится установка обжимных кулачков в обжимной аппарат. Таким образом, выполняются подготовительные работы к производству рукавов высокого давления.

Обжим

После того как подготовительные работы позади, можно приступать непосредственно к производству рукавов высокого давления РВД. Основным этапом изготовления этих изделий является обжим, который проводится на специальной аппаратуре, а именно — обжимных станках. Перед началом обжима рекомендуется проверять оборудование на исправность. На сегодняшний день существует два варианта обжима РВД:

  • продольный метод;
  • поперечный метод.

Продольный. Этот вариант обжима РВД применяется, как правило, в более развитых европейских странах, однако, и в России он также встречается. Продольный метод производства позволяет получить обе разновидности этих изделий (оплёточные и навивочные). Технология производства в этом случае подразумевает использование муфты, которая имеет кольцевые зубцы. Кольцевые зубцы располагаются с обратной стороны детали, что позволяет крепко зафиксировать шланг при обжиме.

При помощи процедуры обжима на рукава устанавливаются необходимые фитинги

Высокий показатель герметизации достигается посредством механического воздействия на шланг. РВД, полученные таким методом, как правило, используются в гидравлических конструкциях, которые отличаются высокими показателями давления.

Поперечный. Отечественное производство рукавов высокого давления в большинстве случаев подразумевает использование второго метода — поперечного. Такой способ позволяет изготавливать изделия оплёточного вида. Технология такого способа подразумевает подготовку специальных обжимных муфт, которая предварительно обрабатывается на станке. Эта обработка позволяет удалить прослойку резины с её поверхности. После этого производится непосредственно поперечный обжим. Кулачки обжимного типа, в которых фиксируется шланг, сжимают его и в результате на поверхности шланга образуется узор, напоминающий ступени.

Полезная информация! РВД, которые получают посредством поперечного метода, отличаются демократичной стоимостью и используются в конструкциях, где рабочая среда находится под давлением не более 12 МПа.

Испытания и нанесение маркировки

Испытания являются необходимым этапом изготовления РВД. Это связано с тем, что готовая продукция должна в обязательном порядке проверяться на качество. Такая проверка позволяет своевременно выявить некачественные шланги. Рукава высокого давления должны соответствовать существующим государственным стандартам.

Перед началом испытательных работ, как правило, готовые изделия надувают. Это необходимо для того, чтобы очистить их от пыли, грязи и других инородных элементов. После продувки шланга, его подключают к необходимой испытательной аппаратуре, которая отвечает за подачу рабочей среды под давлением, превышающим нормальное эксплуатационное примерно в 2 раза. Во время проведения испытаний в качестве рабочей среды используется масло или же вода. Если шланг выдержал необходимое давление и на нём не проявилось трещин или других дефектов, то тогда он считается пригодным к использованию. После проведения проверки, шланг опять прочищают с помощью воздуха.

На последнем этапе на рукава наносится специальная маркировка. После нанесения маркировки готовые изделия сортируются и упаковываются для хранения или транспортировки.

Производство РВД — изготовление рукавов высокого давления, армированные шланги давления

Изготовление РВД по индивидуальному заказу

Магазин «Железяка» предлагает своим клиентам услуги по производству рукавов высокого давления (РВД). РВД необходимы для подачи под высоким давлением технических жидкостей в гидравлических и масляных системах машин и специальной техники. Если вы точно знаете, какой именно РВД нужен – не сомневайтесь, прямо на ваших глазах наши специалисты исполнят желания.

Вы можете заказать РВД  любого размера, даже более ста метров длиной! Наши шланги способны выдержать температуру от +100 градусов по Цельсию до – 45 градусов. Максимальный диаметр, который представлен в нашем магазине – 139 мм., а минимальный – 6,8 мм. У нас гигантский выбор фитингов – более 80 % существующих в нашей стране!

Изготовление РВД

Практически вся работа по изготовлению РВД автоматизирована. Точно отмерив длину и подобрав фитинг, наши специалисты доверяют остальную работу отрезному, обжимному и окорочному станкам, которые окончательно подготавливают РВД. Как следует из названия, отрезной станок обязан точно и ровно отрезать шланг, обжимной станок (он же пресс для изготовления РВД) обжимает трубы, а окорочный станок зачищает гидравлические шланги, снимая с них верхний слой.

Магазин «Железяка» тщательно подошел к поиску самого производителя станков для изготовления РВД. Наш выбор пал на качественного немецкого производителя Uniflex, производящего оборудование для изготовления РВД уже 40 лет, ставившего за это время лидером в своей области. Первоклассное оборудование гарантирует высокую скорость и качественное выполнение шлангов РВД.

Пресс Uniflex S 6.2 Ecoline позволяет изготавливать рукава высокого давления диаметром от 6, 8 до 139 мм, чем может похвастаться далеко не каждый магазин, производящий РВД. А отрезной станок Uniflex EM 8 работает тихо, без дыма и лишнего мусора. Все это позволяет быстро и тихо делать РВД самого разного диаметра буквально за считанные минуты.

Зачистка и тестирование РВД

Для тех, кто хочет быть уверен на 100 % в качестве приобретаемой продукции, мы предлагаем уникальную дополнительную услугу – тестирование готовых РВД. Используемый нами испытательный стенд фирмы Uniflex позволяет не только проверить работу РВД в максимально жестких условиях, но и обработать РВД водомасляной смесью, которая обладает антикоррозийным эффектом.

Зачистка РВД также проводится на известном оборудовании Uniflex. Промывка РВД проводится как с внутренней, так и с внешней стороны. После промывки рукава полностью очищаются от микропыли, от заусенцев и пр.

Цена РВД, заказ РВД

Мы не хотим обирать клиентов, для нас важно другое – чтобы все остались довольны походом в наш магазин. Именно поэтому услуга по изготовлению РВД бесплатна. Вы платите только за комплектующие материалы, а работа – это подарок нашим клиентам.  

Кроме того, мы предлагаем уникальную услугу — заказ РВД через сайт или по телефону. Достаточно заполнить специальную форму, отправить её нам на почтовый ящик. Наши специалисты подготовят по указанным параметрам РВД, который будет дожидаться вашего приезда в магазин «Железяка».

Отдел по производству РВД работает с 9:00 до 23:00

Контактный телефон (495) 641-51-00 доб. 7137

 

 Бланк заказа

 

Производство РВД: оборудование и этапы

Рукава высокого давления (РВД) представляют собой гибкие трубки с фитингами для соединения. Их используют для подвода рабочих жидкостей к гидравлическим коммуникациям, а именно машинного масла, смазки и прочих жидкостей.

Главные требования к РВД – это прочность и герметичность. Они зачастую зависят от оборудования, на котором были изготовлены рукава.

Какое оборудование нужно для производства РВД

Для изготовления рукавов используют основное и дополнительное оборудование. 

К основному относятся:

  • станки для обжима и для отрезания;
  • машины для маркировки;
  • стенды для испытаний.

Дополнительное включает бабины для шлангов, станины для станков и т.д.

Стоит заметить, что для производства шлангов для бытовых нужд используют обычные станки. РВД для предприятий металлургической и строительной промышленности производят на многофункциональном оборудовании.

Где купить оборудование для изготовления РВД

Купить станки для производства РВД можно в компании ТД «РВД» https://www. ooorvd.ru/catalog/oborudovanie-dlya-proizvodstva-rvd/. Компания сама занимается производством оборудования, поэтому реализует товар без наценки посредников. Приобрести здесь можно ручные, сервисные и промышленные станки. Фирма доставляет товары в любую точку России.

Какие этапы производства РВД

Изготовление рукавов высокого давления включает 4 этапа:

  1. Подготовительный этап – в это время происходит проверка и настройка оборудования, а также отрез шланга. Отрез позволяет получить рукав нужной длинны, срез при этом выходит максимально ровным.
  2.  Непосредственно производство – включает обжим изделия. Обжим проводят двумя методами: продольным или поперечным. Первый используют страны Европы, второй больше характерен для нашего рынка.
  3. Проверка продукции – каждое изделие тестируют на герметичность и прочность, рукава надувают, проводят жидкость под высоким давлением. Качественные изделия не имеют трещин и других дефектов, соответствуют ГОСТу.
  4. Маркировка.

Некачественное оборудование – причина брака рукавов высокого давления, они плохо обжимает стыки рукава и фитинга. Такой рукав требует скорой замены.

Информация предоставлена компанией

Y2J в сравнении с RVD – Производство и контактная информация

Имя STARметр Известен
Мэтт Аноай Рози Рози Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Эрик Бишофф Эрик Бишофф Эрик Бишофф Увидеть меньше

Только для членов

WWE Raw (1993)
Крис Брэннан Себя Себя Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Джонатан Коучман Джонатан Коучман Джонатан Коучман Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Рико Константино Рико Рико Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Эдди Фату Джамал Джамал Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Дэйв Финли Фит Финли Фит Финлей Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Рик Флер Рик Флер Рик Флер Увидеть меньше

Только для членов

WWE Raw (1993)
Лилиан Гарсия Лилиан Гарсия Лилиан Гарсия Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Джефф Харди Джефф Харди Джефф Харди Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Эрл Хебнер Эрл Хебнер Эрл Хебнер Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Букер Хаффман Букер Т Букер Т Увидеть меньше

Только для членов

WCW Понедельник Нитро (1995)
Мэтт Хайсон Спайк Дадли Спайк Дадли Увидеть меньше

Только для членов

Чемпионат Востока по борьбе (1993)
Гленн Джейкобс Кейн Кейн Увидеть меньше

Только для членов

Не вижу зла (2006)
Крис Джерико Крис Джерико Крис Джерико Увидеть меньше

Только для членов

Макгрубер (2010)
Джон Лауринайтис Джон Лауринайтис Джон Лауринайтис Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Джерри Лоулер Джерри «Король» Лоулер Джерри «Король» Лоулер Увидеть меньше

Только для членов

Человек на Луне (1999)
Поль Левеск Тройной Н Тройной Н Увидеть меньше

Только для членов

WWE Raw (1993)
Марк ЛоМонако Бабба Рэй Дадли Бабба Рэй Дадли Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Эндрю Мартин Контрольная работа Контрольная работа Увидеть меньше

Только для членов

18 колес правосудия (2000)
Даррен Мэтьюз Уильям Регал Уильям Регал Увидеть меньше

Только для членов

WWE: Боже мой! — 50 лучших инцидентов в истории WWE (2011)
Стефани МакМахон Стефани МакМахон-Хелмсли Стефани МакМахон-Хелмсли Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Чак Палумбо Чак Чак Увидеть меньше

Только для членов

Гром WCW (1998)
Ник Патрик Ник Патрик Ник Патрик Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Чад Паттон Чад Паттон Чад Паттон Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Джей Ресо христианин христианин Увидеть меньше

Только для членов

Пристрели их (2007)
Дастин Роудс Голдаст Голдаст Увидеть меньше

Только для членов

Медная купюра (2020)
Чарльз Робинсон Чарльз Робинсон Чарльз Робинсон Увидеть меньше

Только для членов

WWE Raw (1993)
Джим Росс Джим Росс Джим Росс Увидеть меньше

Только для членов

Рестлмания Х-Семь (2001)
Терри Раннелс Терри Терри Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Монти Сопп Билли Ганн Билли Ганн Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Лэнс Шторм Лэнс Шторм Лэнс Шторм Увидеть меньше

Только для членов

WWE Смакдаун! (1999)
Роб Ван Дам Роб Ван Дам Роб Ван Дам Увидеть меньше

Только для членов

Атака трехголовой акулы (2015)

Pioneer представляет жидкокристаллический рефлективный информационный проектор RVD-XG10 | Выпуск новостей | Новости и события | Корпоративная информация

Пионер

10 марта 1998 г.
Корпорация Пионер

Pioneer представляет ЖК-отражательный проектор данных RVD-XG10

RVD-XG10

ТОКИО, Япония, 10 марта 1998 г. —— Компания Pioneer объявила о выпуске жидкокристаллического рефлективного информационного проектора с высоким разрешением и высокой яркостью.Проектор с номером модели RVD-XG10 был разработан как универсальный инструмент для презентаций, предназначенный для воспроизведения различных визуальных источников, от высококачественных видеоизображений до компьютерных данных с высоким разрешением.

План запуска следующий.

0 Mid Of March’98
Продукт Модель № S.R.P. Дата запуска
ЖК-проектор данных RVD-XG10 ¥ 1,200 000 ¥ 1 200 000
1 <Концепция планирования>

, поскольку ПК стал популярным бизнес-инструментом, мы чаще представлять видеоизображения вместе с компьютерными данными на различных деловых площадках. Чтобы соответствовать сегодняшним требованиям, Pioneer разработала RVD-XG10 как ЖК-проектор высокого разрешения, который может воспроизводить различные системы телевизионных сигналов и высококачественные визуальные изображения, поступающие с HDTV и DVD. Сначала компания представит модель на японском рынке, а затем в США и Европе.

В RVD-XG10 используется недавно разработанный отражающий тип ЖК-пикселя, называемый цифровым отражающим пикселем изображения (или просто DRI), который намного эффективнее использует источники света.Pioneer также применяет новую лампу высокой яркости и высокоэффективное поляризационное устройство вместе с DRI. Благодаря этим новым устройствам и технологиям RVD-XG10 достигает 800 ANSI * 1 люмен, что в два раза ярче, чем у предыдущей модели. Модель может полностью воспроизводить разрешение XGA (1024 x 768 точек) и, кроме того, она была разработана для работы с разрешением UXGA (1600 x 1200 точек) *2 при сжатом отображении. Кроме того, он также может воспроизводить разрешение SXGA (1280 x 1024 точек) и даже HDTV за счет сжатия и частичного отображения.

Помимо этих функций, RVD-XG10 разработан с учетом удобства эксплуатации. Он имеет функцию plug and play Windows 95 для легкого подключения к персональному компьютеру. Вы избавитесь от неприятных настроек, таких как регулировка частоты, фазовая синхронизация и позиционирование дисплея. Все это делается с помощью функции автоматической настройки. Любой может настроить его для презентации. RVD-XG10 сделает визуальную презентацию на ПК простой и легкой.

< Основные характеристики >
  1. Готовые системы мульти-ТВ.Он может воспроизводить NTSC, PAL и SECAM.
  2. Готов к различным уровням разрешения.
    XGA (1024 x 768 точек): полная совместимость.
    UXGA (1600 x 1200 точек): сжатый дисплей.
    SXGA (1280 x 1024 точек): сжатое и частичное отображение
    SVGA (800 x 600 точек): увеличенное или оконное отображение.
    VGA (640 x 480 точек): увеличенный или оконный дисплей.
  3. 800ANSI люмен, высокая яркость.
    Недавно разработанная лампа высокой яркости (150 Вт) и высокоэффективное поляризационное устройство делают его хорошо видимым при обычном комнатном освещении.
  4. Plug in & Play, функция автоматической настройки для удобства эксплуатации.
    Вам нужно только подключить RVD-XG10 к вашему персональному компьютеру, после чего оптимальные настройки разрешения, частоты, фазы и положения дисплея будут выполнены автоматически. (Чтобы использовать эту функцию, он должен быть подключен к ПК с Windows95 VESA DDC и к графическому ускорителю.)
  5. Тонкий дизайн и портативный размер.
    Тонкий дизайн делает устройство удобным и не мешает вашему зрению.Его высота составляет всего 130 мм, а объектив хранится в основном корпусе для защиты.
  6. Простой пульт дистанционного управления и функция 4-ступенчатого цифрового масштабирования обеспечивают простое, легкое и удобное управление.
  7. Универсальная установка. Устройство имеет функцию переворота изображения вверх-вниз и вправо-влево, поэтому его можно установить с потолка или даже за экраном.

<Основные характеристики> 900Inches 3 :89004 Вес3 кг
Способ отображения: Отражающий тип DRI LCD RGB 3 панели
ЖК-панель: 0. 937INCH X 3
Количество пикселей: 807,040 (1,040 x 776) x 3
Линзы: Объектив моторизованного зума / фокус
Источник света: 150W (Novarc H-150)
Яркость: 800ansi Lumen
Разрешение цвета: Полный цвет (16,7 миллионовц)
Размер экрана: 38 — 300 дюймов
Проекция: 1.8–11,2 м
Скан. Частота : Гор. 15,6–82 кГц (аналоговый вход RGB 24–82 кГц), вер. 59–75 Гц
Видеовход: NTSC/NTSC4.43/PAL/N-PAL/M-PAL/SECAM
Входные разъемы: 2 аналоговых аудиоразъема RBG (15 контактов D-Sub) (Stere Mini Jacks)
1 Видео (разъем RCA/S с приоритетом в сигнале S)
1 Аудио (RCA, контакты L, R)
Управление RS232C (D-Sub, 9 контактов)
Аудиовыход: 2 Вт + 2 Вт Стерео
Выход: 1 аналоговый RGB (мини-разъем D-Sub, 15 контактов)
1 аудио (стереофонический мини-разъем, переключатель RGB/видео)
Источник питания: 900V1 AC2400V —
Потребляемая мощность: 280 Вт
Размеры: 330(Ш) x 416(Г) x 130(В) мм
Дополнительное оборудование: Кабель питания 2 м, кабель для подключения к компьютеру 2,8 м,
Mac Adopter, PC98 Adopter, кабель AV,
аудиокабель (стерео мини), крышка объектива, беспроводной пульт дистанционного управления
, 2 батареи, руководство по эксплуатации, тестовая дискета
, кабель RS232C и сменная вилка

Генетические перестройки массивов повторов, содержащих вариабельный остаток (RVD), в бакуловирусной системе TALEN

Mol Ther Methods Clin Dev. 2014; 1: 14050.

, 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 , 1 и 1 и 1, 2, *

Cia-Hin Lau

1 Департамент биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Haibao Zhu

1 Департамент биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Johan Chin-Kang Tay

1 Департамент биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Zhendong Li

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Феликс Чан Тай

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Си Нгапоре, Сингапур, Сингапур

Кан Чен

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Ви-Киат Тан

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Singapore

Shouhui Du

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Vic-Ki Sia

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур Rui

-Zhe Phang

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Shin-Yi Tang

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Chiyun Yang

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Си Ngapore, Singapore, Singapore

Zhixia Chi

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Chieh-Ching Liang

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Эр Нин

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

Шу Ван

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

29333 Институт биоинженерии и нанотехнологий, Сингапур, Сингапур

1 Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура, Сингапур, Сингапур

2 Институт биоинженерии и нанотехнологий, Сингапур, Сингапур

* Факультет биологических наук, Национальный университет Сингапура , Сингапур 117543, Сингапур. Электронная почта: [email protected]

Первые два автора внесли равный вклад в работу.

Поступила в редакцию 15 августа 2014 г .; Принято 17 августа 2014 г.

Copyright © 2014 Американское общество генной и клеточной терапии

Эта работа лицензирована. под неперенесенной лицензией Creative Commons Attribution-NonCommercial-ShareAlike 3.0. Изображения или другие сторонние материалы в этой статье включены в лицензию Creative Commons на статью, если иное не указано в кредитной строке; если материал не включен в лицензию Creative Commons, пользователям необходимо будет получить разрешение от держателя лицензии на воспроизведение материала.Чтобы просмотреть копию этой лицензии, посетите http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/3.0/

Эта статья была процитирована другими статьями в PMC.

Abstract

Вирусные векторы для переноса генов были успешно использованы для экспрессии эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), в клетках млекопитающих. Поскольку ДНК-связывающие домены TALEN состоят из модулей тандемных повторов, содержащих вариабельные остатки (RVD), а геном вируса с повторяющимися последовательностями подвержен генетической рекомбинации, мы исследовали несколько факторов, которые могут влиять на эффективность расщепления TALEN бакуловирусных векторов.Используя систему TALEN, предназначенную для нацеливания на локус AAVS1 , мы наблюдали повышенную нестабильность последовательности массивов повторов TALE, когда для получения бакуловирусных векторов использовалась более высокая множественность заражения (MOI) рекомбинантных вирусов. Мы также обнаружили более вредные мутации в ДНК-связывающих доменах TALE, когда левое и правое плечи TALEN были помещены в одну кассету экспрессии по сравнению с вирусами, содержащими только одно плечо. Изменения последовательности ДНК в доменах включали делецию, добавление, замену и обмен цепями ДНК между левым и правым плечами TALEN.Основываясь на этих наблюдениях, мы разработали протокол с использованием низкого MOI для получения бакуловирусных векторов, отдельно экспрессирующих левое и правое плечо TALEN. Котрансдукция вирусов, полученных по этому оптимальному протоколу, обеспечила повышенную эффективность расщепления TALEN и обеспечила эффективную сайт-специфическую интеграцию трансгена в клетки человека.

Введение

Недавние достижения в области редактирования генома с использованием нуклеаз цинковых пальцев (ZFN), 1,2 эффекторных нуклеаз, подобных активаторам транскрипции (TALEN), 3,4 и управляемых РНК кластеризованных регуляторных коротких палиндромных повторов с интервалами (CRISPR)-ассоциированные нуклеазные системы Cas9 5,6 обещают оказать глубокое влияние на биологические исследования и могут привести к новым клиническим применениям генной и клеточной терапии.Эти программируемые химерные нуклеазы обеспечивают надежные и точные генетические модификации, индуцируя целевые двухцепочечные разрывы ДНК, которые стимулируют механизм репарации клеточной ДНК на основе негомологичного соединения концов (NHEJ) и/или репарации, направленной на гомологию (HDR). Когда специфичная к последовательности нуклеаза доставляется вместе с конструкцией гомологичной донорной ДНК, HDR будет включать гомологичную цепь в качестве шаблона репарации в целевой сайт. Применение технологии ZFN для генной терапии в настоящее время проходит раннюю фазу клинических испытаний (ClinicalTrials.идентификаторы gov: {«type»:»clinical-trial»,»attrs»:{«text»:»NCT00842634″,»term_id»:»NCT00842634″}}NCT00842634, {«type»:»clinical-trial»,» attrs»:{«text»:»NCT01252641″,»term_id»:»NCT01252641″}}NCT01252641 и {«type»:»клиническое испытание»,»attrs»:{«text»:»NCT01044654″,»term_id «:»NCT01044654»}}NCT01044654). Системы CRISPR-Cas9, управляемые РНК, очень привлекательны из-за потенциала мультиплексируемой геномной инженерии. 6 Тем не менее, TALEN остается одним из наиболее многообещающих инструментов для целенаправленного редактирования генома, поскольку его побочные эффекты менее заметны.

Учитывая большой потенциал вирусных векторов в генной и клеточной терапии, в ряде исследований эти векторы использовались для доставки функциональных ZFN в клетки человека для целенаправленного редактирования генома. Аденовирусные, 7,8 аденоассоциированные вирусные, 9 бакуловирусные, 10–12 и дефектные по интегразе лентивирусные векторы 13,14 обеспечивали эффективную доставку и временную экспрессию функциональных ZFN. Недавно лентивирусные и ретровирусные средства доставки использовались для экспрессии как кодон-оптимизированного Cas9, так и его синтетической направляющей РНК для сайт-специфического редактирования генома. 15 Кроме того, нокаутная библиотека CRISPR-Cas9 на основе лентивирусной РНК в масштабе генома была адаптирована для полногеномных целевых мутаций или генетического скрининга потери функции в эмбриональных стволовых клетках мыши, 16 рака человека и плюрипотентных стволовых клетках. 17,18 Несмотря на большие успехи в редактировании генома на основе TALEN, остается много технических проблем, связанных с использованием вирусных векторов для доставки TALEN.

Функциональный TALEN создается путем слияния ДНК-связывающего домена TALE с доменом расщепления ДНК FokI. 19 Модульные тандемные повторы ДНК-связывающего домена самоассоциируются с образованием правосторонней суперспирали, которая закручивается вокруг большой бороздки ДНК. 20 Каждый повтор обычно содержит высококонсервативную последовательность из 34 аминокислот, за исключением вариабельных ди-остатков повтора (RVD) в 12-й и 13-й аминокислотах. 21 12-й остаток стабилизирует локальную конформацию петли RVD, тогда как 13-й остаток обеспечивает специфический контакт со смысловой цепью ДНК, что придает ДНК специфичность. 20,21 Поскольку одна единица повтора, несущего RVD-содержащую петлю, образует левосторонний двухспиральный пучок для распознавания каждого основания ДНК в целевой последовательности, TALEN, созданные с помощью тандемного массива повторов, могут распознавать целевые последовательности, указанные этим простым кодом распознавания ДНК. 20,21

Подобно препятствиям, связанным с клонированием повторяющихся последовательностей ДНК, повторяющиеся последовательности собранных массивов повторов TALE могут способствовать нежелательной гомологичной рекомбинации, нарушая специфичность нацеливания ДНК TALEN. Поскольку сегменты вирусного генома, содержащие повторяющиеся последовательности, нестабильны и склонны к генетическим перестройкам, использование вирусного вектора для упаковки и доставки функциональных генов TALEN может оказаться еще более сложной задачей. 22 На сегодняшний день лишь в нескольких исследованиях пытались использовать вирусные векторы, несущие гены TALEN , для модификации генома в клетках человека. В первом исследовании использовался вектор на основе аденовируса для размещения и доставки интактных генов TALEN в различные клетки человека для эффективного редактирования генома. 23 Впоследствии был описан набор протоколов, подробно описывающих спасение, размножение и очистку аденовирусов, экспрессирующих TALEN. 24 Благодаря рекомбинации Gateway LR собранные генов TALEN можно легко перенести в аденовирусную векторную систему, что облегчает доставку функциональных TALEN в клетки млекопитающих. 25 Хотя изначально было показано, что лентивирусный вектор не может переносить интактные гены TALEN, 23 в более позднем исследовании успешно использовались перекодированные TALE для устранения повторяющихся последовательностей массива TALE RVD и для создания функционального лентивируса, несущего TALEN, с высокой эффективностью целенаправленного редактирования генома. в индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК). 26 Воспользовавшись тем, что основанный на одноцепочечной ДНК геном аденоассоциированных вирусов (AAV) менее подвержен рекомбинации, светоиндуцируемые эффекторы транскрипции, содержащие настраиваемый ДНК-связывающий домен TALE, были упакованы в вектор AAV и использованы для нацеливания на геном мыши в первичных нейронах и коре головного мозга для оптического контроля эндогенной транскрипции и эпигенетических состояний. 27

Недавно мы разработали бакуловирусную систему TALEN для целенаправленных геномных манипуляций в ИПСК. 28 В отличие от других носителей вирусной доставки, бакуловирусные векторы обладают рядом преимуществ, таких как высокая эффективность трансдукции в широком диапазоне типов клеток, включая плюрипотентные стволовые клетки человека, большая способность к клонированию с возможностью упаковки длинных ДНК-вставок, отсутствие репликации в клетках млекопитающих, и низкий цитопатический эффект на трансдуцированные клетки. 10–12,28–33 Несмотря на то, что с помощью нашей системы BV-TALEN была достигнута высокая эффективность направленной интеграции в ИПСК человека, структурная целостность и функциональная стабильность ДНК-связывающего домена TALE в бакуловирусных векторах доставки еще предстоит изучить. оценивается.Здесь мы сообщаем о разработке метода обнаружения генетических перестроек массивов повторов TALE в бакуловирусных векторах, несущих ген TALEN , и описываем ряд достижений в производстве бакуловирусных векторов, которые позволяют минимизировать эти перестройки, тем самым обеспечивая улучшенное эффективность сайт-специфической модификации генома.

Результаты

Разработка нового метода обнаружения генетических перестроек массивов повторов TALE

Чтобы охарактеризовать события перестройки в массивах повторов TALE в вирусном векторе, мы сначала разработали метод, основанный на клонировании ТА и расщеплении RE, для изучения изменения размера массивов (). Мы использовали плазмидный вектор, сконструированный ранее для получения BV-TALEN(LR), бакуловирусного вектора с длинной повторяющейся последовательностью после вставки левого и правого плеча TALEN в одну экспрессионную кассету, для проверки метода. 28 Наши первоначальные усилия с использованием Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity для амплификации массивов повторов TALE плазмиды привели к получению лестницы продуктов ПЦР, отличающихся от целевого фрагмента ДНК размером 1,76 т.п.н. на кратность повторяющейся единицы (слева). Генерация таких теневых полос обычно наблюдается, когда области тандемных повторов амплифицируют с помощью ПЦР с использованием праймеров, комплементарных уникальным последовательностям, которые фланкируют область повтора, и, вероятно, из-за смещения проскальзывающей цепи ДНК-полимеразой Taq. 34,35 Поскольку элонгаза обеспечивает высокую процессивность путем редактирования зарождающихся цепей для обеспечения последующей полимеризации ДНК-полимеразой Taq, эту смесь ферментов использовали вместе с платиновой ДНК-полимеразой Taq High Fidelity. Мы также увеличили температуру отжига ПЦР до 72 ° C и включили 5–8% ДМСО в качестве добавки для ПЦР, чтобы улучшить специфичность амплификации и уменьшить удлинение скользящей цепи ДНК-полимеразой Taq. 36

Разработка основанного на клонировании TA и расщеплении RE метода для изучения генетических перестроек массивов повторов TALE.( a ) Схема работы. Кассета экспрессии слияния, несущая как левое, так и правое плечо TALEN (TALEN LR), амплифицируется с прямыми и обратными праймерами для ПЦР (FP и RP), разработанными для амплификации массивов тандемных повторов полной длины. Продукты ПЦР встраивают в вектор клонирования ТА. Расщепление EcoRI отдельных клонов с последующим электрофорезом в агарозном геле используется для обнаружения изменения размера массивов повторов TALE. Обнаружение фрагмента ДНК размером 1,76 т.п.н. указывает на то, что количество единиц тандемных повторов остается правильным в кассете экспрессии TALEN.Для дальнейшей классификации событий генетической перестройки клоны без явных изменений размера подвергают секвенированию ДНК. ( b ) Использование смеси ферментов позволяет проводить ПЦР-амплификацию одной полосы. Слева: Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity. Справа: Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity, смешанный с Elongase (1:2). ( c ) Клонирование TA и расщепление EcoRI не обнаруживают изменений в размере массивов повторов TALE в образцах плазмидного вектора. Полоса в 3 kb после расщепления EcoRI представляет собой линеаризованный вектор клонирования, а полоса ДНК в 1.76 kb представляет собой вставку ДНК, несущую массив повторов TALE. «–» и «+»: Без EcoRI и с ним. В качестве стандарта молекулярной массы использовали ДНК-лестницу размером в одну т.п.о. ( d ) Анализ секвенирования ДНК подтверждает отсутствие изменений в специфичности распознавания ДНК с помощью RVD в левом (верхняя панель) и правом (нижняя панель) плечах TALEN в указанных выше образцах плазмид. Выравнивание аминокислотной последовательности проводили после трансляции последовательностей ДНК в аминокислоты. Парные буквы в последовательности представляют собой RVD (HD, NI, NG и NN) для каждой повторяющейся единицы TALE в плече TALEN.

В оптимизированных условиях были получены продукты ПЦР с одной ярко выраженной полосой около 1,76 т.п.н. (справа), что указывает на то, что полноразмерные ДНК-связывающие домены TALE плазмиды были успешно амплифицированы. Хотя протестированная плазмидная матрица содержит два плеча TALEN и используемые праймеры могут связываться с обоими, мы использовали более короткое время денатурации и удлинения ПЦР для предпочтительной амплификации фрагментов одного плеча. Это возможно, учитывая тот факт, что полное удлинение праймера больше для более коротких матриц, а более длинные продукты ПЦР могут быть менее эффективно денатурированы, чем более короткие продукты. 34 Важно отметить, что амплификация отдельных фрагментов плеча TALEN облегчает только характеристику массивов повторов TALE, выполненную ниже. Затем продукты ПЦР клонировали в линеаризованный ТА-вектор, и отдельные клоны E. coli со вставками отбирали для выделения плазмидной ДНК и расщепления RE с помощью EcoRI. Обнаружение ДНК-вставок размером 1,76 т.п.н. указывает на отсутствие значительного события делеции или добавления в ДНК-связывающих доменах TALEN (). Анализ ДНК-секвенирования дополнительно подтвердил правильность массивов повторов TALE RVD ().Эти результаты демонстрируют, что наш подход к клонированию TA/RE пищеварению обеспечивает надежный и быстрый способ охарактеризовать события перестройки в массивах повторов TALE.

Характеристика генетических реаранжировок массивов повторов TALE с использованием клонирования TA и расщепления RE

Затем с помощью вышеуказанного метода мы провели серию экспериментов для систематического исследования событий перестройки в массивах повторов TALE в образцах ДНК, используемых для создания рабочих бакуловирусных векторов. Эти образцы включают донорские плазмиды, содержащие гены TALEN, предназначенные для нацеливания на локус AAVS1 , составные бакмиды, которые создаются с донорскими плазмидами и могут использоваться в качестве бакуловирусных челночных векторов для продукции вируса после трансфекции в клетки насекомых-хозяев, пассаж 1 (P1 ) запасы вирусов, запасы вирусов P2 и запасы рабочих вирусов P3. В соответствии с протоколом для системы экспрессии бакуловирусов Bac-to-Bac, рекомендуемый MOI исходного штамма вируса P1, используемого для заражения клеток насекомых для создания штамма вируса P2, составляет 0,05 БОЕ на клетку. Для дальнейшей амплификации для получения вирусов P3 с высоким титром, обычно используемых для экспрессии белка, часто используется MOI 0,10 вирусного штамма P2. Чтобы определить влияние MOI, используемого для создания рабочих вирусов P3, на структурную целостность массивов повторов TALE, мы использовали различные количества вирусных запасов P2 для заражения клеток насекомых.Нам также было интересно узнать, есть ли разница в восприимчивости к генетической перестройке между BV-TALEN(LR), содержащим длинную повторяющуюся последовательность, и бакуловирусными векторами, содержащими короткую повторяющуюся последовательность только с одним плечом TALEN, BV-TALEN(L) и БВ-ТАЛЕН(R). Всего было проанализировано 613 образцов ДНК ().

Таблица 1

Таблица 1

Сводка использования повторных расщеплений и методов секвенирования ДНК для обнаружения перестановок сказки повторных массивов в плазмиду вектора, рекомбинантные Bacmid, а также 9079
A) Расщепление RE
№ клоны проанализированы № клоны Проанализированы No 5 0 5 0 5 10 5 0 5 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 0 5 10 0 0 1 N / A 5 0 1 R 1 R 5 19 5 2 + 32,0 + 0,025 5 9 5 33,3 +5 92,0 1 1 1

DNA
(B) секвенирование ДНК
Итого (A+B)
№Клоны проанализированы клонов с перестановками
клонов с перестановками
Образец TALEN конструкт b MOI б/у c % % %
L N / A 10 0 0 10 10 0 0 10 0 0
R N / A 10 0 0 0 10 0 0
LR N / A 20 0 20 20
Bacmid L L N / A 10 10 0 0 10 0 0 10 0 0
R N / A 10 0 0 0 10 0
LR
N / A 19 0 19 0 0 19 0 0
Итого 79 0 0 79 0 0 79 0 0
BV-P1 L Н/Д 17 3 17. 7 14 14 1 7.1 17 4
N / A 19 10.5 17 3 3 19 5 26,3
LR N / A 28 10 35,7 18 5 27,8 28 15 53,6
BV-Р2 Л 0. 05 33 6 18,2 27 2 7.4 33 8 24,2
R 0,05 25 3 12,0 22 6 27,3 25 9 36,0
LR 0. 05 25 12 48,0 13 6 46,2 25 18 72.0
Итого 147 36 24,5 111 23 20,7 147 59 40,1
BV-P3 л 0,005 25 25 3 12. 0 12.0 22 4 18.2 25 25 7 9 70013
0.025 24 2 24 5 20. 8 19 4 21,1 24 9 37,5
0,05 25 4 16,0 21 4 19,1 25 8
0,10 25 11 44,0 14 4 28,6 25 15 60,0
0,20 26 18 69. 2 8 3 37,5 26 21 80,8
R 0,005 22 3 13,6 19 4 21,1 22 7 31. 8
27 7 25,9 25.9 20 2 2 10 0 27
0.05 30 5 16,7 25 6 24,0 30 11 36,7
0,10 26 11 42,3 15 5 33. 3 26 26 16 61.5
0.2010
0.2010 24 15 62,5 9 9 9 4 44. 49 24 19 79.2
LR 0,005 31 10 32,3 21 7 33,3 31 17 54,8
0,025 24 6 25,0 18 9 9 50. 0 50.0 15 15
0,05 28 12 42,9 42.9 16 5 31.3 28 17 60,7
0,10 25 17 68,0 8 3 37,5 25 20 80,0
0,20 25 21 21 84. 0 4 2 2 50.0 25 23
387 148 38.2 2 239 239 66 27. 6 27.6 387 387 214 55.39
1

В продуктах ПЦР усиливаются с использованием донорских плазмид и композитных бакмидов в качестве шаблонов, мы не наблюдали каких-либо очевидных изменений в размере после переваривания ( ). Однако в продуктах ПЦР, амплифицированных из бакуловирусной геномной ДНК, часто наблюдались фрагменты размером менее 1,76 т.п.н., что указывает на крупную геномную делецию в массиве повторов TALE (,). Из 534 проанализированных отдельных клонов ТА 184 клона показали изменение размера ПЦР-вставки (34.5%), а частота изменения увеличивалась при серийном пассаже бакуловирусов от 23,4% в Р1 ( n = 64), 25,3% в Р2 ( n = 83), до 38,2% в Р3 ( n ). = 387) вирусные акции (, ). Собрав эти результаты вместе, мы можем сделать вывод, что события генетической перестройки в массивах повторов TALE происходили в основном во время размножения бакуловируса в клетках насекомых. Кроме того, мы обнаружили значительное увеличение количества клонов, демонстрирующих изменение размера, когда MOI вирусных запасов P2, используемых для создания вирусов P3, был увеличен с 0.005 до 0,2. Используя MOI 0,2, большинство сгенерированных вирусов (54 из 75 исследованных клонов) показали размер вставки ДНК менее 1,76 КБ (). В целом, использование низкого MOI до 0,05, по-видимому, приводит к меньшему количеству событий перестройки в протестированных вирусах (1). Между длинными и короткими повторяющимися последовательностями в вирусном геноме мы наблюдали выраженное увеличение крупных геномных делеций/добавлений в бакуловирусных векторах с длинной повторяющейся последовательностью, независимо от того, исследовались ли вирусные запасы P1, P2 или P3 (, ).Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что для сведения к минимуму крупных геномных делеций/добавлений массивов повторов TALE в бакуловирусных векторах левое и правое плечи TALEN должны быть клонированы отдельно в два разных вектора, а рабочие вирусы должны быть получены с использованием низкого MOI для заражения клеток насекомых.

События удаления или добавления в массивах повторов TALE, обнаруженные методом клонирования TA и переваривания RE. ( a ) Тестирование с использованием донорских плазмид, составных бакмид и бакуловирусной геномной ДНК, выделенной из штаммов вирусов P1 и P2.( b ) Тестирование с использованием бакуловирусной геномной ДНК, выделенной из рабочих вирусов P3, созданных с различными MOI исходных штаммов вируса P2. ДНК со слитой кассетой экспрессии, несущей как левое, так и правое плечо TALEN (L+R), левое (L) или правое (R) плечо TALEN, анализировали в a и b . Верхние полосы на каждой панели: линеаризованный вектор клонирования размером 3 т.п.н. Нижние полосы на каждой панели: ПЦР-вставки. Стрелки указывают на продукт ПЦР размером 1,76 т.п.н. Полосы размером меньше или больше 1,76 т.п.н. указывают на значительные события удаления или добавления соответственно.

Характеристика генетических мутаций массивов повторов TALE с использованием метода секвенирования ДНК

Генетическая перестройка в ДНК-связывающем домене TALE может не приводить к очевидным изменениям размера, но вызывает изменения в последовательности ДНК. Затем мы выполнили секвенирование ДНК ДНК-связывающих доменов TALE во всех клонах, которые несли ПЦР-вставку размером 1,76 т.п.н., как показано выше методом расщепления RE. В общей сложности 429 клонов были подвергнуты выделению ДНК и анализу последовательности, и в 89 из них были обнаружены генетические мутации ().И снова мы не наблюдали каких-либо изменений в продуктах ПЦР, амплифицированных с использованием донорных плазмид и композитных бакмид в качестве матриц, а генетические мутации были обнаружены только в продуктах ПЦР, амплифицированных из геномной ДНК бакуловируса.

Изменения в последовательностях ДНК массивов повторов TALE этих образцов включали делецию, добавление, замену и транслокацию. Делеция и добавление вызывали изменения количества RVD-содержащих повторяющихся единиц TALE, тогда как мутация замещения приводила к изменению кодона.Обмен цепями ДНК между левым и правым плечами TALEN приводил к транслокации части ДНК-связывающего домена TALE. Результаты, полученные для геномной ДНК, выделенной из вирусов P3, включая BV-TALEN(L), BV-TALEN(R) и BV-TALEN(L-R), показаны на рис. В этих образцах более 60% генетических мутаций были связаны с делецией, которая могла включать от 1 до 4 повторяющихся единиц, содержащих RVD (дополнительная таблица S2). Как и ожидалось, в BV-TALEN (LR) наблюдалась транслокация со снижением частоты рекомбинации внутри массива в левом или правом ДНК-связывающем домене TALE (дополнительная таблица S2).Помимо миссенс-мутаций, другие точечные мутации, связанные с изменениями нуклеотидной последовательности, включая сдвиг рамки считывания и нонсенс-мутации, обнаруживались, но с незначительной частотой. Выравнивание последовательности ДНК не выявило признаков молчащей мутации в массивах повторов, содержащих RVD. Изучая влияние MOI вирусных запасов, используемых для создания бакуловирусов, мы заметили, что более высокий MOI может увеличить частоту генетических мутаций, хотя и не вызывает явного изменения типа мутации (дополнительная таблица S3).

Типы мутаций в массивах повторов TALE, выявленных с помощью анализа последовательности ДНК. Клоны с ДНК-фрагментом ПЦР-вставки длиной 1,76 т.п.н., обнаруженным методом расщепления RE, подвергали анализу секвенирования ДНК. Были проанализированы образцы генома бакуловируса Р3 ( n = 239). Правильные массивы повторов TALE в левом и правом плечах TALEN перечислены вверху.

Характеристика генетических реаранжировок массивов повторов TALE с использованием Саузерн-блоттинга

Далее мы провели Саузерн-блот-анализ для изучения структурной целостности массивов повторов TALE в донорных плазмидах, составных бакмидах и бакуловирусном геноме.Плазмидную, бакмидную и вирусную геномную ДНК расщепляли NsiI и XbaI перед электрофорезом в агарозном геле. Вместо того, чтобы пытаться дифференцировать степень мутаций между левым и правым плечами TALEN, мы использовали эти два RE для определения общей структурной целостности двух плеч TALEN в экспрессионной кассете LR. Саузерн-зонд для блоттинга был разработан для связывания с областью FokI, расположенной ниже ДНК-связывающего домена TALE. Обнаружение одного фрагмента ДНК размером 2,4 т.п.н., несущего ДНК-связывающие домены FokI и TALE, в донорных плазмидах и составных бакмидах показало, что массивы повторов TALE остаются неизменными в этих образцах (1).При трансфекции клеток насекомых композитными бакмидами для получения инфекционного рекомбинантного бакуловируса в Саузерн-блотах для бакуловирусов раннего пассажа (P1) наблюдались «теневые» полосы, что указывает на возможные генетические перестройки в массивах повторов TALE. Эти события, по-видимому, увеличивались от P1 до P3, возможно, из-за накопления генетических перестроек при пассировании вируса. Затем мы исследовали геномную ДНК бакуловирусов позднего пассажа (P3), созданных с различными MOI вирусных штаммов P2, начиная с 0.005; С увеличением MOI вирусного запаса P2 полосы P3 BV-TALEN(LR) с интактным размером ДНК (2,4 kb) становились менее заметными, что указывает на исчезновение функциональных TALEN. Таким образом, наш Саузерн-блот-анализ, хотя и не может обеспечить количественную оценку, снова показывает, что низкая множественность заражения для получения бакуловирусных векторов только с одним плечом TALEN будет благоприятна для создания функциональных вирусных векторов TALEN.

Саузерн-блоттинг для изучения структурной целостности массивов повторов TALE. ( a ) Сайты связывания зонда, используемые для Саузерн-блоттинга. Используемый зонд амплифицировали из домена расщепления FokI в донорной плазмиде, несущей экспрессионную кассету слияния (TALEN L-R). ДНК, несущая кассету экспрессии TALEN, расщепляли NsiI и XbaI с образованием фрагментов ДНК размером 2,4  т.п.н., содержащих центральную матрицу повторов TALE и домен расщепления Fokl. ( b ) Структурная целостность массивов повторов TALE в донорских плазмидах, составных бакмидах и бакуловирусном геноме.Геномную ДНК рекомбинантного бакуловируса (gBV) выделяли после серийных пассажей (P1, P2 и P3). ( c ) Влияние MOI, используемого для заражения клеток насекомых, и длины тандемных повторов в конструкциях TALEN на структурную целостность. В качестве положительного контроля кассету экспрессии TALEN в донорном плазмидном векторе расщепляли BamHI и XbaI с образованием фрагмента ДНК, состоящего только из домена расщепления FokI (634 п. н.).

Оценка оптимальной системы BV-TALEN

Для оценки эффективности разрушения ДНК с помощью векторов BV-TALEN мы сконструировали репортерный вектор люциферазы, несущий целевой сайт AAVS1, и провели анализ одноцепочечного отжига () в клетках U87 человека.Когда использовали вирусы P3, генерированные с исходной множественностью заражения от 0,025 до 0,2 БОЕ на клетку насекомого, их эффективность разрушения ДНК снижалась с увеличением множественности заражения, используемой для генерации вируса, независимо от того, были ли клетки трансдуцированы с помощью BV-TALEN(LR) или котрансдуцированы с БВ-ТАЛЕН(L) и БВ-ТАЛЕН(R) (). Эти результаты согласуются с приведенными выше выводами о том, что вирусы, генерируемые с более высоким MOI, несут более неправильные последовательности связывания ДНК, поэтому они менее эффективны в расщеплении сайта-мишени.Аналогично, котрансдукция клеток U87 с BV-TALEN(L) и BV-TALEN(R) обеспечивала более сильную активность TALEN, чем трансдукция с BV-TALEN(L-R), генерируемая при той же множественности множественности (1). В соответствии с наблюдениями, что вирусы P2 несут менее функционально дефектные RVD-содержащие повторяющиеся единицы, чем вирусы P3 (), самая высокая активность TALEN была достигнута, когда клетки были котрансдуцированы двумя вирусами P2, BV-TALEN(L) и BV-TALEN( R), проявляя активность до 156% от той, которую обеспечивают два вируса Р3, сгенерированные с одинаковым MOI.Эти результаты подтверждают идею о том, что размещение двух ветвей TALEN в двух вирусных векторах, создание вирусов с низким MOI и использование небольшого числа пассажей рабочих вирусов может быть оптимальным протоколом для снижения нестабильности последовательности массива повторов TALE в бакуловирусном векторе. .

Количественная оценка эффективности расщепления TALEN с использованием анализа одноцепочечного отжига (SSA). ( a ) Схематическое представление анализа SSA, разработанного для количественной оценки эффективности расщепления TALEN в целевом сайте AAVS1 .Тестовый вектор AAVS1 SSA конструируют путем клонирования отожженных олигонуклеотидов, несущих целевой сайт AAVS1 , в вектор pGL4-SSA, обработанный BsaI, через их липкие концы. Индуцированный TALEN двухцепочечный разрыв (DSB) в сайте AAVS1 тестируемого вектора восстанавливается с помощью SSA с получением функционального репортерного вектора люциферазы. ( b ) Сравнение эффективности расщепления TALEN бакуловирусных векторов TALEN, полученных различными способами. Клетки U87 трансфицировали вектором AAVS1 SSA с последующей трансдукцией BV-TALEN при MOI 50.BV-TALEN (L-R): трансдукция вирусами, содержащими экспрессионную кассету, с левым и правым плечами TALEN. BV-TALEN (слева/справа): котрансдукция с двумя типами вирусов, несущими левое и правое плечи TALEN соответственно. Указаны вирусы P2 или P3, используемые для клеточной трансдукции, и начальный MOI, использованный для создания этих BV-TALEN (в скобках). Анализ активности люциферазы проводили через 48 часов после трансдукции, что прямо пропорционально эффективности расщепления, опосредованной TALEN. Представленные значения означают ± SD (n = 5).*, ***: p < 0,05 и p < 0,001 по сравнению с BV-TALEN(L-R) по критерию Стьюдента t . +++: p <0,001 между P2 BV-TALEN(L/R) и P3 BV-TALEN(L/R) по критерию Стьюдента. Фоновые показания для вектора AAVS1 SSA составили 291 027 ± 121 415.

Для изучения эффективности AAVS1 -направленной гомологичной рекомбинации, управляемой оптимальной системой BV-TALEN, вместе с P2 BV-TALEN(L) и P2 BV использовали донорный бакуловирусный вектор, содержащий репортер eGFP и гены устойчивости к неомицину. -TALEN (R) для котрансдукции в клетках U87 человека ().После селекции G418 в течение 20 дней большинство выживших клеток стали eGFP-позитивными (4). Эти клетки демонстрировали постоянную экспрессию eGFP в течение как минимум 3 месяцев (12). Проведено ПЦР-генотипирование геномной ДНК трансгенных клеток. Амплификация фрагмента размером 2,9 т.п.н. подтвердила успешную сайт-специфическую интеграцию донорской кассеты в локус AAVS1 , управляемую TALEN-опосредованной гомологичной рекомбинацией (4).

Стабильная экспрессия eGFP в клетках U87 человека после HR, опосредованного BV-TALEN (слева/справа). ( a ) Схематическая диаграмма, показывающая интеграцию локуса AAVS1 экспрессионной кассеты Neo-eGFP в ДНК-донор BV-eGFP после двухцепочечного разрыва ДНК (DSB), запускаемого парой BV-TALEN. HR(L) и HR(R): левое и правое плечи для гомологичной рекомбинации. FP и RP: сайты связывания для прямых и обратных праймеров ПЦР. ( b ) Экспрессия eGFP в клетках U87. После селекции G418 в течение 20 дней большинство клеток являются eGFP-позитивными. Показаны репрезентативные фазовые и флуоресцентные изображения, верхняя и нижняя панели соответственно.( c ) Анализ проточной цитометрии для определения процента eGFP-позитивных клеток через 3 месяца после трансдукции BV. Клетки поддерживали без G418. ( d ) Интеграция трансгена, специфичного для AAVS1. Геномную ДНК экстрагировали из исходных клеток U87 дикого типа (WT), клеток U87, трансдуцированных только BV-eGFP (донор), и клеток U87, котрансдуцированных BV-TALEN и BV-eGFP (TALEN+донор). ПЦР-анализ демонстрирует опосредованную котрансдукцией сайт-специфическую интеграцию кассеты eGFP размером 2,9 т.п.н. в локусе AAVS1 .

Обсуждение

Высоко повторяющиеся последовательности ДНК в массивах повторов TALE нестабильны и склонны к генетической рекомбинации. Даже в кольцевых плазмидных векторах сверхспиральный стресс может генерировать вторичные структуры, которые восприимчивы к вредным мутациям в клетках-хозяевах E. coli , особенно в областях, которые содержат многочисленные тандемные или палиндромные повторы. 37 Однако мы не обнаружили каких-либо генетических перестроек в массивах повторов TALE в образцах ДНК, выделенных из донорных плазмидных векторов, используемых для создания составных бакмид, включая донорную плазмиду, сконструированную для создания BV-TALEN(LR), которая содержит длинную повторяющуюся последовательность, что указывает на то, что одних только последовательностей массива повторов TALE недостаточно для стимулирования генетической перестройки в E. палочка .

Бакмиды бакуловирусных челночных векторов получают путем Tn7-опосредованной сайт-специфической транспозиции экспрессионной кассеты в донорской плазмиде в область генома бакуловируса в клетках E. coli . Геном бакуловируса также представляет собой суперскрученную кольцевую двухцепочечную ДНК. Подобно тому, что происходит в кольцевой плазмиде, деформация кручения, присущая геному бакуловируса, может вызывать локализованное плавление с образованием крестообразных и других вторичных структур, которые могут физически сближать два фрагмента ДНК, способствуя генетической рекомбинации или делеции повторяющихся последовательностей ДНК. 38 Приостановка репликации ДНК в этих вторичных структурах может способствовать переключению матрицы между прямыми повторами. Однако в очередной раз мы не обнаружили каких-либо генетических перестроек в массивах повторов TALE в образцах ДНК, выделенных из составных бакмид. Бакмиды содержат репликон mini-F и, таким образом, могут реплицироваться в E. coli с низким числом копий. 39 Кроме того, клетки E. coli , использованные для получения составной бакмиды, представляли собой компетентные клетки Dh20Bac, представляющие собой мутантный штамм RecA с дефицитом рекомбинации.Эти две особенности, обеспечиваемые бакмидами и Dh20Bac, могут играть важную роль в поддержании генетической стабильности массивов повторов TALE в составных бакмидах.

С другой стороны, мы обнаружили генетическую перестройку в вирусах P1, генерируемых в клетках насекомых, и наблюдали повышенную частоту мутаций при серийном пассаже бакуловирусов, а также при использовании более высокого MOI штаммов вируса P2 для получения вирусов P3. Взятые вместе с приведенными выше наблюдениями, эти результаты заставляют нас предположить, что наблюдаемые генетические перестройки в протестированных массивах повторов TALE, возможно, связаны с экспрессией вирусных генов в клетках насекомых-хозяев.Гомологическая рекомбинация (HR) между бакуловирусами часто наблюдается во время репликации вирусной ДНК в клетках насекомых-хозяев, что подчеркивает параллелизм этих двух механизмов. 40–42 Обнаруженные бакуловирусные рекомбинанты кумулятивно генерируются в течение нескольких циклов репликации ДНК за один пассаж. 43 В вирусе множественного ядерного полиэдроза (AcMNPV) Autographa californica вирусные гены, необходимые для эффективного HR, включают ie-1 , ie-2 , lef-7 и p95, with ie-1 и ie-2 достаточно для стимулирования HR в отсутствие других вирусных генов.Кроме того, в отсутствие генов AcMNPV клеточный механизм неспособен обеспечивать высокие уровни ЧСС. 42 Можно предположить, что после того, как массивы повторов TALE, проанализированные в этом исследовании, будут вставлены в бакмиды и трансдуцированы в клетки насекомых, экспрессия вышеуказанных генов AcMNPV из составных бакмид и вновь созданных бакуловирусов будет стимулировать HR между этими структурами, как они это делают. для HR между двумя геномами бакуловируса, вызывая генетическую перестройку. Кроме того, во время ДНК-репликации тандемных повторов проскальзывающее несоответствие между зарождающейся нитью и другой нитью-матрицей гомологии может привести к делециям, 44 , которые могут способствовать делециям, наблюдаемым в этом исследовании. Естественно, количество циклов вирусной репликации, которым подвергается вирус до сбора, будет играть большую роль в увеличении нестабильности последовательности экспрессионных кассет TALEN в геноме вируса.

Чтобы свести к минимуму вредные мутации в ДНК-связывающих доменах TALE в бакуловирусных векторах, рекомендуется использовать низкий MOI для продукции вируса, что может помочь сохранить генетическую целостность вирусов и предотвратить накопление дефектных интерферирующих частиц (DIP). 45,46 DIP являются вирусоподобными побочными продуктами инфекции с частичными геномами, упакованными путем комплементации из интактных геномов, коинфицированных в той же клетке. DIP, как правило, возникают и разрастаются во время инфекции с высоким MOI, когда несколько копий вирусных частиц заражают каждую клетку-хозяина. Делеции генома в DIP могут происходить между массивами тандемных повторов TALE и/или удаленными областями гомологичных повторов в бакуловирусном геноме. DIP имеют более короткий размер генома, что делает их репликацию более быстрой, чем у интактных вирусов. При низком MOI вероятность того, что интактный вирус и DIP заразят одну и ту же клетку, низка. Кроме того, выход вируса снижается быстрее для пассажей, выполненных с более высоким MOI, как и предсказывает математическая модель, основанная на поведении клеток, коинфицированных вирусом и DIP, при однократном пассаже. 46 Следовательно, низкий MOI, используемый во время первоначального заражения в культуре клеток насекомых, приведет к очищающей селекции против мутантов бакуловируса с делецией.

Мы заметили повышенную генетическую перестройку в массивах повторов TALE в бакуловирусных векторах с левым и правым плечами TALEN в одной экспрессионной кассете по сравнению с вирусами, содержащими только одно плечо.Из-за стресса сверхспирализации в кольцевом бакуловирусном геноме длинный массив тандемных повторов может увеличивать нестабильность ДНК и индуцировать крестообразные или шпилькообразные вторичные структуры, вызывающие перестройку. Как показано на примере бактериофага Т7, частота делеций ДНК-вставок с более длинными прямыми повторами возрастает экспоненциально по мере увеличения длины повторов. 38 Как и ожидалось, два бакуловирусных вектора с короткой повторяющейся последовательностью, BV-TALEN(L) и BV-TALEN(R), демонстрируют аналогичную тенденцию к генетической перестройке, демонстрируя, что композиция или комбинация RVD, которые вносят лишь незначительный вклад изменение общей последовательности повторяющегося массива в СКАЗКЕ может иметь небольшое влияние на определение частоты событий перестановки.Фактически, генетическая перестройка массивов повторов TALE в основном была связана с высококонсервативными массивами модульных повторяющихся единиц, независимо от нуклеотидных последовательностей, кодирующих две вариабельные аминокислоты каждого RVD. Несмотря на значительное нарушение структурной целостности в массивах повторов TALE в бакуловирусных векторах, высокая эффективность нацеливания все еще может быть достигнута с оставшимися интактными TALEN, как показано в нашем предыдущем исследовании. 28 Таким образом, бакуловирусные векторы с мутированными массивами повторов TALE, скорее всего, будут функционально дефектными при целенаправленном редактировании генома. Анализ кристаллической структуры показал, что единичное несоответствие между RVD и целевой базой приводит к увеличению расстояния от RVD до базы. 20 Функционально предыдущее исследование также показало, что TALE с меньшим количеством повторов в значительной степени неактивны, поскольку для распознавания коробки ДНК-мишени и эффективного функционирования требуется минимальное количество мономеров TALE. 47

Чтобы повысить эффективность бакуловирусной системы TALEN, мы оптимизировали протокол генерации вируса в текущем исследовании, чтобы свести к минимуму генетические перестройки в ДНК-связывающих доменах TALE путем клонирования левого и правого плеч TALEN по отдельности в два разных вектора и с использованием вирусов P2, продуцируемых с низким MOI.Поскольку бакуловирусы эффективны в трансдукции различных типов клеток человека, включая плюрипотентные стволовые клетки человека, 32 наш простой метод должен оказаться полезным инструментом для облегчения целенаправленного редактирования генома в этих клетках. В качестве альтернативы можно использовать сложные способы, такие как создание архитектуры гибридных ДНК-связывающих доменов с минимальным количеством тандемных повторов, чтобы обойти проблему нестабильности последовательностей, вызванную длинными повторяющимися массивами массива повторов TALE, и для их правильной упаковки в вирусные векторы.Например, использование пары гибридных нуклеаз, объединяющих два различных ДНК-связывающих домена на основе платформ ZFN и TALEN, соответственно, может уменьшить количество повторяющихся единиц TALE вдвое. 48 Недавно была разработана архитектура одноцепочечной нуклеазы, обозначенная как megaTAL, которая создается путем слияния ДНК-связывающего домена TALE с доменом расщепления мегануклеазой и обеспечивает высокую эффективность с идеальной геномной специфичностью. 49 Поскольку используется только один единственный TALE, можно ожидать низкой частоты генетической перестройки, когда megaTAL упакованы в бакуловирусные векторы.В будущем успехи в производстве вирусных векторов для доставки генов TALEN будут полезны для эффективного целенаправленного редактирования генома в различных типах клеток человека.

Бакуловирусные векторы, полученные из вирусов насекомых, обладают присущими клеткам человека иммуностимулирующими способностями и могут опосредовать значительные врожденные иммунные реакции. 32,50,51 В то время как врожденные иммунные реакции могут ослаблять экспрессию трансгена в клетках млекопитающих, 52 эта способность делает бакуловирусные векторы многообещающими адъювантными кандидатами для вакцинации.Бакуловирусные векторы также могут индуцировать адаптивные иммунные ответы у мышей, что может влиять на экспрессию трансгена in vivo . 53 Однако, поскольку бакуловирусы не являются инфекционными для клеток человека, ранее существовавшие бакуловирус-специфические антитела и Т-клетки не обнаруживаются у людей, 53 , что позволяет обойти проблему существовавшего ранее иммунитета, с которой сталкиваются векторы, полученные из вирусов человека, такие как аденовирус и аденовирус. -ассоциированные вирусы. Также бакуловирусная трансдукция в некоторых типах клеток, например мезенхимальных стволовых клетках, не вызывает системной индукции иммунных клеток. 54 Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования дизайна и разработки бакуловирусных векторов с минимальной иммуностимулирующей активностью.

Материалы и методы

Рекомбинантные бакуловирусные векторы

Левая и правая экспрессионные плазмиды TALEN были сконструированы с использованием специального сервиса TALEN, предоставленного Cellectis Bioresearch (Париж, Франция). Последовательности, кодирующие TALEN, субклонировали в донорную плазмиду pFastBac1 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) для получения pFB-TALEN(LR), который содержит как левое, так и правое плечо TALEN, слитые элементом внутреннего сайта посадки рибосомы (IRES), как описано ранее. 28 Также были сконструированы два вектора pFastBac1, содержащие соответственно левое и правое плечи TALEN (дополнительный рисунок S1 и данные последовательности S1 – S3). Рекомбинантные бакуловирусы, включая BV-TALEN(L), BV-TALEN(R), BV-TALEN(LR) и BV-eGFP, были созданы с использованием pFB-TALEN(L), pFB-TALEN(R), pFB-TALEN (LR) и pFB-eGFP, соответственно, и размножали в клетках насекомых Sf9 в соответствии с протоколом системы экспрессии бакуловирусов Bac-to-Bac от Invitrogen. Исследования рекомбинантной ДНК в этом исследовании проводились в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения.

ПЦР-амплификация, клонирование ТА, расщепление рестрикционными ферментами и секвенирование ДНК

ДНК вириона выделяли с использованием набора High Pure Viral Nucleic Acid (Roche Applied Science). Очищенный вирусный геном использовали в качестве матрицы ДНК для ПЦР-амплификации. Смесь ферментов, содержащую Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) и элонгазу (Invitrogen), использовали для амплификации ДНК-связывающих доменов TALE полной длины. Оптимизированный реакционный буфер состоял из 1 мкл матрицы ДНК с концентрацией 200 нг/мкл, 20 мкл мастер-микса Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity, 1 мкл смеси ферментов элонгазы, 0.5 мкл на 10 мкмоль/л каждого прямого и обратного праймера и 2 мкл ДМСО. Оптимальная программа термоциклера для двухстадийной ПЦР была установлена ​​следующим образом: начальная стадия денатурации при 94°С в течение 5 минут, затем 35 циклов при 94°С в течение 20 секунд и 72°С в течение 120 секунд с конечной стадией удлинения при 72°С в течение 10 минут. Амплифицированные продукты анализировали на 1% агарозном геле. Праймеры, используемые для амплификации полноразмерных массивов повторов TALE, перечислены в дополнительной таблице S1.

Продукты ПЦР, несущие массив повторов TALE, затем клонировали в pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI).Белые колонии E. coli, содержащие интересующие продукты ПЦР, отбирали для экстракции плазмид (набор GeneJET Plasmid Miniprep, Fermentas) и подтверждали расщеплением рестрикционным ферментом (RE) EcoRI. Поскольку сайты EcoRI граничат с обоими концами клонированных фрагментов, расщепление EcoRI высвобождает клонированный фрагмент, содержащий массив повторов TALEN размером 1,76 т.п.н. и вектор pGEM-T Easy Vector размером 3 т.п.н. После расщепления RE размер фрагментов ДНК анализировали на 1% агарозном геле. Клоны с ДНК-вставкой правильного размера отбирали для секвенирования ДНК с использованием прямого и обратного универсальных праймеров М13.

Саузерн-блот-анализ

Для Саузерн-блоттинга плазмидную, бакмидную и вирусную геномную ДНК (1 мкг) расщепляли в течение ночи с помощью NsiI и XbaI. Расщепленную ДНК загружали в 2% агарозный гель и проводили электрофорез в течение 8 часов при 25 В. Затем с помощью системы сухого блоттинга iBlot (Invitrogen) ДНК переносили в набор для переноса ДНК iBlot (Invitrogen), содержащий положительно заряженный нейлоновая мембрана. Мембрану инкубировали в денатурирующем растворе 1,5 моль/л NaCl/0,5 моль/л NaOH в течение 10 минут сразу после переноса и сушили на воздухе.После перекрестного сшивания УФ-излучением при 130 мДж/см 2 мембрану гибридизовали в течение ночи с DIG Easy Hyb (Roche, Индианаполис, Индиана). Зонды, меченные DIG, нацеленные на область FokI кассеты экспрессии TALEN, были синтезированы с использованием набора PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche). После гибридизации мембрану тщательно промывали, блокировали, а затем инкубировали с конъюгатом анти-дигоксигенин-AP (набор для мечения и обнаружения ДНК DIG, Roche), который обнаруживали с помощью CDP-Star, готовый к использованию (Roche).Несущая мембрану ДНК подвергалась воздействию хемилюминесцентного анализатора изображений (ImageQuant LAS 4000 mini, GE Healthcare Biosciences, Питтсбург, Пенсильвания) в течение 15 минут. Праймеры, используемые для синтеза меченых DIG зондов, перечислены в дополнительной таблице S1.

Анализ одноцепочечного отжига

Тестовый вектор для анализа SSA был сконструирован путем вставки отожженных олигонуклеотидов, несущих целевую последовательность AAVS1 TALEN, в репортерный вектор люциферазы светлячка pGL4-SSA, обработанный BsaI (Addgene). Дизайн пользовательских олигонуклеотидов был описан ранее. 55 Вкратце, клетки U87 высевали в 96-луночный планшет при плотности 2000 клеток/лунку за день до плазмидной трансфекции. Сконструированный вектор для анализа одноцепочечного отжига (SSA) затем трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в клетки U87, культивированные в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (с высоким содержанием глюкозы) с 10% фетальной бычьей сывороткой (Invitrogen). Через четыре часа после трансфекции клетки трансдуцировали бакуловирусами, экспрессирующими TALEN, при множественности заражения (MOI) 50 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на клетку. Через 48 часов использовали систему анализа люциферазы ONE-Glo (Promega) для количественного определения полученных люминесцентных сигналов.

Гомологическая рекомбинация, опосредованная TALEN

Для направленной трансгенной интеграции клеток U87 2 × 10 4 клеток, высеянных на шестилуночный планшет, котрансдуцировали с BV-TALEN(L), BV-TALEN(R) и BV -eGFP (в качестве донорской матрицы) при MOI 100 в бессывороточной среде DMEM в течение 4 часов. Вирусы очищали и ресуспендировали в PBS для трансдукции клеток. Вкратце, среду клеток насекомых, содержащую вирусы, переносили в стерильные пробирки.Пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут для удаления клеток и крупного мусора. Затем супернатант вируса фильтровали через 0,2 мкм фильтр с низким связыванием белка. За сутки до трансдукции клеток отфильтрованный рабочий исходный вирус центрифугировали при 28000 g (4°С) в течение 1 часа 30 минут. Супернатант удаляли после высокоскоростного центрифугирования, а осадок вирусных частиц ресуспендировали в PBS. Селекцию G418 в концентрации 400 мг/мл начинали на 3-й день после трансдукции, и среду меняли каждые 2 дня в течение 20 дней.Для ПЦР-генотипирования для проверки специфической интеграции сайта AAVS1, управляемой системой BV-TALEN, геномную ДНК клеток U87 выделяли с использованием набора DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany). ПЦР-амплификацию проводили с использованием следующих параметров: начальная стадия денатурации при 94°С в течение 5 минут, затем 35 циклов при 94°С в течение 15 секунд, 65°С в течение 45 секунд и 72°С в течение 150 секунд с окончательным удлинением. шаг при 72 ° C в течение 10 минут.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным советом по медицинским исследованиям Министерства здравоохранения Сингапура (NMRC/CIRG/1367/2013), (NMRC/1284/2011), Министерством образования Сингапура (MOE2011-T2-1–056). ), и Институт биоинженерии и нанотехнологий (Совет по биомедицинским исследованиям, Агентство по науке, технологиям и исследованиям, Сингапур). Финансирование платы за открытый доступ: (NMRC/CIRG/1367/2013).

Примечания

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки

  • Урнов Ф.Д., Миллер Дж.С., Ли Ю.Л., Босежур С.М., Рок Дж.М., Огастус С. Высокоэффективная коррекция эндогенных генов человека с использованием разработанных нуклеаз с цинковыми пальцами. Природа. 2005; 435: 646–651. [PubMed] [Google Scholar]
  • Хоккейер Д., Солднер Ф., Бирд С., Гао К., Миталипова М., ДеКелвер Р.С. Эффективное нацеливание на экспрессированные и молчащие гены в ЭСК и ИПСК человека с использованием нуклеаз с цинковыми пальцами.Нац биотехнолог. 2009; 27: 851–857. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Bedell VM, Wang Y, Campbell JM, Poshusta TL, Starker CG, Krug RG., 2nd Редактирование генома in vivo с использованием высокоэффективной системы TALEN. Природа. 2012; 491:114–118. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Kim Y, Kweon J, Kim A, Chon JK, Yoo JY, Kim HJ. Библиотека эффекторных нуклеаз TAL, охватывающая геном человека. Нац биотехнолог. 2013; 31: 251–258. [PubMed] [Google Scholar]
  • Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE.Инженерия генома человека с помощью РНК с помощью Cas9. Наука. 2013; 339: 823–826. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N. Мультиплексная инженерия генома с использованием систем CRISPR/Cas. Наука. 2013; 339:819–823. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Ли Л., Крымская Л., Ван Дж., Хенли Дж., Рао А., Цао Л.Ф. Геномное редактирование корецептора ВИЧ-1 CCR5 во взрослых гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках с использованием нуклеаз цинковых пальцев. Мол Тер.2013;21:1259–1269. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Майер Д.А., Бреннан А.Л., Цзян С., Биндер-Шолль Г.К., Ли Г., Плеса Г. Эффективная модификация генов клинического масштаба с помощью нуклеазы цинковых пальцев, нацеленной на разрушение вируса ВИЧ. -рецептор CCR5. Гул Джин Тер. 2013; 24: 245–258. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Гендель Э.М., Геллхаус К., Хан К., Беднарски С., Корню Т.И., Мюллер-Лерх Ф. Универсальное и эффективное редактирование генома в клетках человека путем сочетания нуклеаз цинковых пальцев с адено -ассоциированные вирусные векторы.Гул Джин Тер. 2012; 23:321–329. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Lei Y, Lee CL, Joo KI, Zarzar J, Liu Y, Dai B. Редактирование генов эмбриональных стволовых клеток человека с помощью сконструированного бакуловирусного вектора, несущего нуклеазы с цинковыми пальцами. Мол Тер. 2011;19:942–950. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Tay FC, Tan WK, Goh SL, Ramachandra CJ, Lau CH, Zhu H. Нацеленная вставка трансгена в локус AAVS1, управляемая экспрессией нуклеазы цинкового пальца, опосредованной бакуловирусным вектором, в индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки.Дж Джин Мед. 2013; 15: 384–395. [PubMed] [Google Scholar]
  • Phang RZ, Tay FC, Goh SL, Lau CH, Zhu H, Tan WK. Бакуловирусные векторы, экспрессирующие нуклеазу цинковых пальцев, опосредуют целевую геномную интеграцию генов факторов репрограммирования, чтобы облегчить создание индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Стволовые клетки Transl Med. 2013;2:935–945. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Joglekar AV, Hollis RP, Kuftinec G, Senadheera S, Chan R, Kohn DB. Интегразо-дефектные лентивирусные векторы в качестве платформы доставки для направленной модификации локуса аденозиндезаминазы.Мол Тер. 2013;21:1705–1717. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Lombardo A, Genovese P, Beausejour CM, Colleoni S, Lee YL, Kim KA. Редактирование генов в стволовых клетках человека с использованием нуклеаз цинковых пальцев и доставки лентивирусного вектора, дефектного по интегразе. Нац биотехнолог. 2007; 25:1298–1306. [PubMed] [Google Scholar]
  • Малина А., Миллс Дж. Р., Сенчич Р., Ян И., Фрейзер Дж., Шипперс Л.М. Перепрофилирование CRISPR/Cas9 для функциональных анализов in situ. Гены Дев. 2013;27:2602–2614. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Koike-Yusa H, Li Y, Tan EP, Velasco-Herrera Mdel C, Yusa K.Полногеномный рецессивный генетический скрининг в клетках млекопитающих с использованием лентивирусной библиотеки РНК CRISPR-guide. Нац биотехнолог. 2014; 32: 267–273. [PubMed] [Google Scholar]
  • Шалем О., Санджана Н.Е., Хартениан Э., Ши Х., Скотт Д.А., Миккельсен Т.С. Скрининг нокаута CRISPR-Cas9 в масштабе генома в клетках человека. Наука. 2014; 343:84–87. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES. Генетические скрининги в клетках человека с использованием системы CRISPR-Cas9. Наука. 2014; 343:80–84.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Miller JC, Tan S, Qiao G, Barlow KA, Wang J, Xia DF. Нуклеазная архитектура TALE для эффективного редактирования генома. Нац биотехнолог. 2011; 29: 143–148. [PubMed] [Google Scholar]
  • Мак А.Н., Брэдли П., Сернадас Р. А., Богданов А.Дж., Стоддард Б.Л. Кристаллическая структура эффектора TAL PthXo1, связанного со своей ДНК-мишенью. Наука. 2012; 335:716–719. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Deng D, Yan C, Pan X, Mahfouz M, Wang J, Zhu JK.Структурная основа последовательности-специфического распознавания ДНК эффекторами TAL. Наука. 2012; 335:720–723. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Bergmann T, Schulz E, Ehrhardt A. Прогресс и проблемы с вирусными векторами для доставки Talens. Дж. Мол Жене Мед. 2014; 8:096. [Google Scholar]
  • Holkers M, Maggio I, Liu J, Janssen JM, Miselli F, Mussolino C. Дифференциальная целостность генов нуклеаз TALE после переноса генов аденовирусных и лентивирусных векторов в клетки человека.Нуклеиновые Кислоты Res. 2013;41:e63. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Holkers M, Catomen T, Goncalves MA. Конструирование и характеристика аденовирусных векторов для доставки TALEN в клетки человека. Методы. 2014;69:179–187. [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhang Z, Zhang S, Huang X, Orwig KE, Sheng Y. Быстрая сборка индивидуальных TALEN в несколько систем доставки. ПЛОС ОДИН. 2013;8:e80281. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Yang L, Guell M, Byrne S, Yang JL, De Los Angeles A, Mali P.Оптимизация бесрубцового редактирования генома стволовых клеток человека. Нуклеиновые Кислоты Res. 2013;41:9049–9061. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L. Оптический контроль эндогенной транскрипции млекопитающих и эпигенетических состояний. Природа. 2013; 500:472–476. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Zhu H, Lau CH, Goh SL, Liang Q, Chen C, Du S. Бакуловирусная трансдукция облегчает опосредованную TALEN целевую интеграцию трансгенов и обмен кассетами Cre/LoxP у человека. индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.Нуклеиновые Кислоты Res. 2013;41:e180. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Ramachandra CJ, Shahbazi M, Kwang TW, Choudhury Y, Bak XY, ​​Yang J. Эффективная опосредованная рекомбиназой замена кассет в локусе AAVS1 в эмбриональных стволовых клетках человека с использованием бакуловирусных векторов . Нуклеиновые Кислоты Res. 2011;39:e107. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Zeng J, Du J, Zhao Y, Palanisamy N, Wang S. Временная и стабильная экспрессия трансгена, опосредованная бакуловирусным вектором, в эмбриональных стволовых клетках человека.Стволовые клетки. 2007; 25:1055–1061. [PubMed] [Google Scholar]
  • Chen GY, Hwang SM, Su HJ, Kuo CY, Luo WY, Lo KW. Дефектные противовирусные ответы индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на трансдукцию бакуловирусного вектора. Дж Вирол. 2012; 86: 8041–8049. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Airenne KJ, Hu YC, Kost TA, Smith RH, Kotin RM, Ono C. Бакуловирус: полученный из насекомых вектор для различных приложений переноса генов. Мол Тер. 2013;21:739–749. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Zeng J, Du J, Lin J, Bak XY, ​​Wu C, Wang S. Высокоэффективная транзиентная трансдукция нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, бакуловирусными векторами. Мол Тер. 2009;17:1585–1593. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Уолш П.С., Эрлих Х.А., Хигучи Р. Предпочтительная ПЦР-амплификация аллелей: механизмы и решения. Прил. методы ПЦР. 1992; 1: 241–250. [PubMed] [Google Scholar]
  • Олейничак М., Кржизосяк В.Дж. Генотипирование простых повторов последовательностей – пересмотр факторов, причастных к генерации теневых полос. Электрофорез.2006; 27:3724–3734. [PubMed] [Google Scholar]
  • Viguera E, Canceill D, Ehrlich SD. Проскальзывание репликации in vitro ДНК-полимеразами термофильных организмов. Дж Мол Биол. 2001; 312: 323–333. [PubMed] [Google Scholar]
  • Godiska R, Mead D, Dhodda V, Wu C, Hochstein R, Karsi A. Линейный плазмидный вектор для клонирования повторяющихся или нестабильных последовательностей в Escherichia coli. Нуклеиновые Кислоты Res. 2010;38:e88. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Pierce JC, Kong D, Masker W.Влияние длины прямых повторов и наличия палиндромов на делецию между непосредственно повторяющимися последовательностями ДНК у бактериофага Т7. Нуклеиновые Кислоты Res. 1991;19:3901–3905. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Луков В.А., Ли С.К., Барри Г.Ф., Олинс П.О. Эффективное создание инфекционных рекомбинантных бакуловирусов путем сайт-специфической транспозон-опосредованной вставки чужеродных генов в геном бакуловируса, размножаемого в Escherichia coli. Дж Вирол. 1993; 67: 4566–4579. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Martin DW, Weber PC.Репликация ДНК способствует высокочастотной гомологичной рекомбинации при инфицировании вирусом множественного ядерного полиэдроза Autographa californica. Вирусология. 1997; 232:300–309. [PubMed] [Google Scholar]
  • Камита С.Г., Маэда С., Гамак Б.Д. Высокочастотная гомологичная рекомбинация между бакуловирусами включает репликацию ДНК. Дж Вирол. 2003;77:13053–13061. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Крауч Э.А., Пассарелли А.Л. Генетические требования к гомологичной рекомбинации в нуклеополиэдровирусе Autographa californica.Дж Вирол. 2002;76:9323–9334. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Hajós JP, Pijnenburg J, Usmany M, Zuidema D, Závodszky P, Vlak JM. Высокочастотная рекомбинация между гомологичными бакуловирусами в культуре клеток. Арх Вирол. 2000; 145:159–164. [PubMed] [Google Scholar]
  • Фещенко В.В., Ловетт СТ. Механизмы формирования делеции со скольжением: анализ конечных точек делеции. Дж Мол Биол. 1998; 276: 559–569. [PubMed] [Google Scholar]
  • Giri L, Feiss MG, Bonning BC, Murhammer DW.Производство дефектных бакуловирусных мешающих частиц во время серийного пассажа задерживается за счет удаления сайтов-мишеней транспозона в fp25k. Джей Ген Вирол. 2012; 93 Пт. 2: 389–399. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Томпсон К. А., Инь Дж. Динамика популяции РНК-вируса и его дефектных мешающих частиц в пассажных культурах. Вирол Дж. 2010; 7:257. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Boch J, Scholze H, Schornack S, Landgraf A, Hahn S, Kay S. Нарушение кода специфичности связывания ДНК эффекторов TAL-типа III.Наука. 2009; 326:1509–1512. [PubMed] [Google Scholar]
  • Yan W, Smith C, Cheng L. Расширение активности димерных нуклеаз путем объединения ZFN и TALEN для редактирования генома. Научный доклад 2013; 3: 2376. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Boissel S, Jarjour J, Astrakhan A, Adey A, Gouble A, Duchateau P. megaTALs: редко расщепляющая нуклеазная архитектура для терапевтической инженерии генома. Нуклеиновые Кислоты Res. 2014;42:2591–2601. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Abe T, Matsuura Y.Врожденные иммунные ответы хозяина, индуцированные бакуловирусом у млекопитающих. Карр Джин Тер. 2010;10:226–231. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ван С. , Баласундарам Г. Потенциальная генная терапия рака путем бакуловирусной трансдукции. Карр Джин Тер. 2010;10:214–225. [PubMed] [Google Scholar]
  • Ono C, Ninomiya A, Yamamoto S, Abe T, Wen X, Fukuhara T. Врожденный иммунный ответ, индуцированный бакуловирусом, ослабляет экспрессию трансгена в клетках млекопитающих. Дж Вирол. 2014;88:2157–2167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Luo WY, Lin SY, Lo KW, Lu CH, Hung CL, Chen CY.Адаптивный иммунный ответ, вызванный бакуловирусом, и влияние на последующую экспрессию трансгена in vivo. Дж Вирол. 2013; 87: 4965–4973. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Chuang CK, Wong TH, Hwang SM, Chang YH, Chen GY, Chiu YC. Бакуловирусная трансдукция мезенхимальных стволовых клеток: ответов in vitro и иммунных ответов in vivo после трансплантации клеток. Мол Тер. 2009; 17: 889–896. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Sakuma T, Hosoi S, Woltjen K, Suzuki K, Kashiwagi K, Wada H. Эффективные методы конструирования и оценки TALEN для клеток человека и животных. Клетки генов. 2013;18:315–326. [PubMed] [Google Scholar]

О Робе Ван Даме и RVDCBD

С 2019 года RVDCBD поставляет продукты CBD, курируемые основателем Робом Ван Дамом.

Познакомьтесь с Робом Ван Дамом, основателем RVDCBD

Роб Ван Дам — борец Зала славы ECW 2021 года. Он начал со скромных корней в Мичигане и быстро вырос до профессионального борца, которого мы все знаем, благодаря его высоким акробатам и необычному стилю кикбоксинга.Роб, также известный как «The Whole Fucking Show», «Мистер Понедельник Ночь» и «Мистер 420», завоевал бесконечное количество чемпионских титулов: 90 016.

«Знаете, некоторые люди берут душевный покой и путают его с отсутствием страсти». ~ Роб Ван Дам

Роб Ван Дам является органом CBD

Ван Дам на протяжении всей своей карьеры открыто выступал за использование каннабиса в медицинских целях. Он включил намеки на 4/20 и культуру каннабиса в свой борцовский образ. Он использовал такие лозунги, как «RVD 420» (что означает «я только что выкурил твою задницу») и продемонстрировал свою страсть к нескольким лекарственным свойствам растения в бесчисленных интервью.Некоторые фанаты, однако, спутали его расслабленность в конфронтациях с отсутствием страсти. Однако пропаганду Ван Дамом лекарств и культуры на основе каннабиса нельзя спутать. Он всегда был и всегда будет пропагандистом CBD.

Молодой Роб

Люди знают Роба за его профессиональный рестлинг и харизматичный, непринужденный характер в кругу и за его пределами. Чего они могут не знать, так это стороны Роба, посвященной здоровью и хорошему самочувствию. Еще в старших классах эта забота о нездоровых привычках руководила его жизнью.Он присоединился к борцовской команде в надежде стать профессионалом. Однако тренер хотел, чтобы он сбросил тридцать фунтов, чтобы соответствовать весовой категории. Роб сказал: «Я весил 165 фунтов. Тренер сказал мне сбросить 30 фунтов. Я хотел быть 235 фунтов. Я хотел полностью раскрыть свой потенциал и не останавливать свой рост в те годы, когда я все еще рос».

нд Роб Ван Дам через wrestletalk.com

Фанат

«На физическом уровне первое, что он сделал, — это предотвращение стресса. Употребляя каннабис, я [не стал] жертвой [повреждающего воздействия] стресса.Из-за этого я чувствую, что нахожусь в своей лучшей форме». Профессиональный спорт – это стресс, и Роб всегда хотел быть на высоте для своих болельщиков. «Когда я появляюсь, есть фанаты, которые купили билеты, чтобы увидеть меня несколько месяцев назад… Я [всегда] хотел подарить им RVD, который они ожидали увидеть». Однако не только стресс сказался на Робе. Три десятилетия того, как он был одним из самых акробатических и высоколетящих исполнителей в профессиональном рестлинге, сопровождались несколькими травмами и длительными недугами.

«Как профессиональный борец я получил более 500 сотрясений мозга.Никто из нас не понимал последствий сотрясения мозга, пока мы не узнали об этом». Headstrong , документальный фильм 2019 года о стендап-комедии Ван Дама, продемонстрировал борьбу Роба с длительным сотрясением мозга (особенно в 2016 и 2017 годах). Проблемы со здоровьем, прервавшие его стендап-комедию, вызвали обеспокоенность. Возможно, у него развилась хроническая травматическая энцефалопатия (ХТЭ). Энцефалопатия (ХТЭ).

Почему стоит RVDCBD

Во второй половине карьеры Роба Ван Дама в борьбе ему прописали опиаты, чтобы справиться с болью.Он жил от таблеток до актуальных, чтобы он мог выступать. Роб никогда не любил принимать таблетки. Он хотел что-то нетоксичное и исцеляющее, а не просто пластырь. Однако КБР был объявлен вне закона. Роб сказал: «Я хотел изучить продукты CBD и, в частности, что-то для мозга. Хотя у меня нет ХТЭ, я устал от того, что мои друзья убивают себя депрессией… из-за нескольких сотрясений мозга. … Я хотел сделать что-то, что помогло бы всем нам».

После законопроекта о фермах 2018 года Ван Дам решил совместить свой интерес к борьбе с сотрясением мозга, хроническими заболеваниями, стрессом и беспокойством с растением, которое спасло ему жизнь. Создав RVDCBD с командой партнеров, Ван Дам мог напрямую предоставить потенциальное лекарство не только суперзвездам и выпускникам рестлинга, но и самим преданным фанатам.

И вот так RVDCBD стал официальным номером

Как только он принял решение двигаться вперед, все стало на Роба Ван Дама и RVDCBD. Роб начал свою первоклассную игру с единственной целью; производить и распространять продукты CBD высочайшего качества. Линия CBD для всех, в том числе достаточно сильная для него.И если он не поместит его в свое тело, он не попросит вас положить его в свое!

RVDCBD утоляет боль Роба, а также может унять вашу. Но не верьте мне на слово, попробуйте!

Китай производитель синтетических алмазов, микронный алмазный порошок, поставщик бриллиантов на полимерной связке

Henan Harmony Industry Diamond Co., Ltd. (HID) в основном специализируется на производстве и поставке синтетических промышленных алмазов в Китае. Мы настаиваем на исследованиях и разработках прецизионных шлифовальных и полировальных алмазных материалов, а также их конечных продуктов.

В последние годы основным направлением деятельности остается синтез и обработка синтетических алмазных суперматериалов, термин …

Henan Harmony Industry Diamond Co., Ltd. (HID) в основном специализируется на производстве и поставке синтетических промышленных алмазов в Китае. Мы настаиваем на исследованиях и разработках прецизионных шлифовальных и полировальных алмазных материалов, а также их конечных продуктов.

В последние годы основным направлением деятельности компании оставался синтез и обработка синтетических алмазных суперматериалов, термин, который включает искусственные синтетические алмазы.Хотя синтетический алмаз хорошо известен как самый твердый материал на планете, он обладает многими экстремальными свойствами и является одним из самых полезных и замечательных материалов.

Миссия компании H.I.D. – обеспечить высочайшую производительность для конечных пользователей с помощью инновационных решений. H. I. D. фокусируется на тесном стратегическом партнерстве с клиентами для предоставления индивидуальных инновационных высокопроизводительных продуктов. Бизнес последовательно стремится обеспечить превосходное обслуживание клиентов и постоянное повышение производительности.

Бизнес алмазного порошка включает в себя производство высококачественных порошковых сверхтвердых материалов и передовых материалов. Abrasives использует синтез высокого давления и высокой температуры (HPHT) для производства синтетического алмаза. Эти суперматериалы используются в приложениях, включая резку, шлифовку, сверление, резку и полировку. Это стимулировало спрос в таких промышленных секторах, как автомобильная, аэрокосмическая, нефтегазовая, горнодобывающая, электронная, дорожная, каменно-строительная и деревообрабатывающая.Ежемесячная производственная мощность составляет 20-30 миллионов каратов.

H. I. D. — это организация, которая придерживается самых высоких этических стандартов и ведет свою деятельность справедливо, честно и открыто. Это обязательство дает нашим деловым партнерам уверенность в том, как мы действуем. HID придерживается абсолютной нетерпимости к коррупции со стороны своих сотрудников и деловых партнеров.

Исследование, сравнивающее даратумумаб, леналидомид, бортезомиб и дексаметазон (D-RVd) с леналидомидом, бортезомибом и дексаметазоном (RVd) у пациентов с недавно диагностированной множественной миеломой — просмотр полного текста

Бирмингем, Алабама, США
Дуарте, Калифорния, США
Ла-Хойя, Калифорния, США
Лос-Анджелес, Калифорния, США
Сан-Франциско, Калифорния, США
Аврора, Колорадо, США
Вашингтон, округ Колумбия, США
Орландо, Флорида, США
Тампа, Флорида, США
Атланта, Джорджия, США
Чикаго, Иллинойс, США
Вествуд, штат Канзас, США
Новый Орлеан, Луизиана, США
Балтимор, Мэриленд, США
Бостон, Массачусетс, США
Вустер, Массачусетс, США
Детройт, Мичиган, США
Сент-Луис, штат Миссури, США
Омаха, Небраска, США
Буффало, Нью-Йорк, США
Нью-Йорк, Нью-Йорк, США
Чапел-Хилл, Северная Каролина, США
Шарлотт, Северная Каролина, США
Дарем, Северная Каролина, США
Уинстон-Салем, Северная Каролина, США
Колумбус, Огайо, США
Портленд, Орегон, США
Абингтон, Пенсильвания, США
Филадельфия, Пенсильвания, США
Нэшвилл, Теннесси, США
Даллас, Техас, США
Хьюстон, Техас, США
Солт-Лейк-Сити, Юта, США
Сиэтл, Вашингтон, США
Спокан, Вашингтон, США
Милуоки, Висконсин, США

Re: Как запретить RVD отправлять сообщения за пределы машины

Привет:

Мы используем рвд 7. 1.

Я задавал тот же вопрос в 2004 году в группе Tibco-L на ittoolbox.com, но не очень хорошо сформулировал его. Тогда я задал вопрос «Re: Как заставить rvd проверять сообщения только на локальной машине». На самом деле я хотел вот что: «Если все издатели и подписчики находятся на одной машине, то как предотвратить выход сообщений за пределы этой машины и устранить ненужный сетевой трафик»? Был проведен некоторый аудит сетевого трафика, и сетевые ребята увидели большое количество потоков сообщений от машины к другой, которые представляли собой rvd-связь между машинами (например, между машиной разработки и рабочей машиной).Нам нужно ликвидировать этот трафик как можно быстрее. В нашем случае в этом сообщении нет необходимости. Это в основном то, что я ищу. Предположение, стоящее за этим вопросом, заключается в том, что создание уникальной маски подсети для машины не очень привлекательный вариант. Поэтому нам приходится искать другие варианты, которые могут делать то же самое на уровне приложения.

Когда я задал предыдущий вопрос, я получил несколько ответов от многих полезных членов этого списка.Я резюмирую их ниже (в порядке того, что я считаю простыми вариантами).

1) рвд -постоянная -сеть 127.0.0.1 -> запустите rvd, используя эту опцию -network. -постоянная опция устарела в 7.

2) Используйте темы с суффиксом МЕСТНЫЙ. То есть издатель будет публиковать по теме вроде так: tstLOCAL.

Сообщения с именами субъектов, имеющими этот префикс, видны и распространяются только на транспорты, подключенные к тому же демону Rendezvous, что и отправитель.

Например, программа, прослушивающая субъект _LOCAL.A.B.C, получает все сообщения, отправленные субъекту _LOCAL.A.B.C с любого транспорта, подключенного к тому же демону. Демон Rendezvous не передает сообщения с субъектами _LOCAL за пределами этого демона.

Кто-то предположил, что суффикс _LOCAL зарезервирован TIBCO и не рекомендуется.

3) rvd -нет многоадресной рассылки

4) rvd -network «;<многоадресный IP-адрес машины>» -> Хотя я бы не знал, как это сделать.

Кто-то сказал следующее о опции -listen.

«Если вы используете -listen 127.0.0.1 в командной строке для RVD, это устранит возможность любого удаленного КЛИЕНТА подключаться к этому демону, только клиентские адаптеры, работающие на той же машине, смогут подключиться к нему (через TCP-порт 7500 в данном случае)

Это может быть использовано, например, в качестве меры безопасности в производстве. Как правильно заметил кто-то, это не помешает локальным адаптерам взаимодействовать с адаптерами, подключенными к демону на другом хосте.».

Мне кажется, что если я не хочу никакой связи с другой машиной с точки зрения рвд, то это тоже может быть вариантом.

Верны ли предложенные выше варианты для перефразированного вопроса? Пожалуйста, дайте ваши предложения по моему перефразированному вопросу. Еще раз спасибо.

Сатиш

.
Опубликовано в категории: Разное

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.

2019 © Все права защищены.