Производство рвд: Производство и изготовление РВД

В продуктах ПЦР усиливаются с использованием донорских плазмид и композитных бакмидов в качестве шаблонов, мы не наблюдали каких-либо очевидных изменений в размере после переваривания ( ). Однако в продуктах ПЦР, амплифицированных из бакуловирусной геномной ДНК, часто наблюдались фрагменты размером менее 1,76 т.п.н., что указывает на крупную геномную делецию в массиве повторов TALE (,). Из 534 проанализированных отдельных клонов ТА 184 клона показали изменение размера ПЦР-вставки (34.5%), а частота изменения увеличивалась при серийном пассаже бакуловирусов от 23,4% в Р1 ( n = 64), 25,3% в Р2 ( n = 83), до 38,2% в Р3 ( n ). = 387) вирусные акции (, ). Собрав эти результаты вместе, мы можем сделать вывод, что события генетической перестройки в массивах повторов TALE происходили в основном во время размножения бакуловируса в клетках насекомых. Кроме того, мы обнаружили значительное увеличение количества клонов, демонстрирующих изменение размера, когда MOI вирусных запасов P2, используемых для создания вирусов P3, был увеличен с 0.005 до 0,2. Используя MOI 0,2, большинство сгенерированных вирусов (54 из 75 исследованных клонов) показали размер вставки ДНК менее 1,76 КБ (). В целом, использование низкого MOI до 0,05, по-видимому, приводит к меньшему количеству событий перестройки в протестированных вирусах (1). Между длинными и короткими повторяющимися последовательностями в вирусном геноме мы наблюдали выраженное увеличение крупных геномных делеций/добавлений в бакуловирусных векторах с длинной повторяющейся последовательностью, независимо от того, исследовались ли вирусные запасы P1, P2 или P3 (, ).Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что для сведения к минимуму крупных геномных делеций/добавлений массивов повторов TALE в бакуловирусных векторах левое и правое плечи TALEN должны быть клонированы отдельно в два разных вектора, а рабочие вирусы должны быть получены с использованием низкого MOI для заражения клеток насекомых.

События удаления или добавления в массивах повторов TALE, обнаруженные методом клонирования TA и переваривания RE. ( a ) Тестирование с использованием донорских плазмид, составных бакмид и бакуловирусной геномной ДНК, выделенной из штаммов вирусов P1 и P2.( b ) Тестирование с использованием бакуловирусной геномной ДНК, выделенной из рабочих вирусов P3, созданных с различными MOI исходных штаммов вируса P2. ДНК со слитой кассетой экспрессии, несущей как левое, так и правое плечо TALEN (L+R), левое (L) или правое (R) плечо TALEN, анализировали в a и b . Верхние полосы на каждой панели: линеаризованный вектор клонирования размером 3 т.п.н. Нижние полосы на каждой панели: ПЦР-вставки. Стрелки указывают на продукт ПЦР размером 1,76 т.п.н. Полосы размером меньше или больше 1,76 т.п.н. указывают на значительные события удаления или добавления соответственно.

Характеристика генетических мутаций массивов повторов TALE с использованием метода секвенирования ДНК

Генетическая перестройка в ДНК-связывающем домене TALE может не приводить к очевидным изменениям размера, но вызывает изменения в последовательности ДНК. Затем мы выполнили секвенирование ДНК ДНК-связывающих доменов TALE во всех клонах, которые несли ПЦР-вставку размером 1,76 т.п.н., как показано выше методом расщепления RE. В общей сложности 429 клонов были подвергнуты выделению ДНК и анализу последовательности, и в 89 из них были обнаружены генетические мутации ().И снова мы не наблюдали каких-либо изменений в продуктах ПЦР, амплифицированных с использованием донорных плазмид и композитных бакмид в качестве матриц, а генетические мутации были обнаружены только в продуктах ПЦР, амплифицированных из геномной ДНК бакуловируса.

Изменения в последовательностях ДНК массивов повторов TALE этих образцов включали делецию, добавление, замену и транслокацию. Делеция и добавление вызывали изменения количества RVD-содержащих повторяющихся единиц TALE, тогда как мутация замещения приводила к изменению кодона.Обмен цепями ДНК между левым и правым плечами TALEN приводил к транслокации части ДНК-связывающего домена TALE. Результаты, полученные для геномной ДНК, выделенной из вирусов P3, включая BV-TALEN(L), BV-TALEN(R) и BV-TALEN(L-R), показаны на рис. В этих образцах более 60% генетических мутаций были связаны с делецией, которая могла включать от 1 до 4 повторяющихся единиц, содержащих RVD (дополнительная таблица S2). Как и ожидалось, в BV-TALEN (LR) наблюдалась транслокация со снижением частоты рекомбинации внутри массива в левом или правом ДНК-связывающем домене TALE (дополнительная таблица S2).Помимо миссенс-мутаций, другие точечные мутации, связанные с изменениями нуклеотидной последовательности, включая сдвиг рамки считывания и нонсенс-мутации, обнаруживались, но с незначительной частотой. Выравнивание последовательности ДНК не выявило признаков молчащей мутации в массивах повторов, содержащих RVD. Изучая влияние MOI вирусных запасов, используемых для создания бакуловирусов, мы заметили, что более высокий MOI может увеличить частоту генетических мутаций, хотя и не вызывает явного изменения типа мутации (дополнительная таблица S3).

Типы мутаций в массивах повторов TALE, выявленных с помощью анализа последовательности ДНК. Клоны с ДНК-фрагментом ПЦР-вставки длиной 1,76 т.п.н., обнаруженным методом расщепления RE, подвергали анализу секвенирования ДНК. Были проанализированы образцы генома бакуловируса Р3 ( n = 239). Правильные массивы повторов TALE в левом и правом плечах TALEN перечислены вверху.

Характеристика генетических реаранжировок массивов повторов TALE с использованием Саузерн-блоттинга

Далее мы провели Саузерн-блот-анализ для изучения структурной целостности массивов повторов TALE в донорных плазмидах, составных бакмидах и бакуловирусном геноме.Плазмидную, бакмидную и вирусную геномную ДНК расщепляли NsiI и XbaI перед электрофорезом в агарозном геле. Вместо того, чтобы пытаться дифференцировать степень мутаций между левым и правым плечами TALEN, мы использовали эти два RE для определения общей структурной целостности двух плеч TALEN в экспрессионной кассете LR. Саузерн-зонд для блоттинга был разработан для связывания с областью FokI, расположенной ниже ДНК-связывающего домена TALE. Обнаружение одного фрагмента ДНК размером 2,4 т.п.н., несущего ДНК-связывающие домены FokI и TALE, в донорных плазмидах и составных бакмидах показало, что массивы повторов TALE остаются неизменными в этих образцах (1).При трансфекции клеток насекомых композитными бакмидами для получения инфекционного рекомбинантного бакуловируса в Саузерн-блотах для бакуловирусов раннего пассажа (P1) наблюдались «теневые» полосы, что указывает на возможные генетические перестройки в массивах повторов TALE. Эти события, по-видимому, увеличивались от P1 до P3, возможно, из-за накопления генетических перестроек при пассировании вируса. Затем мы исследовали геномную ДНК бакуловирусов позднего пассажа (P3), созданных с различными MOI вирусных штаммов P2, начиная с 0.005; С увеличением MOI вирусного запаса P2 полосы P3 BV-TALEN(LR) с интактным размером ДНК (2,4 kb) становились менее заметными, что указывает на исчезновение функциональных TALEN. Таким образом, наш Саузерн-блот-анализ, хотя и не может обеспечить количественную оценку, снова показывает, что низкая множественность заражения для получения бакуловирусных векторов только с одним плечом TALEN будет благоприятна для создания функциональных вирусных векторов TALEN.

Саузерн-блоттинг для изучения структурной целостности массивов повторов TALE. ( a ) Сайты связывания зонда, используемые для Саузерн-блоттинга. Используемый зонд амплифицировали из домена расщепления FokI в донорной плазмиде, несущей экспрессионную кассету слияния (TALEN L-R). ДНК, несущая кассету экспрессии TALEN, расщепляли NsiI и XbaI с образованием фрагментов ДНК размером 2,4  т.п.н., содержащих центральную матрицу повторов TALE и домен расщепления Fokl. ( b ) Структурная целостность массивов повторов TALE в донорских плазмидах, составных бакмидах и бакуловирусном геноме.Геномную ДНК рекомбинантного бакуловируса (gBV) выделяли после серийных пассажей (P1, P2 и P3). ( c ) Влияние MOI, используемого для заражения клеток насекомых, и длины тандемных повторов в конструкциях TALEN на структурную целостность. В качестве положительного контроля кассету экспрессии TALEN в донорном плазмидном векторе расщепляли BamHI и XbaI с образованием фрагмента ДНК, состоящего только из домена расщепления FokI (634 п. н.).

Оценка оптимальной системы BV-TALEN

Для оценки эффективности разрушения ДНК с помощью векторов BV-TALEN мы сконструировали репортерный вектор люциферазы, несущий целевой сайт AAVS1, и провели анализ одноцепочечного отжига () в клетках U87 человека.Когда использовали вирусы P3, генерированные с исходной множественностью заражения от 0,025 до 0,2 БОЕ на клетку насекомого, их эффективность разрушения ДНК снижалась с увеличением множественности заражения, используемой для генерации вируса, независимо от того, были ли клетки трансдуцированы с помощью BV-TALEN(LR) или котрансдуцированы с БВ-ТАЛЕН(L) и БВ-ТАЛЕН(R) (). Эти результаты согласуются с приведенными выше выводами о том, что вирусы, генерируемые с более высоким MOI, несут более неправильные последовательности связывания ДНК, поэтому они менее эффективны в расщеплении сайта-мишени.Аналогично, котрансдукция клеток U87 с BV-TALEN(L) и BV-TALEN(R) обеспечивала более сильную активность TALEN, чем трансдукция с BV-TALEN(L-R), генерируемая при той же множественности множественности (1). В соответствии с наблюдениями, что вирусы P2 несут менее функционально дефектные RVD-содержащие повторяющиеся единицы, чем вирусы P3 (), самая высокая активность TALEN была достигнута, когда клетки были котрансдуцированы двумя вирусами P2, BV-TALEN(L) и BV-TALEN( R), проявляя активность до 156% от той, которую обеспечивают два вируса Р3, сгенерированные с одинаковым MOI.Эти результаты подтверждают идею о том, что размещение двух ветвей TALEN в двух вирусных векторах, создание вирусов с низким MOI и использование небольшого числа пассажей рабочих вирусов может быть оптимальным протоколом для снижения нестабильности последовательности массива повторов TALE в бакуловирусном векторе. .

Количественная оценка эффективности расщепления TALEN с использованием анализа одноцепочечного отжига (SSA). ( a ) Схематическое представление анализа SSA, разработанного для количественной оценки эффективности расщепления TALEN в целевом сайте AAVS1 .Тестовый вектор AAVS1 SSA конструируют путем клонирования отожженных олигонуклеотидов, несущих целевой сайт AAVS1 , в вектор pGL4-SSA, обработанный BsaI, через их липкие концы. Индуцированный TALEN двухцепочечный разрыв (DSB) в сайте AAVS1 тестируемого вектора восстанавливается с помощью SSA с получением функционального репортерного вектора люциферазы. ( b ) Сравнение эффективности расщепления TALEN бакуловирусных векторов TALEN, полученных различными способами. Клетки U87 трансфицировали вектором AAVS1 SSA с последующей трансдукцией BV-TALEN при MOI 50.BV-TALEN (L-R): трансдукция вирусами, содержащими экспрессионную кассету, с левым и правым плечами TALEN. BV-TALEN (слева/справа): котрансдукция с двумя типами вирусов, несущими левое и правое плечи TALEN соответственно. Указаны вирусы P2 или P3, используемые для клеточной трансдукции, и начальный MOI, использованный для создания этих BV-TALEN (в скобках). Анализ активности люциферазы проводили через 48 часов после трансдукции, что прямо пропорционально эффективности расщепления, опосредованной TALEN. Представленные значения означают ± SD (n = 5).*, ***: p < 0,05 и p < 0,001 по сравнению с BV-TALEN(L-R) по критерию Стьюдента t . +++: p <0,001 между P2 BV-TALEN(L/R) и P3 BV-TALEN(L/R) по критерию Стьюдента. Фоновые показания для вектора AAVS1 SSA составили 291 027 ± 121 415.

Для изучения эффективности AAVS1 -направленной гомологичной рекомбинации, управляемой оптимальной системой BV-TALEN, вместе с P2 BV-TALEN(L) и P2 BV использовали донорный бакуловирусный вектор, содержащий репортер eGFP и гены устойчивости к неомицину. -TALEN (R) для котрансдукции в клетках U87 человека ().После селекции G418 в течение 20 дней большинство выживших клеток стали eGFP-позитивными (4). Эти клетки демонстрировали постоянную экспрессию eGFP в течение как минимум 3 месяцев (12). Проведено ПЦР-генотипирование геномной ДНК трансгенных клеток. Амплификация фрагмента размером 2,9 т.п.н. подтвердила успешную сайт-специфическую интеграцию донорской кассеты в локус AAVS1 , управляемую TALEN-опосредованной гомологичной рекомбинацией (4).

Стабильная экспрессия eGFP в клетках U87 человека после HR, опосредованного BV-TALEN (слева/справа). ( a ) Схематическая диаграмма, показывающая интеграцию локуса AAVS1 экспрессионной кассеты Neo-eGFP в ДНК-донор BV-eGFP после двухцепочечного разрыва ДНК (DSB), запускаемого парой BV-TALEN. HR(L) и HR(R): левое и правое плечи для гомологичной рекомбинации. FP и RP: сайты связывания для прямых и обратных праймеров ПЦР. ( b ) Экспрессия eGFP в клетках U87. После селекции G418 в течение 20 дней большинство клеток являются eGFP-позитивными. Показаны репрезентативные фазовые и флуоресцентные изображения, верхняя и нижняя панели соответственно.( c ) Анализ проточной цитометрии для определения процента eGFP-позитивных клеток через 3 месяца после трансдукции BV. Клетки поддерживали без G418. ( d ) Интеграция трансгена, специфичного для AAVS1. Геномную ДНК экстрагировали из исходных клеток U87 дикого типа (WT), клеток U87, трансдуцированных только BV-eGFP (донор), и клеток U87, котрансдуцированных BV-TALEN и BV-eGFP (TALEN+донор). ПЦР-анализ демонстрирует опосредованную котрансдукцией сайт-специфическую интеграцию кассеты eGFP размером 2,9 т.п.н. в локусе AAVS1 .

Обсуждение

Высоко повторяющиеся последовательности ДНК в массивах повторов TALE нестабильны и склонны к генетической рекомбинации. Даже в кольцевых плазмидных векторах сверхспиральный стресс может генерировать вторичные структуры, которые восприимчивы к вредным мутациям в клетках-хозяевах E. coli , особенно в областях, которые содержат многочисленные тандемные или палиндромные повторы. ³⁷ Однако мы не обнаружили каких-либо генетических перестроек в массивах повторов TALE в образцах ДНК, выделенных из донорных плазмидных векторов, используемых для создания составных бакмид, включая донорную плазмиду, сконструированную для создания BV-TALEN(LR), которая содержит длинную повторяющуюся последовательность, что указывает на то, что одних только последовательностей массива повторов TALE недостаточно для стимулирования генетической перестройки в E. палочка .

Бакмиды бакуловирусных челночных векторов получают путем Tn7-опосредованной сайт-специфической транспозиции экспрессионной кассеты в донорской плазмиде в область генома бакуловируса в клетках E. coli . Геном бакуловируса также представляет собой суперскрученную кольцевую двухцепочечную ДНК. Подобно тому, что происходит в кольцевой плазмиде, деформация кручения, присущая геному бакуловируса, может вызывать локализованное плавление с образованием крестообразных и других вторичных структур, которые могут физически сближать два фрагмента ДНК, способствуя генетической рекомбинации или делеции повторяющихся последовательностей ДНК. ³⁸ Приостановка репликации ДНК в этих вторичных структурах может способствовать переключению матрицы между прямыми повторами. Однако в очередной раз мы не обнаружили каких-либо генетических перестроек в массивах повторов TALE в образцах ДНК, выделенных из составных бакмид. Бакмиды содержат репликон mini-F и, таким образом, могут реплицироваться в E. coli с низким числом копий. ³⁹ Кроме того, клетки E. coli , использованные для получения составной бакмиды, представляли собой компетентные клетки Dh20Bac, представляющие собой мутантный штамм RecA с дефицитом рекомбинации.Эти две особенности, обеспечиваемые бакмидами и Dh20Bac, могут играть важную роль в поддержании генетической стабильности массивов повторов TALE в составных бакмидах.

С другой стороны, мы обнаружили генетическую перестройку в вирусах P1, генерируемых в клетках насекомых, и наблюдали повышенную частоту мутаций при серийном пассаже бакуловирусов, а также при использовании более высокого MOI штаммов вируса P2 для получения вирусов P3. Взятые вместе с приведенными выше наблюдениями, эти результаты заставляют нас предположить, что наблюдаемые генетические перестройки в протестированных массивах повторов TALE, возможно, связаны с экспрессией вирусных генов в клетках насекомых-хозяев.Гомологическая рекомбинация (HR) между бакуловирусами часто наблюдается во время репликации вирусной ДНК в клетках насекомых-хозяев, что подчеркивает параллелизм этих двух механизмов. ^40–42 Обнаруженные бакуловирусные рекомбинанты кумулятивно генерируются в течение нескольких циклов репликации ДНК за один пассаж. ⁴³ В вирусе множественного ядерного полиэдроза (AcMNPV) Autographa californica вирусные гены, необходимые для эффективного HR, включают ie-1 , ie-2 , lef-7 и p95, with ie-1 и ie-2 достаточно для стимулирования HR в отсутствие других вирусных генов.Кроме того, в отсутствие генов AcMNPV клеточный механизм неспособен обеспечивать высокие уровни ЧСС. ⁴² Можно предположить, что после того, как массивы повторов TALE, проанализированные в этом исследовании, будут вставлены в бакмиды и трансдуцированы в клетки насекомых, экспрессия вышеуказанных генов AcMNPV из составных бакмид и вновь созданных бакуловирусов будет стимулировать HR между этими структурами, как они это делают. для HR между двумя геномами бакуловируса, вызывая генетическую перестройку. Кроме того, во время ДНК-репликации тандемных повторов проскальзывающее несоответствие между зарождающейся нитью и другой нитью-матрицей гомологии может привести к делециям, ⁴⁴ , которые могут способствовать делециям, наблюдаемым в этом исследовании. Естественно, количество циклов вирусной репликации, которым подвергается вирус до сбора, будет играть большую роль в увеличении нестабильности последовательности экспрессионных кассет TALEN в геноме вируса.

Чтобы свести к минимуму вредные мутации в ДНК-связывающих доменах TALE в бакуловирусных векторах, рекомендуется использовать низкий MOI для продукции вируса, что может помочь сохранить генетическую целостность вирусов и предотвратить накопление дефектных интерферирующих частиц (DIP). ^45,46 DIP являются вирусоподобными побочными продуктами инфекции с частичными геномами, упакованными путем комплементации из интактных геномов, коинфицированных в той же клетке. DIP, как правило, возникают и разрастаются во время инфекции с высоким MOI, когда несколько копий вирусных частиц заражают каждую клетку-хозяина. Делеции генома в DIP могут происходить между массивами тандемных повторов TALE и/или удаленными областями гомологичных повторов в бакуловирусном геноме. DIP имеют более короткий размер генома, что делает их репликацию более быстрой, чем у интактных вирусов. При низком MOI вероятность того, что интактный вирус и DIP заразят одну и ту же клетку, низка. Кроме того, выход вируса снижается быстрее для пассажей, выполненных с более высоким MOI, как и предсказывает математическая модель, основанная на поведении клеток, коинфицированных вирусом и DIP, при однократном пассаже. ⁴⁶ Следовательно, низкий MOI, используемый во время первоначального заражения в культуре клеток насекомых, приведет к очищающей селекции против мутантов бакуловируса с делецией.

Мы заметили повышенную генетическую перестройку в массивах повторов TALE в бакуловирусных векторах с левым и правым плечами TALEN в одной экспрессионной кассете по сравнению с вирусами, содержащими только одно плечо.Из-за стресса сверхспирализации в кольцевом бакуловирусном геноме длинный массив тандемных повторов может увеличивать нестабильность ДНК и индуцировать крестообразные или шпилькообразные вторичные структуры, вызывающие перестройку. Как показано на примере бактериофага Т7, частота делеций ДНК-вставок с более длинными прямыми повторами возрастает экспоненциально по мере увеличения длины повторов. ³⁸ Как и ожидалось, два бакуловирусных вектора с короткой повторяющейся последовательностью, BV-TALEN(L) и BV-TALEN(R), демонстрируют аналогичную тенденцию к генетической перестройке, демонстрируя, что композиция или комбинация RVD, которые вносят лишь незначительный вклад изменение общей последовательности повторяющегося массива в СКАЗКЕ может иметь небольшое влияние на определение частоты событий перестановки.Фактически, генетическая перестройка массивов повторов TALE в основном была связана с высококонсервативными массивами модульных повторяющихся единиц, независимо от нуклеотидных последовательностей, кодирующих две вариабельные аминокислоты каждого RVD. Несмотря на значительное нарушение структурной целостности в массивах повторов TALE в бакуловирусных векторах, высокая эффективность нацеливания все еще может быть достигнута с оставшимися интактными TALEN, как показано в нашем предыдущем исследовании. ²⁸ Таким образом, бакуловирусные векторы с мутированными массивами повторов TALE, скорее всего, будут функционально дефектными при целенаправленном редактировании генома. Анализ кристаллической структуры показал, что единичное несоответствие между RVD и целевой базой приводит к увеличению расстояния от RVD до базы. ²⁰ Функционально предыдущее исследование также показало, что TALE с меньшим количеством повторов в значительной степени неактивны, поскольку для распознавания коробки ДНК-мишени и эффективного функционирования требуется минимальное количество мономеров TALE. ⁴⁷

Чтобы повысить эффективность бакуловирусной системы TALEN, мы оптимизировали протокол генерации вируса в текущем исследовании, чтобы свести к минимуму генетические перестройки в ДНК-связывающих доменах TALE путем клонирования левого и правого плеч TALEN по отдельности в два разных вектора и с использованием вирусов P2, продуцируемых с низким MOI.Поскольку бакуловирусы эффективны в трансдукции различных типов клеток человека, включая плюрипотентные стволовые клетки человека, ³² наш простой метод должен оказаться полезным инструментом для облегчения целенаправленного редактирования генома в этих клетках. В качестве альтернативы можно использовать сложные способы, такие как создание архитектуры гибридных ДНК-связывающих доменов с минимальным количеством тандемных повторов, чтобы обойти проблему нестабильности последовательностей, вызванную длинными повторяющимися массивами массива повторов TALE, и для их правильной упаковки в вирусные векторы.Например, использование пары гибридных нуклеаз, объединяющих два различных ДНК-связывающих домена на основе платформ ZFN и TALEN, соответственно, может уменьшить количество повторяющихся единиц TALE вдвое. ⁴⁸ Недавно была разработана архитектура одноцепочечной нуклеазы, обозначенная как megaTAL, которая создается путем слияния ДНК-связывающего домена TALE с доменом расщепления мегануклеазой и обеспечивает высокую эффективность с идеальной геномной специфичностью. ⁴⁹ Поскольку используется только один единственный TALE, можно ожидать низкой частоты генетической перестройки, когда megaTAL упакованы в бакуловирусные векторы.В будущем успехи в производстве вирусных векторов для доставки генов TALEN будут полезны для эффективного целенаправленного редактирования генома в различных типах клеток человека.

Бакуловирусные векторы, полученные из вирусов насекомых, обладают присущими клеткам человека иммуностимулирующими способностями и могут опосредовать значительные врожденные иммунные реакции. ^32,50,51 В то время как врожденные иммунные реакции могут ослаблять экспрессию трансгена в клетках млекопитающих, ⁵² эта способность делает бакуловирусные векторы многообещающими адъювантными кандидатами для вакцинации.Бакуловирусные векторы также могут индуцировать адаптивные иммунные ответы у мышей, что может влиять на экспрессию трансгена in vivo . ⁵³ Однако, поскольку бакуловирусы не являются инфекционными для клеток человека, ранее существовавшие бакуловирус-специфические антитела и Т-клетки не обнаруживаются у людей, ⁵³ , что позволяет обойти проблему существовавшего ранее иммунитета, с которой сталкиваются векторы, полученные из вирусов человека, такие как аденовирус и аденовирус. -ассоциированные вирусы. Также бакуловирусная трансдукция в некоторых типах клеток, например мезенхимальных стволовых клетках, не вызывает системной индукции иммунных клеток. ⁵⁴ Тем не менее, необходимы дальнейшие исследования дизайна и разработки бакуловирусных векторов с минимальной иммуностимулирующей активностью.

Материалы и методы

Рекомбинантные бакуловирусные векторы

Левая и правая экспрессионные плазмиды TALEN были сконструированы с использованием специального сервиса TALEN, предоставленного Cellectis Bioresearch (Париж, Франция). Последовательности, кодирующие TALEN, субклонировали в донорную плазмиду pFastBac1 (Invitrogen, Карлсбад, Калифорния) для получения pFB-TALEN(LR), который содержит как левое, так и правое плечо TALEN, слитые элементом внутреннего сайта посадки рибосомы (IRES), как описано ранее. ²⁸ Также были сконструированы два вектора pFastBac1, содержащие соответственно левое и правое плечи TALEN (дополнительный рисунок S1 и данные последовательности S1 – S3). Рекомбинантные бакуловирусы, включая BV-TALEN(L), BV-TALEN(R), BV-TALEN(LR) и BV-eGFP, были созданы с использованием pFB-TALEN(L), pFB-TALEN(R), pFB-TALEN (LR) и pFB-eGFP, соответственно, и размножали в клетках насекомых Sf9 в соответствии с протоколом системы экспрессии бакуловирусов Bac-to-Bac от Invitrogen. Исследования рекомбинантной ДНК в этом исследовании проводились в соответствии с рекомендациями Национального института здравоохранения.

ПЦР-амплификация, клонирование ТА, расщепление рестрикционными ферментами и секвенирование ДНК

ДНК вириона выделяли с использованием набора High Pure Viral Nucleic Acid (Roche Applied Science). Очищенный вирусный геном использовали в качестве матрицы ДНК для ПЦР-амплификации. Смесь ферментов, содержащую Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity (Invitrogen) и элонгазу (Invitrogen), использовали для амплификации ДНК-связывающих доменов TALE полной длины. Оптимизированный реакционный буфер состоял из 1 мкл матрицы ДНК с концентрацией 200 нг/мкл, 20 мкл мастер-микса Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity, 1 мкл смеси ферментов элонгазы, 0.5 мкл на 10 мкмоль/л каждого прямого и обратного праймера и 2 мкл ДМСО. Оптимальная программа термоциклера для двухстадийной ПЦР была установлена ​​следующим образом: начальная стадия денатурации при 94°С в течение 5 минут, затем 35 циклов при 94°С в течение 20 секунд и 72°С в течение 120 секунд с конечной стадией удлинения при 72°С в течение 10 минут. Амплифицированные продукты анализировали на 1% агарозном геле. Праймеры, используемые для амплификации полноразмерных массивов повторов TALE, перечислены в дополнительной таблице S1.

Продукты ПЦР, несущие массив повторов TALE, затем клонировали в pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI).Белые колонии E. coli, содержащие интересующие продукты ПЦР, отбирали для экстракции плазмид (набор GeneJET Plasmid Miniprep, Fermentas) и подтверждали расщеплением рестрикционным ферментом (RE) EcoRI. Поскольку сайты EcoRI граничат с обоими концами клонированных фрагментов, расщепление EcoRI высвобождает клонированный фрагмент, содержащий массив повторов TALEN размером 1,76 т.п.н. и вектор pGEM-T Easy Vector размером 3 т.п.н. После расщепления RE размер фрагментов ДНК анализировали на 1% агарозном геле. Клоны с ДНК-вставкой правильного размера отбирали для секвенирования ДНК с использованием прямого и обратного универсальных праймеров М13.

Саузерн-блот-анализ

Для Саузерн-блоттинга плазмидную, бакмидную и вирусную геномную ДНК (1 мкг) расщепляли в течение ночи с помощью NsiI и XbaI. Расщепленную ДНК загружали в 2% агарозный гель и проводили электрофорез в течение 8 часов при 25 В. Затем с помощью системы сухого блоттинга iBlot (Invitrogen) ДНК переносили в набор для переноса ДНК iBlot (Invitrogen), содержащий положительно заряженный нейлоновая мембрана. Мембрану инкубировали в денатурирующем растворе 1,5 моль/л NaCl/0,5 моль/л NaOH в течение 10 минут сразу после переноса и сушили на воздухе.После перекрестного сшивания УФ-излучением при 130 мДж/см ² мембрану гибридизовали в течение ночи с DIG Easy Hyb (Roche, Индианаполис, Индиана). Зонды, меченные DIG, нацеленные на область FokI кассеты экспрессии TALEN, были синтезированы с использованием набора PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche). После гибридизации мембрану тщательно промывали, блокировали, а затем инкубировали с конъюгатом анти-дигоксигенин-AP (набор для мечения и обнаружения ДНК DIG, Roche), который обнаруживали с помощью CDP-Star, готовый к использованию (Roche).Несущая мембрану ДНК подвергалась воздействию хемилюминесцентного анализатора изображений (ImageQuant LAS 4000 mini, GE Healthcare Biosciences, Питтсбург, Пенсильвания) в течение 15 минут. Праймеры, используемые для синтеза меченых DIG зондов, перечислены в дополнительной таблице S1.

Анализ одноцепочечного отжига

Тестовый вектор для анализа SSA был сконструирован путем вставки отожженных олигонуклеотидов, несущих целевую последовательность AAVS1 TALEN, в репортерный вектор люциферазы светлячка pGL4-SSA, обработанный BsaI (Addgene). Дизайн пользовательских олигонуклеотидов был описан ранее. ⁵⁵ Вкратце, клетки U87 высевали в 96-луночный планшет при плотности 2000 клеток/лунку за день до плазмидной трансфекции. Сконструированный вектор для анализа одноцепочечного отжига (SSA) затем трансфицировали с использованием липофектамина 2000 (Invitrogen) в клетки U87, культивированные в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM) (с высоким содержанием глюкозы) с 10% фетальной бычьей сывороткой (Invitrogen). Через четыре часа после трансфекции клетки трансдуцировали бакуловирусами, экспрессирующими TALEN, при множественности заражения (MOI) 50 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на клетку. Через 48 часов использовали систему анализа люциферазы ONE-Glo (Promega) для количественного определения полученных люминесцентных сигналов.

Гомологическая рекомбинация, опосредованная TALEN

Для направленной трансгенной интеграции клеток U87 2 × 10 ⁴ клеток, высеянных на шестилуночный планшет, котрансдуцировали с BV-TALEN(L), BV-TALEN(R) и BV -eGFP (в качестве донорской матрицы) при MOI 100 в бессывороточной среде DMEM в течение 4 часов. Вирусы очищали и ресуспендировали в PBS для трансдукции клеток. Вкратце, среду клеток насекомых, содержащую вирусы, переносили в стерильные пробирки.Пробирки центрифугировали при 1000 g в течение 5 минут для удаления клеток и крупного мусора. Затем супернатант вируса фильтровали через 0,2 мкм фильтр с низким связыванием белка. За сутки до трансдукции клеток отфильтрованный рабочий исходный вирус центрифугировали при 28000 g (4°С) в течение 1 часа 30 минут. Супернатант удаляли после высокоскоростного центрифугирования, а осадок вирусных частиц ресуспендировали в PBS. Селекцию G418 в концентрации 400 мг/мл начинали на 3-й день после трансдукции, и среду меняли каждые 2 дня в течение 20 дней.Для ПЦР-генотипирования для проверки специфической интеграции сайта AAVS1, управляемой системой BV-TALEN, геномную ДНК клеток U87 выделяли с использованием набора DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Hilden, Germany). ПЦР-амплификацию проводили с использованием следующих параметров: начальная стадия денатурации при 94°С в течение 5 минут, затем 35 циклов при 94°С в течение 15 секунд, 65°С в течение 45 секунд и 72°С в течение 150 секунд с окончательным удлинением. шаг при 72 ° C в течение 10 минут.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным советом по медицинским исследованиям Министерства здравоохранения Сингапура (NMRC/CIRG/1367/2013), (NMRC/1284/2011), Министерством образования Сингапура (MOE2011-T2-1–056). ), и Институт биоинженерии и нанотехнологий (Совет по биомедицинским исследованиям, Агентство по науке, технологиям и исследованиям, Сингапур). Финансирование платы за открытый доступ: (NMRC/CIRG/1367/2013).

Примечания

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Ссылки

• Урнов Ф.Д., Миллер Дж.С., Ли Ю.Л., Босежур С.М., Рок Дж.М., Огастус С. Высокоэффективная коррекция эндогенных генов человека с использованием разработанных нуклеаз с цинковыми пальцами. Природа. 2005; 435: 646–651. [PubMed] [Google Scholar]
• Хоккейер Д., Солднер Ф., Бирд С., Гао К., Миталипова М., ДеКелвер Р.С. Эффективное нацеливание на экспрессированные и молчащие гены в ЭСК и ИПСК человека с использованием нуклеаз с цинковыми пальцами.Нац биотехнолог. 2009; 27: 851–857. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bedell VM, Wang Y, Campbell JM, Poshusta TL, Starker CG, Krug RG., 2nd Редактирование генома in vivo с использованием высокоэффективной системы TALEN. Природа. 2012; 491:114–118. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Kim Y, Kweon J, Kim A, Chon JK, Yoo JY, Kim HJ. Библиотека эффекторных нуклеаз TAL, охватывающая геном человека. Нац биотехнолог. 2013; 31: 251–258. [PubMed] [Google Scholar]
• Mali P, Yang L, Esvelt KM, Aach J, Guell M, DiCarlo JE.Инженерия генома человека с помощью РНК с помощью Cas9. Наука. 2013; 339: 823–826. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Cong L, Ran FA, Cox D, Lin S, Barretto R, Habib N. Мультиплексная инженерия генома с использованием систем CRISPR/Cas. Наука. 2013; 339:819–823. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ли Л., Крымская Л., Ван Дж., Хенли Дж., Рао А., Цао Л.Ф. Геномное редактирование корецептора ВИЧ-1 CCR5 во взрослых гемопоэтических стволовых клетках и клетках-предшественниках с использованием нуклеаз цинковых пальцев. Мол Тер.2013;21:1259–1269. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Майер Д.А., Бреннан А.Л., Цзян С., Биндер-Шолль Г.К., Ли Г., Плеса Г. Эффективная модификация генов клинического масштаба с помощью нуклеазы цинковых пальцев, нацеленной на разрушение вируса ВИЧ. -рецептор CCR5. Гул Джин Тер. 2013; 24: 245–258. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Гендель Э.М., Геллхаус К., Хан К., Беднарски С., Корню Т.И., Мюллер-Лерх Ф. Универсальное и эффективное редактирование генома в клетках человека путем сочетания нуклеаз цинковых пальцев с адено -ассоциированные вирусные векторы.Гул Джин Тер. 2012; 23:321–329. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lei Y, Lee CL, Joo KI, Zarzar J, Liu Y, Dai B. Редактирование генов эмбриональных стволовых клеток человека с помощью сконструированного бакуловирусного вектора, несущего нуклеазы с цинковыми пальцами. Мол Тер. 2011;19:942–950. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Tay FC, Tan WK, Goh SL, Ramachandra CJ, Lau CH, Zhu H. Нацеленная вставка трансгена в локус AAVS1, управляемая экспрессией нуклеазы цинкового пальца, опосредованной бакуловирусным вектором, в индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки.Дж Джин Мед. 2013; 15: 384–395. [PubMed] [Google Scholar]
• Phang RZ, Tay FC, Goh SL, Lau CH, Zhu H, Tan WK. Бакуловирусные векторы, экспрессирующие нуклеазу цинковых пальцев, опосредуют целевую геномную интеграцию генов факторов репрограммирования, чтобы облегчить создание индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток. Стволовые клетки Transl Med. 2013;2:935–945. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Joglekar AV, Hollis RP, Kuftinec G, Senadheera S, Chan R, Kohn DB. Интегразо-дефектные лентивирусные векторы в качестве платформы доставки для направленной модификации локуса аденозиндезаминазы.Мол Тер. 2013;21:1705–1717. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Lombardo A, Genovese P, Beausejour CM, Colleoni S, Lee YL, Kim KA. Редактирование генов в стволовых клетках человека с использованием нуклеаз цинковых пальцев и доставки лентивирусного вектора, дефектного по интегразе. Нац биотехнолог. 2007; 25:1298–1306. [PubMed] [Google Scholar]
• Малина А., Миллс Дж. Р., Сенчич Р., Ян И., Фрейзер Дж., Шипперс Л.М. Перепрофилирование CRISPR/Cas9 для функциональных анализов in situ. Гены Дев. 2013;27:2602–2614. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Koike-Yusa H, Li Y, Tan EP, Velasco-Herrera Mdel C, Yusa K.Полногеномный рецессивный генетический скрининг в клетках млекопитающих с использованием лентивирусной библиотеки РНК CRISPR-guide. Нац биотехнолог. 2014; 32: 267–273. [PubMed] [Google Scholar]
• Шалем О., Санджана Н.Е., Хартениан Э., Ши Х., Скотт Д.А., Миккельсен Т.С. Скрининг нокаута CRISPR-Cas9 в масштабе генома в клетках человека. Наука. 2014; 343:84–87. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES. Генетические скрининги в клетках человека с использованием системы CRISPR-Cas9. Наука. 2014; 343:80–84.[Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Miller JC, Tan S, Qiao G, Barlow KA, Wang J, Xia DF. Нуклеазная архитектура TALE для эффективного редактирования генома. Нац биотехнолог. 2011; 29: 143–148. [PubMed] [Google Scholar]
• Мак А.Н., Брэдли П., Сернадас Р. А., Богданов А.Дж., Стоддард Б.Л. Кристаллическая структура эффектора TAL PthXo1, связанного со своей ДНК-мишенью. Наука. 2012; 335:716–719. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Deng D, Yan C, Pan X, Mahfouz M, Wang J, Zhu JK.Структурная основа последовательности-специфического распознавания ДНК эффекторами TAL. Наука. 2012; 335:720–723. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Bergmann T, Schulz E, Ehrhardt A. Прогресс и проблемы с вирусными векторами для доставки Talens. Дж. Мол Жене Мед. 2014; 8:096. [Google Scholar]
• Holkers M, Maggio I, Liu J, Janssen JM, Miselli F, Mussolino C. Дифференциальная целостность генов нуклеаз TALE после переноса генов аденовирусных и лентивирусных векторов в клетки человека.Нуклеиновые Кислоты Res. 2013;41:e63. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Holkers M, Catomen T, Goncalves MA. Конструирование и характеристика аденовирусных векторов для доставки TALEN в клетки человека. Методы. 2014;69:179–187. [PubMed] [Google Scholar]
• Zhang Z, Zhang S, Huang X, Orwig KE, Sheng Y. Быстрая сборка индивидуальных TALEN в несколько систем доставки. ПЛОС ОДИН. 2013;8:e80281. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Yang L, Guell M, Byrne S, Yang JL, De Los Angeles A, Mali P.Оптимизация бесрубцового редактирования генома стволовых клеток человека. Нуклеиновые Кислоты Res. 2013;41:9049–9061. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L. Оптический контроль эндогенной транскрипции млекопитающих и эпигенетических состояний. Природа. 2013; 500:472–476. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zhu H, Lau CH, Goh SL, Liang Q, Chen C, Du S. Бакуловирусная трансдукция облегчает опосредованную TALEN целевую интеграцию трансгенов и обмен кассетами Cre/LoxP у человека. индуцированные плюрипотентные стволовые клетки.Нуклеиновые Кислоты Res. 2013;41:e180. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Ramachandra CJ, Shahbazi M, Kwang TW, Choudhury Y, Bak XY, ​​Yang J. Эффективная опосредованная рекомбиназой замена кассет в локусе AAVS1 в эмбриональных стволовых клетках человека с использованием бакуловирусных векторов . Нуклеиновые Кислоты Res. 2011;39:e107. [Статья бесплатно PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zeng J, Du J, Zhao Y, Palanisamy N, Wang S. Временная и стабильная экспрессия трансгена, опосредованная бакуловирусным вектором, в эмбриональных стволовых клетках человека.Стволовые клетки. 2007; 25:1055–1061. [PubMed] [Google Scholar]
• Chen GY, Hwang SM, Su HJ, Kuo CY, Luo WY, Lo KW. Дефектные противовирусные ответы индуцированных плюрипотентных стволовых клеток на трансдукцию бакуловирусного вектора. Дж Вирол. 2012; 86: 8041–8049. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Airenne KJ, Hu YC, Kost TA, Smith RH, Kotin RM, Ono C. Бакуловирус: полученный из насекомых вектор для различных приложений переноса генов. Мол Тер. 2013;21:739–749. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Zeng J, Du J, Lin J, Bak XY, ​​Wu C, Wang S. Высокоэффективная транзиентная трансдукция нейронов, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека, бакуловирусными векторами. Мол Тер. 2009;17:1585–1593. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Уолш П.С., Эрлих Х.А., Хигучи Р. Предпочтительная ПЦР-амплификация аллелей: механизмы и решения. Прил. методы ПЦР. 1992; 1: 241–250. [PubMed] [Google Scholar]
• Олейничак М., Кржизосяк В.Дж. Генотипирование простых повторов последовательностей – пересмотр факторов, причастных к генерации теневых полос. Электрофорез.2006; 27:3724–3734. [PubMed] [Google Scholar]
• Viguera E, Canceill D, Ehrlich SD. Проскальзывание репликации in vitro ДНК-полимеразами термофильных организмов. Дж Мол Биол. 2001; 312: 323–333. [PubMed] [Google Scholar]
• Godiska R, Mead D, Dhodda V, Wu C, Hochstein R, Karsi A. Линейный плазмидный вектор для клонирования повторяющихся или нестабильных последовательностей в Escherichia coli. Нуклеиновые Кислоты Res. 2010;38:e88. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Pierce JC, Kong D, Masker W.Влияние длины прямых повторов и наличия палиндромов на делецию между непосредственно повторяющимися последовательностями ДНК у бактериофага Т7. Нуклеиновые Кислоты Res. 1991;19:3901–3905. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Луков В.А., Ли С.К., Барри Г.Ф., Олинс П.О. Эффективное создание инфекционных рекомбинантных бакуловирусов путем сайт-специфической транспозон-опосредованной вставки чужеродных генов в геном бакуловируса, размножаемого в Escherichia coli. Дж Вирол. 1993; 67: 4566–4579. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Martin DW, Weber PC.Репликация ДНК способствует высокочастотной гомологичной рекомбинации при инфицировании вирусом множественного ядерного полиэдроза Autographa californica. Вирусология. 1997; 232:300–309. [PubMed] [Google Scholar]
• Камита С.Г., Маэда С., Гамак Б.Д. Высокочастотная гомологичная рекомбинация между бакуловирусами включает репликацию ДНК. Дж Вирол. 2003;77:13053–13061. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Крауч Э.А., Пассарелли А.Л. Генетические требования к гомологичной рекомбинации в нуклеополиэдровирусе Autographa californica.Дж Вирол. 2002;76:9323–9334. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Hajós JP, Pijnenburg J, Usmany M, Zuidema D, Závodszky P, Vlak JM. Высокочастотная рекомбинация между гомологичными бакуловирусами в культуре клеток. Арх Вирол. 2000; 145:159–164. [PubMed] [Google Scholar]
• Фещенко В.В., Ловетт СТ. Механизмы формирования делеции со скольжением: анализ конечных точек делеции. Дж Мол Биол. 1998; 276: 559–569. [PubMed] [Google Scholar]
• Giri L, Feiss MG, Bonning BC, Murhammer DW.Производство дефектных бакуловирусных мешающих частиц во время серийного пассажа задерживается за счет удаления сайтов-мишеней транспозона в fp25k. Джей Ген Вирол. 2012; 93 Пт. 2: 389–399. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Томпсон К. А., Инь Дж. Динамика популяции РНК-вируса и его дефектных мешающих частиц в пассажных культурах. Вирол Дж. 2010; 7:257. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Boch J, Scholze H, Schornack S, Landgraf A, Hahn S, Kay S. Нарушение кода специфичности связывания ДНК эффекторов TAL-типа III.Наука. 2009; 326:1509–1512. [PubMed] [Google Scholar]
• Yan W, Smith C, Cheng L. Расширение активности димерных нуклеаз путем объединения ZFN и TALEN для редактирования генома. Научный доклад 2013; 3: 2376. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Boissel S, Jarjour J, Astrakhan A, Adey A, Gouble A, Duchateau P. megaTALs: редко расщепляющая нуклеазная архитектура для терапевтической инженерии генома. Нуклеиновые Кислоты Res. 2014;42:2591–2601. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Abe T, Matsuura Y.Врожденные иммунные ответы хозяина, индуцированные бакуловирусом у млекопитающих. Карр Джин Тер. 2010;10:226–231. [PubMed] [Google Scholar]
• Ван С. , Баласундарам Г. Потенциальная генная терапия рака путем бакуловирусной трансдукции. Карр Джин Тер. 2010;10:214–225. [PubMed] [Google Scholar]
• Ono C, Ninomiya A, Yamamoto S, Abe T, Wen X, Fukuhara T. Врожденный иммунный ответ, индуцированный бакуловирусом, ослабляет экспрессию трансгена в клетках млекопитающих. Дж Вирол. 2014;88:2157–2167. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Luo WY, Lin SY, Lo KW, Lu CH, Hung CL, Chen CY.Адаптивный иммунный ответ, вызванный бакуловирусом, и влияние на последующую экспрессию трансгена in vivo. Дж Вирол. 2013; 87: 4965–4973. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Chuang CK, Wong TH, Hwang SM, Chang YH, Chen GY, Chiu YC. Бакуловирусная трансдукция мезенхимальных стволовых клеток: ответов in vitro и иммунных ответов in vivo после трансплантации клеток. Мол Тер. 2009; 17: 889–896. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Sakuma T, Hosoi S, Woltjen K, Suzuki K, Kashiwagi K, Wada H. Эффективные методы конструирования и оценки TALEN для клеток человека и животных. Клетки генов. 2013;18:315–326. [PubMed] [Google Scholar]

О Робе Ван Даме и RVDCBD

С 2019 года RVDCBD поставляет продукты CBD, курируемые основателем Робом Ван Дамом.

Познакомьтесь с Робом Ван Дамом, основателем RVDCBD

Роб Ван Дам — борец Зала славы ECW 2021 года. Он начал со скромных корней в Мичигане и быстро вырос до профессионального борца, которого мы все знаем, благодаря его высоким акробатам и необычному стилю кикбоксинга.Роб, также известный как «The Whole Fucking Show», «Мистер Понедельник Ночь» и «Мистер 420», завоевал бесконечное количество чемпионских титулов: 90 016.

«Знаете, некоторые люди берут душевный покой и путают его с отсутствием страсти». ~ Роб Ван Дам

Роб Ван Дам является органом CBD

Ван Дам на протяжении всей своей карьеры открыто выступал за использование каннабиса в медицинских целях. Он включил намеки на 4/20 и культуру каннабиса в свой борцовский образ. Он использовал такие лозунги, как «RVD 420» (что означает «я только что выкурил твою задницу») и продемонстрировал свою страсть к нескольким лекарственным свойствам растения в бесчисленных интервью.Некоторые фанаты, однако, спутали его расслабленность в конфронтациях с отсутствием страсти. Однако пропаганду Ван Дамом лекарств и культуры на основе каннабиса нельзя спутать. Он всегда был и всегда будет пропагандистом CBD.

Молодой Роб

Люди знают Роба за его профессиональный рестлинг и харизматичный, непринужденный характер в кругу и за его пределами. Чего они могут не знать, так это стороны Роба, посвященной здоровью и хорошему самочувствию. Еще в старших классах эта забота о нездоровых привычках руководила его жизнью.Он присоединился к борцовской команде в надежде стать профессионалом. Однако тренер хотел, чтобы он сбросил тридцать фунтов, чтобы соответствовать весовой категории. Роб сказал: «Я весил 165 фунтов. Тренер сказал мне сбросить 30 фунтов. Я хотел быть 235 фунтов. Я хотел полностью раскрыть свой потенциал и не останавливать свой рост в те годы, когда я все еще рос».

нд Роб Ван Дам через wrestletalk.com

Фанат

«На физическом уровне первое, что он сделал, — это предотвращение стресса. Употребляя каннабис, я [не стал] жертвой [повреждающего воздействия] стресса.Из-за этого я чувствую, что нахожусь в своей лучшей форме». Профессиональный спорт – это стресс, и Роб всегда хотел быть на высоте для своих болельщиков. «Когда я появляюсь, есть фанаты, которые купили билеты, чтобы увидеть меня несколько месяцев назад… Я [всегда] хотел подарить им RVD, который они ожидали увидеть». Однако не только стресс сказался на Робе. Три десятилетия того, как он был одним из самых акробатических и высоколетящих исполнителей в профессиональном рестлинге, сопровождались несколькими травмами и длительными недугами.

«Как профессиональный борец я получил более 500 сотрясений мозга.Никто из нас не понимал последствий сотрясения мозга, пока мы не узнали об этом». Headstrong , документальный фильм 2019 года о стендап-комедии Ван Дама, продемонстрировал борьбу Роба с длительным сотрясением мозга (особенно в 2016 и 2017 годах). Проблемы со здоровьем, прервавшие его стендап-комедию, вызвали обеспокоенность. Возможно, у него развилась хроническая травматическая энцефалопатия (ХТЭ). Энцефалопатия (ХТЭ).

Почему стоит RVDCBD

Во второй половине карьеры Роба Ван Дама в борьбе ему прописали опиаты, чтобы справиться с болью.Он жил от таблеток до актуальных, чтобы он мог выступать. Роб никогда не любил принимать таблетки. Он хотел что-то нетоксичное и исцеляющее, а не просто пластырь. Однако КБР был объявлен вне закона. Роб сказал: «Я хотел изучить продукты CBD и, в частности, что-то для мозга. Хотя у меня нет ХТЭ, я устал от того, что мои друзья убивают себя депрессией… из-за нескольких сотрясений мозга. … Я хотел сделать что-то, что помогло бы всем нам».

После законопроекта о фермах 2018 года Ван Дам решил совместить свой интерес к борьбе с сотрясением мозга, хроническими заболеваниями, стрессом и беспокойством с растением, которое спасло ему жизнь. Создав RVDCBD с командой партнеров, Ван Дам мог напрямую предоставить потенциальное лекарство не только суперзвездам и выпускникам рестлинга, но и самим преданным фанатам.

И вот так RVDCBD стал официальным номером

Как только он принял решение двигаться вперед, все стало на Роба Ван Дама и RVDCBD. Роб начал свою первоклассную игру с единственной целью; производить и распространять продукты CBD высочайшего качества. Линия CBD для всех, в том числе достаточно сильная для него.И если он не поместит его в свое тело, он не попросит вас положить его в свое!

RVDCBD утоляет боль Роба, а также может унять вашу. Но не верьте мне на слово, попробуйте!

Китай производитель синтетических алмазов, микронный алмазный порошок, поставщик бриллиантов на полимерной связке

Henan Harmony Industry Diamond Co., Ltd. (HID) в основном специализируется на производстве и поставке синтетических промышленных алмазов в Китае. Мы настаиваем на исследованиях и разработках прецизионных шлифовальных и полировальных алмазных материалов, а также их конечных продуктов.

В последние годы основным направлением деятельности остается синтез и обработка синтетических алмазных суперматериалов, термин …

Henan Harmony Industry Diamond Co., Ltd. (HID) в основном специализируется на производстве и поставке синтетических промышленных алмазов в Китае. Мы настаиваем на исследованиях и разработках прецизионных шлифовальных и полировальных алмазных материалов, а также их конечных продуктов.

В последние годы основным направлением деятельности компании оставался синтез и обработка синтетических алмазных суперматериалов, термин, который включает искусственные синтетические алмазы.Хотя синтетический алмаз хорошо известен как самый твердый материал на планете, он обладает многими экстремальными свойствами и является одним из самых полезных и замечательных материалов.

Миссия компании H.I.D. – обеспечить высочайшую производительность для конечных пользователей с помощью инновационных решений. H. I. D. фокусируется на тесном стратегическом партнерстве с клиентами для предоставления индивидуальных инновационных высокопроизводительных продуктов. Бизнес последовательно стремится обеспечить превосходное обслуживание клиентов и постоянное повышение производительности.

Бизнес алмазного порошка включает в себя производство высококачественных порошковых сверхтвердых материалов и передовых материалов. Abrasives использует синтез высокого давления и высокой температуры (HPHT) для производства синтетического алмаза. Эти суперматериалы используются в приложениях, включая резку, шлифовку, сверление, резку и полировку. Это стимулировало спрос в таких промышленных секторах, как автомобильная, аэрокосмическая, нефтегазовая, горнодобывающая, электронная, дорожная, каменно-строительная и деревообрабатывающая.Ежемесячная производственная мощность составляет 20-30 миллионов каратов.

H. I. D. — это организация, которая придерживается самых высоких этических стандартов и ведет свою деятельность справедливо, честно и открыто. Это обязательство дает нашим деловым партнерам уверенность в том, как мы действуем. HID придерживается абсолютной нетерпимости к коррупции со стороны своих сотрудников и деловых партнеров.

Исследование, сравнивающее даратумумаб, леналидомид, бортезомиб и дексаметазон (D-RVd) с леналидомидом, бортезомибом и дексаметазоном (RVd) у пациентов с недавно диагностированной множественной миеломой — просмотр полного текста

Бирмингем, Алабама, США
Дуарте, Калифорния, США
Ла-Хойя, Калифорния, США
Лос-Анджелес, Калифорния, США
Сан-Франциско, Калифорния, США
Аврора, Колорадо, США
Вашингтон, округ Колумбия, США
Орландо, Флорида, США
Тампа, Флорида, США
Атланта, Джорджия, США
Чикаго, Иллинойс, США
Вествуд, штат Канзас, США
Новый Орлеан, Луизиана, США
Балтимор, Мэриленд, США
Бостон, Массачусетс, США
Вустер, Массачусетс, США
Детройт, Мичиган, США
Сент-Луис, штат Миссури, США
Омаха, Небраска, США
Буффало, Нью-Йорк, США
Нью-Йорк, Нью-Йорк, США
Чапел-Хилл, Северная Каролина, США
Шарлотт, Северная Каролина, США
Дарем, Северная Каролина, США
Уинстон-Салем, Северная Каролина, США
Колумбус, Огайо, США
Портленд, Орегон, США
Абингтон, Пенсильвания, США
Филадельфия, Пенсильвания, США
Нэшвилл, Теннесси, США
Даллас, Техас, США
Хьюстон, Техас, США
Солт-Лейк-Сити, Юта, США
Сиэтл, Вашингтон, США
Спокан, Вашингтон, США
Милуоки, Висконсин, США

Re: Как запретить RVD отправлять сообщения за пределы машины

Привет:

Мы используем рвд 7. 1.

Я задавал тот же вопрос в 2004 году в группе Tibco-L на ittoolbox.com, но не очень хорошо сформулировал его. Тогда я задал вопрос «Re: Как заставить rvd проверять сообщения только на локальной машине». На самом деле я хотел вот что: «Если все издатели и подписчики находятся на одной машине, то как предотвратить выход сообщений за пределы этой машины и устранить ненужный сетевой трафик»? Был проведен некоторый аудит сетевого трафика, и сетевые ребята увидели большое количество потоков сообщений от машины к другой, которые представляли собой rvd-связь между машинами (например, между машиной разработки и рабочей машиной).Нам нужно ликвидировать этот трафик как можно быстрее. В нашем случае в этом сообщении нет необходимости. Это в основном то, что я ищу. Предположение, стоящее за этим вопросом, заключается в том, что создание уникальной маски подсети для машины не очень привлекательный вариант. Поэтому нам приходится искать другие варианты, которые могут делать то же самое на уровне приложения.

Когда я задал предыдущий вопрос, я получил несколько ответов от многих полезных членов этого списка.Я резюмирую их ниже (в порядке того, что я считаю простыми вариантами).

1) рвд -постоянная -сеть 127.0.0.1 -> запустите rvd, используя эту опцию -network. -постоянная опция устарела в 7.

2) Используйте темы с суффиксом МЕСТНЫЙ. То есть издатель будет публиковать по теме вроде так: tstLOCAL.

Сообщения с именами субъектов, имеющими этот префикс, видны и распространяются только на транспорты, подключенные к тому же демону Rendezvous, что и отправитель.

Например, программа, прослушивающая субъект _LOCAL.A.B.C, получает все сообщения, отправленные субъекту _LOCAL.A.B.C с любого транспорта, подключенного к тому же демону. Демон Rendezvous не передает сообщения с субъектами _LOCAL за пределами этого демона.

Кто-то предположил, что суффикс _LOCAL зарезервирован TIBCO и не рекомендуется.

3) rvd -нет многоадресной рассылки

4) rvd -network «;<многоадресный IP-адрес машины>» -> Хотя я бы не знал, как это сделать.

Кто-то сказал следующее о опции -listen.

«Если вы используете -listen 127.0.0.1 в командной строке для RVD, это устранит возможность любого удаленного КЛИЕНТА подключаться к этому демону, только клиентские адаптеры, работающие на той же машине, смогут подключиться к нему (через TCP-порт 7500 в данном случае)

Это может быть использовано, например, в качестве меры безопасности в производстве. Как правильно заметил кто-то, это не помешает локальным адаптерам взаимодействовать с адаптерами, подключенными к демону на другом хосте.».

Мне кажется, что если я не хочу никакой связи с другой машиной с точки зрения рвд, то это тоже может быть вариантом.

Верны ли предложенные выше варианты для перефразированного вопроса? Пожалуйста, дайте ваши предложения по моему перефразированному вопросу. Еще раз спасибо.

Сатиш

.

Добавить комментарий Отменить ответ

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Комментарий *

Имя *

Email *

Сайт

2019 © Все права защищены.