Рсв 1 форма: Приложение N 1 / КонсультантПлюс

Содержание

Приложение N 1 / КонсультантПлюс

к Постановлению Правления ПФР

от 16 января 2014 г. N 2п

(см. текст в предыдущей редакции)

 

Представляется не позднее 15-го числа
второго календарного месяца, следующего за отчетным
периодом, в территориальный орган Пенсионного
фонда Российской Федерации (далее - ПФР)
по месту регистрации
 
                                                            Форма РСВ-1 ПФР
 
                           ┌─┬─┬─┐ ┌─┬─┬─┐ ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┐      ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┐
           Регистрационный │ │ │ │-│ │ │ │-│ │ │ │ │ │ │ Стр. │ │ │ │ │ │ │
           номер в ПФР     └─┴─┴─┘ └─┴─┴─┘ └─┴─┴─┴─┴─┴─┘      └─┴─┴─┴─┴─┴─┘
 
                                  РАСЧЕТ
               по начисленным и уплаченным страховым взносам
         на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд
      Российской Федерации и на обязательное медицинское страхование
         в Федеральный фонд обязательного медицинского страхования
          плательщиками страховых взносов, производящими выплаты
                  и иные вознаграждения физическим лицам
 
                        ┌─┬─┬─┐                  ┌─┐              ┌─┬─┬─┬─┐
        Номер уточнения │ │ │ │  Отчетный период │ │  Календарный │ │ │ │ │
                        └─┴─┴─┘  (код)           └─┘  год         └─┴─┴─┴─┘
     (000 - исходная форма,        (3 - I квартал,
      уточнения 001 и т.д.)      6 - полугодие, 9 -
                                 9 месяцев, 0 - год)
 
                        ┌─┐                                             ┌─┐
      Причина уточнения │ │                                 Прекращение │ │
                        └─┘                                деятельности └─┘
 
┌─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┐
│                                                                         │
│                                                                         │
│                                                                         │
└─────────────────────────────────────────────────────────────────────────┘
       (наименование организации, обособленного подразделения/Ф.И.О.
            индивидуального предпринимателя, физического лица)
 
         ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐     Код по ┌─┬─┐ ┌─┬─┐ ┌─┬─┐
   ИНН   │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │     ОКВЭД  │ │ │.│ │ │.│ │ │
         └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘            └─┴─┘ └─┴─┘ └─┴─┘
         ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐            Номер ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┬─┐
   КПП   │ │ │ │ │ │ │ │ │ │      контактного │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │
         └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘         телефона └─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┴─┘
 
                                ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┐                 ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┐
    Количество застрахованных   │ │ │ │ │ │ │ Среднесписочная │ │ │ │ │ │ │
    лиц, на которых             └─┴─┴─┴─┴─┴─┘ численность     └─┴─┴─┴─┴─┴─┘
    представлены сведения о сумме выплат
    и иных вознаграждений и/или
    страховом стаже
 
   ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┐                                             ┌─┬─┬─┐
На │ │ │ │ │ │ │ страницах      с приложением подтверждающих │ │ │ │ листах
   └─┴─┴─┴─┴─┴─┘                документов или их копий на   └─┴─┴─┘
 
───────────────────────────────────────┬───────────────────────────────────
  Достоверность и полноту сведений,    │    Заполняется работником ПФР
   указанных в настоящем расчете,      │  Сведения о представлении расчета
            подтверждаю                │
                                       │                            ┌─┬─┐
    ┌─┐ 1 - плательщик страховых       │  Данный расчет представлен │ │ │
    │ │     взносов                    │                      (код) └─┴─┘
    └─┘ 2 - представитель              │          ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┐
            плательщика страховых      │       на │ │ │ │ │ │ │ страницах
            взносов                    │          └─┴─┴─┴─┴─┴─┘
        3 - правопреемник              │
┌─────────────────────────────────────┐│  с приложением
│                                     ││ подтверждающих
└─────────────────────────────────────┘│ документов или ┌─┬─┬─┐
   (Ф.И.О. руководителя организации,   │ их копий на    │ │ │ │ листах
   индивидуального предпринимателя,    │                └─┴─┴─┘
    физического лица, представителя    │
    плательщика страховых взносов -    │
           физического лица)           │
┌─────────────────────────────────────┐│
│                                     ││
└─────────────────────────────────────┘│
      (наименование организации,       │
       представителя плательщика       │
          страховых взносов -          │
           юридического лица)          │
                  ┌─┬─┐ ┌─┬─┐ ┌─┬─┬─┬─┐│
Подпись ____ Дата │ │ │.│ │ │.│ │ │ │ ││
                  └─┴─┘ └─┴─┘ └─┴─┴─┴─┘│
        М.П.                           │
  Документ, подтверждающий полномочия  │Дата пред-    ┌─┬─┐ ┌─┬─┐ ┌─┬─┬─┬─┐
       представителя плательщика       │ставления     │ │ │.│ │ │.│ │ │ │ │
           страховых взносов           │расчета <*>   └─┴─┘ └─┴─┘ └─┴─┴─┴─┘
┌─────────────────────────────────────┐│
│                                     ││________________     ______________
└─────────────────────────────────────┘│    (Ф.И.О.)           (Подпись)
 
    --------------------------------
    <*>   Указывается   дата   представления   Расчета   лично   или  через
представителя,  при отправке по почте - дата отправки почтового отправления
с описью вложения.

 

                           ┌─┬─┬─┐ ┌─┬─┬─┐ ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┐      ┌─┬─┬─┬─┬─┬─┐
           Регистрационный │ │ │ │-│ │ │ │-│ │ │ │ │ │ │ Стр. │ │ │ │ │ │ │
           номер в ПФР     └─┴─┴─┘ └─┴─┴─┘ └─┴─┴─┴─┴─┴─┘      └─┴─┴─┴─┴─┴─┘

Форма РСВ-1

Главная → Отчетность → Отчетность в ПФР → Форма РСВ-1

Плательщики страховых взносов, производящие выплаты физическим лицам, предоставляют в свое территориальное отделение Пенсионного фонда форму РСВ-1 и индивидуальные сведения (т.н. персонифицированную отчетность).

Полное название формы РСВ-1 – Расчет по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации, страховым взносам на обязательное медицинское страхование в Федеральный фонд обязательного медицинского страхования и территориальные фонды обязательного медицинского страхования плательщиками страховых взносов, производящими выплаты и иные вознаграждения физическим лицам.

В расчете РСВ-1 отражаются начисленные и уплаченные суммы по:
– СЧП (страховая часть пенсии)
– ПЧП (накопительная часть пенсии)
– ФФОМС (Федеральный фонд обязательного медицинского страхования)
– ТФОМС (территориальные фонды обязательного медицинского страхования)

Расчетным периодом для РСВ-1 является календарный год. Отчетными периодами признаются первый квартал, полугодие, девять месяцев, год. РСВ-1 сдается ежеквартально, данные идут нарастающим итогом с начала года.

Срок сдачи РСВ-1: до 15 числа второго месяца, следующего за отчетным периодом:
срок сдачи РСВ-1 за 1 квартал – до 15 мая;
срок сдачи РСВ-1 за полугодие – до 15 августа;
срок сдачи РСВ-1 за 9 месяцев – до 15 ноября;
срок сдачи РСВ-1 за год – до 15 февраля.

Организации, созданные в середине года, свою первую отчетность сдают после завершения квартала, в котором данная организация была создана.

Например, если организация была создана 14 апреля (это второй квартал), то первая отчетность в ПФР сдается за полугодие до 15 августа. Обратите внимание: несмотря на то, что организация создана 14 апреля, отчетность сдается за полугодие: с 1 января по 30 июня.

РСВ-1 в территориальное отделение Пенсионного фонда предоставляется в бумажном виде (в 2 экземплярах) с одновременным предоставлением информации на электронном носителе (на дискете или флешке).

В Пенсионный фонд одновременно сдается РСВ-1 и персонифицированный учет. Отдельно сдать РСВ-1 без сдачи персонифицированного учета нельзя. Исключение: сдача нулевой РСВ-1. В этом случае сотрудники фонда не требуют нулевые индивидуальные сведения.

Примеры заполнения РСВ-1

Справочник кодов тарифов плательщиков страховых взносов.
Пример расчета РСВ-1 за 1 квартал 2011 года.
Пример расчета РСВ-1 за полугодие 2011 года.
Пример расчета РСВ-1 за 9 месяцев 2011 года.

РСВ-1 в электронном виде

В 2012 году плательщики, среднесписочная численность работников которых за предшествующий календарный год более 50 человек, а также вновь созданные организации, у которых численность работников превышает данный лимит, должны представлять РСВ-1 в электронной форме с электронной цифровой подписью.

Отчетность в ПФР с 1 апреля

Управление Пенсионного фонда РФ по Кировскому району Приморского края информирует работодателей о том, что в Министерстве юстиции Российской Федерации зарегистрированы (регистрационный № 27441 от 04.03.2013г.) новая форма расчета (РСВ-1) по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации и на обязательное медицинское страхование в Федеральный фонд обязательного медицинского страхования плательщиками страховых взносов, производящими выплаты и иные вознаграждения физическим лицам, применяемая с 1 квартала 2013 года, а также Порядок её заполнения и Справочник кодов тарифов плательщиков страховых взносов.

Основные изменения заключаются в том, что форма РСВ-1 дополнена информацией по дополнительному тарифу для лиц, занятых на работах с вредными и опасными условиями труда, имеющими право на досрочное назначение пенсий. В частности, раздел 1 РСВ-1 дополнен столбцами 5 и 6: сведениями о начисленных и уплаченных страховых взносах, а раздел 2 сейчас состоит из 3 частей. Первая (2.1), как и прежде, содержит расчет страховых взносов по тарифу, а вторая и третья (2.2 и 2.3 – вновь введенные), содержат расчеты страховых взносов по дополнительному тарифу для отдельных категорий плательщиков, указанных в части 1 и части 2 статьи 58.3 Федерального закона от 24.07.2009 № 212-ФЗ.

Для сведения плательщиков-работодателей данные документы размещены на региональной странице официального сайта Пенсионного фонда Российской Федерации во вкладке «Работодателям региона. Отчетность и порядок ее заполнения» http://www.pfrf.ru/ot_primor/otchet/.

Здесь же можно найти и другие формы для сдачи отчетности: форму СЗВ-6-4 «Сведения о сумме выплат и иных вознаграждений, о начисленных и уплаченных страховых взносах на обязательное пенсионное страхование и страховом стаже застрахованного лица», форму АДВ-6-2 «Опись сведений, передаваемых страхователем в ПФР» (сопровождает отчетность страхователя за отчетный период) и форму АДВ-6-5 «Опись документов сведений о сумме выплат и иных вознаграждений, о начисленных и уплаченных страховых взносах и страховом стаже застрахованных лиц, передаваемых страхователем в ПФР».

Управление ПФР по Кировскому району Приморского края напоминает, что отчетная кампания в ПФР за 1-й квартал 2013 года начнется 1 апреля и продлится до 15 мая 2013г. включительно.

Страхователи, ведущие финансово-хозяйственную деятельность, обязаны будут представить в органы ПФР отчетность по страховым взносам в целом по предприятию по форме РСВ-1 и сведения персонифицированного учета на каждого своего работника (формы СЗВ-6-4, АДВ-6-2 и АДВ-6-5).

Страхователи, не ведущие деятельность, — только форму РСВ-1 с нулевыми значениями.

заполнение, сроки сдачи, бланк — Контур.Бухгалтерия

Отчет в Пенсионный фонд РФ сдается традиционно по форме РСВ-1. О ней и поговорим в этой статье.

Что такое РСВ-1?

Форма РСВ-1 является расчетом по начисленным и уплаченным страховым взносам с заработков сотрудников компаний и работников по договорам ГПХ на обязательные страхования (медицинское и пенсионное). Детально о расчете взносов и применяемых ставках мы писали в статье «Страховые взносы в ПФР, ФФОМС и ФСС в 2016 году».

Как заполнять РСВ-1?

Сама форма РСВ-1 и то, как ее заполнять, описано в официально утвержденном постановлении Правления ПФР от 16 января 2014 г. № 2п.

В этот документ 4 июня 2015 года согласно постановлению Правления ПФР от 04.06.2015 № 194 п были внесены изменения.

Нововведения связаны со изменениями в порядке расчета взносов. Так, с начала 2015 года уменьшилось количество компаний, которые имеют право на применение сниженных тарифов по страховым взносам. Кроме того, была отменена предельная база для взносов в Фонд медицинского страхования.

Отчет по форме РСВ-1 должны сдавать компании и ИП, если у них есть наемные работники. Если страхователь зарплату не начислял, то ему нужно сформировать и сдать нулевой расчет.

Сроки сдачи отчета по форме РСВ-1

Страховые взносы сдаются по периодам: в I квартале, за полугодие, за девять месяцев и за год. Бумажные отчеты РСВ-1 нужно сдать еще в течение полутора месяца после того, как отчетный период завершится, а электронные — в течение одного месяца и 20 дней. Сдадите позже — отчет не примут. Однако, если крайний срок сдачи попадает на нерабочие дни, то он автоматически сдвигается на ближайший рабочий день.

Сроки сдачи отчетность по форме РСВ-1 в 2016 году

  • за I квартал — до 16 мая бумажный или до 20 мая в электронный;
  • за 6 месяцев — до 15 августа бумажный или до 22 августа электронный;
  • за 9 месяцев — до 15 ноября бумажный или до 21 ноября электронный;
  • за весь 2016 год — до 15 февраля 2017 года бумажный или до 20 февраля 2017 года электронный.

В каком порядке заполнять РСВ-1?

Форма РСВ-1 — это титульный лист и последующие за ним шесть стандартных разделов.

Всем организациям без исключения нужно заполнить титульный лист и первые два раздела. Остальные разделы нужно заполнить и представить только в случае, если есть данные для них. В 

1 и 2 разделах содержится общая информация о заработке сотрудников организации, о тарифах взносов, о начисленных и уплаченных взносах на пенсионное и медицинское страхование.

Раздел 3 – заполняется компаниями с пониженными тарифами страховых взносов. В этом разделе они подтверждают свое право на применение пониженного тарифа.

Раздел 4 – в нем содержатся данные о перерасчетах за прошлые отчетные периоды.

Раздел 5 – в нем содержится информация по выплатам и иным вознаграждениям, начисленным за деятельность, осуществляемую в студотряде по трудовым и гражданско-правовым договорам.

Раздел 6 – здесь описаны индивидуальные сведения по сотрудникам. На каждого сотрудника или работающего по договору ГПХ заполняется отдельная страница, содержащая сведения о заработке, начисленных страховых взносах в ПФР, а также о страховом стаже за три последних месяца отчетного период.

Остались вопросы? Смотрите на вебинар по отчетности за 1 квартал 2016 года.

Бланк РСВ-1

На нашем сайте вы можете бесплатно скачать бланк формы РСВ-1 по приведенной ниже ссылке:

Автор статьи: Наталья Потапкина

Ведите учет в Контур.Бухгалтерии — удобном онлайн-сервисе для расчета зарплаты и пособий и отправки отчетности в ФНС, ПФР, ФСС и Росстат. Сервис подходит для совместной работы бухгалтера и директора.

Попробовать бесплатно на 5 дней

Государственные услуги в Республике Татарстан. / Услуги / Предоставление страхователями, производящими выплаты и иные вознаграждения физическим лицам, отчетности по страховым взносам на обязательное пенсионное и обязательное медицинское страхование

Описание:


Предоставление плательщиками страховых взносов, производящим выплаты и иные вознаграждения физическим лицам расчетов по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации и на обязательное медицинское страхование в фонды обязательного медицинского страхования, по форме утверждаемой федеральным органом исполнительной власти.


Плательщики страховых взносов, производящие выплаты и иные вознаграждения физическим лицам ежеквартально, не позднее 15 числа второго календарного месяца следующего за отчетным периодом представляют в территориальное управление ПФР по месту регистрации расчет по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации и на обязательное медицинское страхование в фонды обязательного медицинского страхования (форма РСВ-1).


В случае прекращения деятельности организации в связи с ее ликвидацией, либо прекращения физическим лицом деятельности в качестве индивидуального предпринимателя, до конца расчетного периода плательщики страховых взносов обязаны до дня подачи в регистрирующий орган заявления о государственной регистрации юридического лица в связи с его ликвидацией либо заявления о государственной регистрации прекращения  физическим лицом деятельности в качестве индивидуального предпринимателя представить в территориальное управление ПФР по месту регистрации расчет по начисленным и уплаченным страховым взносам за период с начала расчетного периода по день представления расчета включительно.


Представление работодателем в территориальный орган ПФР расчета по начисленным и уплаченным страховым взносам  возможно:


-в бумажном виде в сопровождении магнитного носителя, содержащего электронные формы документов;


-в электронном виде по электронным каналам связи, заверенные электронной подписью. В этом случае наличие   бумажных носителей не требуется.


Программные продукты для заполнения отчетности размещены на сайте www.pfrrt.ru, в разделе «Взаимодействие»


Работодатели, среднесписочная численность работников которых за предшествующий календарный год превышает 50 человек, а также вновь созданные организации, численность работников которых превышает указанное количество, представляют расчеты в террриториальный орган ПФР в электронном виде.

Расчётное время:

1 день

Результат предоставления услуги:

В случае представления на бумажных носителях — проставление специалистом ПФР подписи и даты принятия документа.
Специалист ПФР, осуществляющий прием РСВ, заполняет раздел «Сведения о предоставлении расчета» в представленном плательщиком расчете, в том числе на экземпляре РСВ плательщика, ставит свою подпись и дату принятия. Возвращает экземпляр плательщику страховых взносов или его представителю.

В случае представления в электронном виде по электронным каналам связи — протокол представления расчета.

Внесение данных расчета в базу данных ПФР.

Основания для отказа:

отсутствие в полях формы РСВ-1 информации обязательной для заполнения

Способы обжалования:

Акты органа контроля за уплатой страховых взносов, действия его должностных лиц могут быть обжалованы в вышестоящий орган контроля за уплатой страховых взносов — Отделение ПФР (вышестоящему должностному лицу) или в суд.
Жалоба в вышестоящий орган контроля за уплатой страховых взносов или вышестоящему должностному лицу этого органа подается в письменной форме.
Жалоба подается в течении трех месяцев со дня, когда лицо узнало или должно было узнать о нарушении своих прав.

Предоставление документов в электронном виде

Получение программного обеспечения в территориальном органе ПФР по месту регистрации для предоставления документов в электронном виде

Заполнение расчета по начисленным и уплаченным страховым взносам

Заполнение расчета по начисленным и уплаченным страховым взносам в соответсвии с рекомендуемым порядком заполнения

Предоставление расчета по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное и медицинское страхование в территориальный орган ПФР

Предоставление расчета по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное и медицинское страхование в территориальный орган ПФР по месту регистрации страхователя, в том числе по телекомуникационным каналам связи

Прием расчета территориальными органами ПФР

Специалист  территориального органа ПФР проверяет:

— полномочия представителя плательщика страховых взносов,

— полноту представляемых документов,

— полноту и правильность заполнения полей формы РСВ-1,

— регистрирует факт представления РСВ в базе данных ПФР,

— заполняет раздел «Сведения о представлении расчета» в представленном РСВ, в том числе на экземпляре плательщика, и возвращает плательщику страховых взносов или его представителю

Ввод данных, отраженных в расчете в базу данных ПФР

Ввод данных, отраженных в расчете, представленном плательщиком, в базу данных ПФР 

ПоказатьСкрыть перечень документов, требуемых от заявителя
  • Паспорт
    • Оригинал, 1 шт.
  • Документ, удостоверяю­щий полномочия предста­вителя юридического лица
    • Оригинал, 1 шт.
    • Комментарий: паспорт или иной документ удостоверяющий личность представителя плательщика; доверенность, подтверждающая полномочия представителя
  • Расчёт по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации, страховым взносам на обязательное медицинское страхование в Федеральный фонд обязательного медицинского страхования платель
    Скачать
  • Услуга предоставляется на безвозмездной основе:
  • «Об обязательном пенсионном страховании в Российской Федерации» (Федеральный закон от 15 декабря 2001 г. N 167-ФЗ)
    Скачать
  • «О страховых взносах в Пенсионный фонд Российской Федерации, Фонд социального страхования Российской Федерации, Федеральный фонд обязательного медицинского страхования и территориальные фонды обязательного медицинского страхования» (Федеральный закон от 24 июля 2009 г. N 212-ФЗ)
    Скачать

Пенсионный фонд РФ публикует новую форму РСВ-1 — Новости

Пенсионный фонд Российской Федерации разместил на сайте (www.pfrf.ru) форму отчетности, которая будет представляться работодателями в органы ПФР, начиная с I квартала 2014 года.
На сайте ПФР в разделе «Законодательство» − «Администрирование страховых взносов» размещены:
— постановление Правления ПФР от 16.01.2014 № 2п «Об утверждении формы расчета по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации и на обязательное медицинское страхование в Федеральный фонд обязательного медицинского страхования плательщиками страховых взносов, производящими выплаты и иные вознаграждения физическим лицам, и Порядка ее заполнения»;
— форма РСВ-1, действующая с 01.01.2014;
— Порядок заполнения формы РСВ-1;
— коды тарифов плательщиков страховых взносов. Таблица соответствия тарифов страховых взносов и кода категории застрахованного лица;
— классификатор параметров, используемых при заполнении персонифицированных сведений.
В РСВ-1 учтены особенности уплаты страховых взносов по дополнительным тарифам с учетом принятия ряда федеральных законов, затрагивающих администрирование страховых взносов, в том числе, дифференциация размеров дополнительных тарифов в зависимости от установленного по результатам специальной оценки условий труда, класса (подкласса) условий труда.*
В состав РСВ-1 включены сведения персонифицированного учета на каждое застрахованное лицо — работника организации (работающее по трудовым или гражданско-правовым договорам). Определение суммы страховых взносов по обязательному пенсионному страхованию на финансирование страховой и накопительной части трудовой пенсии в отношении застрахованных лиц будет производиться Пенсионным фондом Российской Федерации на основе данных индивидуального (персонифицированного) учета с учетом выбора застрахованными лицами варианта пенсионного обеспечения (0% или 6% на финансирование накопительной части трудовой пенсии).**
Новые версии программ для подготовки и проверки отчетности согласно новым форматам данных будут размещены на интернет-странице Отделения ПФР по Свердловской области www.pfrf.ru/ot_sverdlov и на «гостевых» компьютерах во всех территориальных управлениях ПФР.
Сроки представления отчетности не изменились. РСВ-1 представляется в территориальные органы ПФР по месту регистрации ежеквартально не позднее 15-го числа второго календарного месяца, следующего за отчетным периодом (кварталом, полугодием, девятью месяцами и календарным годом).

* Федеральный закон от 28.12.2013 № 426-ФЗ «О специальной оценке условий труда», Федеральный закон от 28.12.2013 № 421-ФЗ «О внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации в связи с принятием Федерального закона «О специальной оценке условий труда».
** Федеральный закон от 04.12.2013 № 351-ФЗ «О внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации по вопросам обязательного пенсионного страхования в части права выбора застрахованными лицами варианта пенсионного обеспечения»

 

В 2014 году плательщики страховых взносов будут отчитываться в ПФР по единой форме отчетности

Утверждена новая Единая форма отчетности, по которой плательщики будут отчитываться, начиная с отчетного периода I квартал 2014 года. Данная форма  объединила в себе отчетность по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование и на обязательное медицинское страхование в целом по организации и сведения индивидуального персонифицированного учета по каждому отдельному работнику.

Переход к единой форме отчетности осуществлен с целью снижения административной нагрузки на плательщиков страховых взносов
Единая форма отчетности вводится для всех категорий страхователей – плательщиков страховых взносов на ОПС и ОМС, осуществляющих выплаты и иные вознаграждения физическим лицам. I квартал 2014 года – это первый отчетный период, по которому страхователи будут отчитываться по новой форме отчетности.
Напомним, что с 1 января 2014 года изменился порядок перечисления страховых взносов в Пенсионный фонд РФ. Федеральным законом от 04.12.2013 г. N 351-ФЗ «О внесении изменений в отдельные законодательные акты Российской Федерации по вопросам обязательного пенсионного страхования в части права выбора застрахованными лицами варианта пенсионного обеспечения» были внесены изменения в Федеральный закон от 15.12.2001г. N 167-ФЗ «Об обязательном пенсионном страховании в Российской Федерации». С 1 января 2014 года  в соответствии со вступившим в силу законом уплата страховых взносов на обязательное пенсионное страхование за расчетные периоды с 2014 года осуществляется плательщиком страховых взносов единым расчетным документом без разделения на страховую и накопительную части трудовой пенсии. 
При разработке единой формы отчетности РСВ-1 Пенсионным фондом учтены изменения в законодательстве о страховых взносах, таким образом, в единой форме отчетности за периоды с 2014 года:
-в индивидуальных сведениях, представляемых страхователем, не указывается сумма уплаченных страховых взносов;
-отражается уплата страховых взносов за периоды с 2014 года единым расчетным документом без выделения страховой и накопительной части (уплата на КБК страховой части): 
-392 1 02 02010 06 1000 160 —  для работодателей;
-392 1 02 02140 06 1000 160 — для плательщиков, уплачивающих страховые взносы за себя (индивидуальные предприниматели, главы КФХ, адвокаты, нотариусы и т.д.). 
Обращаем внимание, что при уплате платежей в счет погашения недоимки по страховым взносам и задолженности по пеням и штрафам за периоды до 2014 года в платежных поручениях указываются те же КБК, которые использовались для уплаты страховых взносов, погашения недоимки по страховым взносам, задолженности по пеням и штрафам, до 2014 года.
Порядок уплаты на обязательное медицинское страхование не изменен. В платежном поручении (квитанции) указывается КБК 392 1 02 02101 08 1011 160, используемый для периодов с 2012 года.
-выделение страховой и накопительной части с учетом возрастной категории застрахованного лица, принадлежности к гражданству и выбора варианта пенсионного обеспечения будет производиться Пенсионным фондом России по сведениям данных персонифицированного учета;
-отражение задолженности по страховым взносам, доначисление и уплата страховых взносов за периоды 2010-2013 годов;
-новый подраздел 2.4 формы отражает особенности уплаты страховых взносов по дополнительным тарифам по результатам проведения специальной оценки условий труда.
Единая форма отчетности позволит плательщикам страховых взносов обеспечить представление сведений о начисленных и уплаченных страховых взносах в целом по организации и сведений персонифицированного учета по застрахованным лицам, исключая их несоответствие.
При приеме отчетности территориальными органами ПФР Единая отчетность будет проверяться программным комплексом. По итогам проверки предполагается формирование единого протокола для плательщика страховых взносов, отражающего правильность заполнения отчетности.
ПФР совместно с разработчиками программного обеспечения планируют в марте обеспечить плательщиков страховых взносов бесплатными программами: программой  подготовки данных и проверочной программой в целях оказания содействия в подготовке единой отчетности в ПФР. Все вспомогательные программы по мере их готовности будут размещаться на сайте ПФР в свободном доступе, а также в Кабинете плательщика – электронном сервисе ПФР для плательщиков страховых взносов.        Плательщики страховых взносов из числа самозанятого населения по-прежнему освобождены от сдачи отчетности в ПФР за исключением глав крестьянско-фермерских хозяйств.

Новая форма отчетности утверждена Постановлением Правления ПФР от 16.01.2014 № 2п «Об утверждении формы расчета по начисленным и уплаченным страховым взносам на обязательное пенсионное страхование в Пенсионный фонд Российской Федерации, страховым взносам на обязательное медицинское страхование в Федеральный фонд обязательного медицинского страхования плательщиками страховых взносов, производящими выплаты и иные вознаграждения физическим лицам, и порядка ее заполнения», которое зарегистрировано в Министерстве юстиции Российской Федерации 18.02.2014 года и опубликовано в Российской газете №41 от 21.02.2014 года.
Изменено 08.08.2016 21:37:09 Просмотров:

Форма RSV-1 в RMS — SAP-документация

Вы используете юридический отчет RSV-1 для подготовки формы RSV-1 в формате, который требуется Пенсионному фонду России.

Раньше для подготовки формы RSV-1 необходимо было использовать только отчет RSV-1 (транзакция HRPADRU_RSV1 ). Для получения дополнительной информации см. Форму RSV-1 (HRULRSV1).

В RMS процесс подготовки формы RSV-1 отличается. Для подготовки отчетности требуются две транзакции:

Подготовка формы RSV-1

Процесс подготовки формы RSV-1 предполагает выполнение нескольких шагов в процессе обслуживания сеанса отчетности, а именно:

  1. Вы запускаете процесс открыв сеанс отчетности для области отчета, к которой принадлежит ваша организация.Затем для выбранного сеанса отчетности вы создаете новый логический отчет. Для получения подробной информации о сеансах отчетов и логических отчетах см. Уровень процесса.

  2. Вы запускаете агрегирование данных для отчета и сохраняете его в хранилище RMS с помощью расширенного отчета RSV-1. Для этого выберите Call Report в Reporting Session Maintenance. Транзакция HRPADRU_RSV1 была улучшена для поддержки функциональности RMS. Для юридических лиц, которые вы определили для обработки с помощью RMS (см. Раздел «Предварительные условия» ниже, чтобы узнать, как это сделать), эта транзакция автоматически активирует следующие режимы обработки данных RMS:

    • Сохранение данных отчета в RMS

    • Моделирование данных отчета

    Поведение при выборе данных расчета заработной платы отличается в этих режимах по сравнению с обработкой данных без RMS для отчета RSV-1.В RMS система обрабатывает все коды видов оплаты в режиме «как заработано» (с использованием for-period вместо in-period). Сохранить данные отчета в RMS выбирает данные в соответствии с параметрами экрана выбора и сохраняет эти данные в хранилище RMS. Вы запускаете этот режим, чтобы агрегировать данные для формы RSV-1, которую вы собираетесь отправить. Для этого выберите соответствующий отчетный период на экране выбора. Для сотрудников, данные которых были изменены задним числом для ранее представленных отчетных периодов, необходимо также выбрать Сохранить данные отчета в RMS для каждого из этих периодов, чтобы создать формы корректировки.Эти формы исправлений автоматически включаются в обрабатываемый в настоящий момент логический отчет.

    Вы можете одновременно запустить несколько экземпляров отчета RSV-1 в режиме сохранения для дискретных списков сотрудников организации, чтобы ускорить подготовку юридической формы. Моделирование данных отчета работает как режим сохранения, объединяя данные из основных данных и результатов расчета за выбранный период. Однако, в отличие от Save Report Data в RMS, он не сохраняет агрегированные данные в хранилище RMS.Режим моделирования позволяет предварительно просмотреть агрегированные данные для сохранения в хранилище RMS с помощью Сохранить данные отчета в RMS.

  3. Операции с логическим отчетом выполняются с помощью транзакции «Ведение сеанса отчетов». После объединения и сохранения данных отчета в хранилище RMS необходимо выполнить несколько операций с отчетом, чтобы завершить подготовку. Во-первых, вы должны выполнить операцию импорта балансов. Он объединяет параметры RSV-1, значения которых должны быть кумулятивно рассчитаны с начала текущего отчетного периода, например, параметр Расчетные взносы на социальное страхование с начала текущего периода .После этого вам необходимо выполнить операцию Create Batches. При этом сохраненные данные разбиваются на пакеты в соответствии с законодательными требованиями RSV-1.

  4. Вы закрываете логический отчет и загружаете форму RSV-1 в одном из юридических форматов с помощью Reporting Session Maintenance.

Дополнительные сведения о транзакции обслуживания сеанса отчетов см. В разделе «Обслуживание сеанса отчетов».

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) у детей

Не то, что вы ищете?

Что такое респираторно-синцитиальный вирус (РСВ) у детей?

RSVis вирусное заболевание, вызывающее такие симптомы, как затрудненное дыхание.Его самая частая причина воспаления мелких дыхательных путей в легких (бронхиолит) и пневмония у младенцев.

Что вызывает RSV у ребенка?

RSV передается при контакте ребенка с жидкостью из нос или рот инфицированного человека. Это может произойти, если ребенок прикоснется к зараженному предмету. поверхность и касается его или ее глаз, рта или носа.Это также может произойти при вдыхании капли от чихания или кашля инфицированного человека.

Какие дети подвержены риску RSV?

Ребенок более подвержен риску RSV, если: он или она находится рядом с другими людьми с вирусом. RSV часто возникает при ежегодных вспышках. в сообщества, классы и центры по уходу за детьми. RSV чаще встречается зимой и рано весенние месяцы.

RSV может повлиять на человека любого возраст, но вызывает большинство проблем для очень молодых и очень старых. Большинство младенцев были инфицированы хотя бы один раз к 2 годам. Младенцы также могут быть повторно инфицированы с вирусом. Заражение может повториться в любой момент на протяжении всей жизни. Инфекция RSV в Детям старшего возраста и взрослым может показаться приступом тяжелой астмы. Рожденные младенцы преждевременно или с заболеваниями сердца, легких или иммунной системы подвержены повышенному риску более тяжелая болезнь.

Какие симптомы RSV у ребенка?

Симптомы проявляются примерно через 2-5 дней. после контакта с вирусом.

Ранняя фаза RSV у младенцев а у маленьких детей часто бывает легким, как простуда. У детей младше 3 лет болезнь может перейти в легкие и вызвать кашель и хрипы. У некоторых детей в инфекция переходит в тяжелое респираторное заболевание.Вашему ребенку может потребоваться лечение в в больницу, чтобы помочь с дыханием.

Наиболее частые симптомы RSV включают:

  • Насморк
  • Лихорадка
  • Кашель
  • Короткие периоды без дыхания (апноэ)
  • Проблемы с едой, питьем или глотание
  • Свистящее дыхание
  • Расширение ноздрей или напряжение груди или живота при дыхании
  • Дыхание быстрее обычного, или затрудненное дыхание
  • Посинение вокруг губ и кончики пальцев

Симптомы RSV могут казаться как и другие состояния здоровья.Убедитесь, что ваш ребенок посещает своего врача. для диагностики.

Как диагностируют RSV у ребенка?

Медицинский работник спросит о симптомах вашего ребенка и история здоровья. Он или она также может спросить о недавнем заболевании в вашей семье или Другие дети в детском саду или школе. Он или она проведет медицинский осмотр вашего ребенка. Ваш ребенку также могут быть сданы анализы, такие как мазок из носа или мазок для промывания.Это безболезненный тест на Смотреть на вирус в жидкости из носа.

Как лечится РСВ у ребенка?

Лечение будет зависеть от вашего симптомы ребенка, возраст и общее состояние здоровья. Это также будет зависеть от того, насколько серьезным состояние есть.

Антибиотики не используются для лечения RSV. Лечение RSV проводится для облегчения симптомов.Лечение может включать:

  • Больше жидкостей. Очень важно Убедитесь, что ваш ребенок пьет много жидкости. При необходимости ваш ребенок получит внутривенная (IV) линия для введения жидкости и электролитов.
  • Кислород. Это дополнительный кислород, поступающий через маску, носовые канюли или кислородную палатку.
  • Отсасывание слизи. Тонкая трубка ввести в легкие, чтобы удалить лишнюю слизь.
  • Бронходилатирующие препараты. Эти могут использоваться для открытия дыхательных путей вашего ребенка. Их часто вводят в виде аэрозольного тумана. маску или через ингалятор.
  • Питание через зонд. Это можно сделать, если ребенок плохо сосет.Тонкую трубку вводят через нос ребенка в желудок. Жидкое питание отправляется по трубке.
  • Механическая вентиляция. Ребенок, который очень болен, может потребоваться поставить дыхательный аппарат (вентилятор), чтобы помочь с дыхание.
  • Противовирусные препараты. Некоторые дети с тяжелыми инфекциями мая необходимость лечение противовирусным препаратом лекарства.

Обратитесь в медицинский центр вашего ребенка о рисках, преимуществах и возможных побочных эффектах всех видов лечения.

Какие возможные осложнения РСВ у ребенка?

У младенцев из группы высокого риска RSV может привести к тяжелому респираторному заболеванию и пневмония. Это может стать опасным для жизни. РСВ в младенчестве может быть связан с астмой потом в детстве.

Как я могу предотвратить РСВ у моего ребенка?

Американская академия педиатрии (AAP) рекомендует детям с высоким риском RSV принимать лекарство под названием паливизумаб. Просить лечащий врач вашего ребенка, если ваш ребенок подвержен высокому риску заражения RSV. Если да, спросите о ежемесячные инъекции во время сезона RSV, чтобы предотвратить заражение.

Чтобы снизить риск RSV, AAP рекомендует всем младенцам, особенно недоношенным:

  • На грудном вскармливании
  • Беречь от контакта с курить
  • Не ходить в детский сад с большим количеством дети в первый зимний сезон
  • Не контактировать с больными

Также убедитесь, что участники моют руки или используют средство для мытья рук на спиртовой основе до и после прикосновения ребенок с RSV.

Когда мне следует позвонить поставщику медицинских услуг для моего ребенка?

Позвоните врачу, если у вашего ребенка:

  • Симптомы, которые не проходят или не ухудшаются
  • Новые симптомы

Основные сведения о РСВ у детей

  • RSV — вирусное заболевание, вызывающее затрудненное дыхание.Чаще встречается в зимние и ранние весенние месяцы.
  • Большинство младенцев были инфицированы в хотя бы один раз к 2 годам. Младенцы также могут быть повторно инфицированы вирус. Заражение может повториться в любой момент на протяжении всей жизни.
  • Лечение RSV может включать дополнительные кислород. Это дополнительный кислород, поступающий через маску, носовые канюли или кислородную палатку. А ребенку, который очень болен, возможно, потребуется поставить дыхательный аппарат (вентилятор), чтобы помочь с дыханием
  • У детей из группы высокого риска RSV может привести к тяжелые респираторные заболевания и пневмония.Это может стать опасным для жизни. RSV как а ребенок может быть связан с астмой в более позднем детстве.
  • Младенцы с высоким риском РСВ получают лекарство под названием паливизумаб. Спросите у врача, есть ли у вашего ребенка в высокий риск RSV.

Следующие шаги

Советы, которые помогут получить максимальную отдачу от Посещение лечащего врача вашего ребенка:

  • Знайте причину визита и что вы хотите, чтобы это произошло.
  • Перед визитом запишите вопросы, на которые вы хотите получить ответы.
  • При посещении запишите имя новый диагноз и любые новые лекарства, методы лечения или тесты. Также запишите любые новые инструкции, которые дает ваш врач для вашего ребенка.
  • Знайте, почему новое лекарство или лечение прописан и как это поможет вашему ребенку.Также знаю, какие побочные эффекты находятся.
  • Спросите, может ли состояние вашего ребенка лечили другими способами.
  • Знайте, почему тест или процедура рекомендуются и что могут означать результаты.
  • Знайте, чего ожидать, если ваш ребенок это сделает Не принимайте лекарства, не проходите анализы или процедуры.
  • Если у вашего ребенка будет наблюдение о назначении, запишите дату, время и цель визита.
  • Узнайте, как можно связаться с детским провайдер в нерабочее время. Это важно, если ваш ребенок заболел и у вас вопросы или нужен совет.
Не то, что вы ищете?

RSV | Часто задаваемые вопросы

Ресурсы для отчетов Home Data

Q . Что такое респираторно-синцитиальный вирус (РСВ)? Что значит RSV причина?
А
.RSV — респираторный вирус, поражающий легкие и дыхательные пути. Хотя это может повлиять на кого угодно, обычно считается, что RSV как наиболее частая причина инфекций нижних дыхательных путей у младенцев и маленькие дети. Ежегодно около 57 527 детей в возрасте до 5 лет госпитализированы из-за инфекции RSV в США.

Q . Каковы симптомы инфекции RSV?
А
. Симптомы RSV похожи на другие респираторные инфекции.Болезнь начинается с 4 до 6 дней после контакта с вирусом. У взрослых и детей старшего возраста типичный RSV Симптомы включают субфебрильную температуру, заложенность носа или насморк, кашель, боль в горле, головная боль, утомляемость и иногда хрипы. У детей младше 2 лет RSV может вызвать заболевание нижних дыхательных путей, такое как бронхиолит или пневмония; более тяжелые случаи могут привести к дыхательной недостаточности. Для людей с тяжелое заболевание, симптомы могут включать усиливающийся крупозный кашель, необычно быстрый дыхание, затрудненное дыхание и голубоватый цвет губ или ногтей вызвано низким уровнем кислорода в крови.RSV может вызвать инфекции среднего уха (средний отит) у детей дошкольного возраста.

Q . Насколько распространен РСВ?
А
. Инфекции RSV встречаются повсеместно в мире, чаще всего при вспышках, которые могут длиться до 5 месяцев, с поздней осени через раннюю весну. Эпидемии RSV легко распространяются среди домашних хозяйств и детских садов. центры и школы.

Q . Кто может заразиться RSV?
А
. Большинство детей инфицированы хотя бы один раз к 2 годам и продолжать повторное заражение на протяжении всей жизни.RSV — это самая частая причина бронхиолита и пневмонии у детей младше 1 года возраста. Большинство детей, госпитализированных с RSV-инфекцией, не достигли возраст от шести месяцев. Пожилые (65 лет и старше), недоношенные младенцы, люди с хроническими заболеваниями легких или сердца или люди со слабым иммунная система подвержена более высокому риску развития серьезных заболеваний. Те, кто подвержены воздействию табачного дыма, посещают детский сад, живут в тесноте или имеют братья и сестры школьного возраста также могут подвергаться более высокому риску.

Q . Как распространяется RSV?
А
. Вирус обнаружен в выделениях из носа и горла инфицированного человека. Люди могут заразиться RSV через вдыхание капель после кашля инфицированного человека; из рук в рот контакт после прикосновения к инфицированному человеку; и руками в рот после прикосновения поверхность, которой коснулся или кашлянул инфицированный человек. Период времени от контакта с болезнью обычно проходит от 4 до 6 дней.После заражения человек может быть заразным от 3 до 8 дней. Однако некоторые младенцы и люди с ослабленная иммунная система может распространять вирус до 4 недель.

Q . Как можно предотвратить RSV?
А
. Есть шаги, которые вы можете принять, чтобы предотвратить распространение RSV. Если у вас симптомы простуды:

  • Прикрывайте рот и чихайте салфеткой, рукавом или локтем.
  • Мойте руки часто и правильно (водой с мылом в течение 20 секунд).
  • Избегайте совместного использования чашек и посуды с другими людьми.
  • Не целовать других людей.
  • Очистите загрязненные поверхности, такие как дверные ручки и столешницы, с помощью дезинфицирующее средство.

Другие шаги, которые могут быть предприняты для предотвращения распространения RSV:

  • Оставайтесь дома, когда вы больны.
  • Избегайте контакта с больными, особенно с простудными симптомы. По возможности, родителям младенцев из группы высокого риска следует избегать скопления людей.
  • Ограничьте время, которое дети из группы высокого риска проводят в школе или детском саду центр во время сезона RSV.

Q . Что мне делать, если я думаю, что у кого-то в моей семье есть RSV?
А
. Проконсультируйтесь со своим врачом. Любые затруднения дыхания у младенца следует рассматривать как чрезвычайную ситуацию, поэтому немедленно обратитесь за помощью.

Q . Как диагностируются инфекции RSV?
А
. Диагноз обычно делается на основе симптомов ребенка (клинический диагноз), особенно если он или она простужены и хрипят.RSV может быть подтвержден проверка на вирус в образцах из носоглотки или путем выращивания вируса из мазки из носа, смывы из носа или выделения из трахеи.

Q . Как лечат инфекции RSV?
А
. В настоящее время нет вакцина для предотвращения заражения RSV. Исследователи работают над созданием RSV вакцина. Поскольку инфекция RSV часто разрешается сама по себе, лечение легкой Симптомы не нужны большинству людей. Для младенцев и детей, находящихся в высокий риск развития тяжелой формы РСВ, профилактические препараты доступны.Родители недоношенного ребенка, имеющего хроническое заболевание легких или сердца или слабая иммунная система должна обратиться к своему врачу или поставщику медицинских услуг. Антибиотики бесполезны при лечении RSV или других вирусных заболеваний. болезнь.

Q . Стоит ли мне беспокоиться о RSV, когда я выезжаю из страна?
А
. RSV распространен во всем мире, но никаких дополнительных мер предосторожности нет. нужен во время путешествий. Количество инфекций обычно достигает пика поздней осенью. зимой и ранней весной в США и Европе.В тропическом климате эпидемии случаются в сезон дождей.

Препарат, отверждающий конденсат, блокирует репликацию RSV in vivo

Дизайн и синтез аналогов CPM

В качестве исходного материала использовали CPM (Selleck) на основе кристаллической структуры комплекса CPM – SMO (PDB 4JKV и PDB 4O9R) 14 , где показаны полярные взаимодействия 3′-гидроксильной группы A-кольца с аминокислотами внеклеточного домена рецептора SMO. Мы разработали аналоги, показанные на рис.1а и расширенные данные рис. 1. Синтез был выполнен в WuxiAppTec. К раствору, содержащему СРМ (600 мг, 1,46 мМ, 1,0 экв.) В метаноле (5 мл), добавляли Boc 2 O (382,37 мг, 1,75 мМ, 402,49 мкл, 1,20 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 20 ° C в течение 16 часов. Тонкослойная хроматография (ТСХ) (петролейный эфир / этилацетат (PE / EtOAc) = 3/1, фактор удерживания (Rf) = 0,45, KMnO 4 ) не показала исходного материала. Растворитель удаляли, чтобы получить остаток. Остаток очищали колоночной хроматографией на силикагеле (PE / EtOAc = 10/1) с получением промежуточного соединения (550 мг, 1.07 мМ, выход 73,62%) в виде белого твердого вещества, которое было названо СРМ-IM-1 (промежуточный продукт 1). Затем к раствору CPM-IM-1 (250 мг, 488,54 мкМ, 1,0 экв.) В THF (4 мл) добавляли NaH (39,08 мг, 977,08 мкМ, чистота 60%, 2,0 экв.) При 20 ° C. Реакционную смесь перемешивали при 60 ° C в течение 20 минут. MeI (346,72 мг, 2,44 мМ, 152,07 мкл, 5,0 экв.) Добавляли к реакционной смеси и перемешивали при 60 ° C в течение 2 часов. ТСХ (PE / EtOAc = 3/1, Rf = 0,70, KMnO 4 ) не показала исходного материала. Реакционную смесь разбавляли водой (40 мл), экстрагировали EtOAc (25 мл × 2), промывали рассолом (30 мл), сушили над Na 2 SO 4 и концентрировали с получением сырого продукта.Неочищенный продукт очищали колоночной хроматографией на силикагеле (PE / EtOAc = 10/1) с получением промежуточного продукта 2 (CPM-IM-2; 250 мг, 475,50 мкМ, выход 48,67%) в виде белого твердого вещества. Затем к раствору CPM-IM-2 (150 мг, 285,3 мкМ, 1,0 экв.) И 2,6-лутидина (91,71 мг, 855,90 мкМ, 99,68 мкл, 3,0 экв.) В DCM (3,00 мл) TMSOTf (95,12 мг, 427,95 мкМ, 77,33 мкл, 1,50 экв.) при 0 ° C. Реакционную смесь перемешивали при 0 ° C в течение 30 минут. ТСХ (PE / EtOAc = 3/1, Rf = 0,00, KMnO 4 ) не показала исходного материала.Реакционную смесь разбавляли насыщенным NaHCO 3 (30 мл), экстрагировали EtOAc (30 мл × 2), промывали рассолом (30 мл), сушили над Na 2 SO 4 и концентрировали с получением неочищенного продукта. продукт. Неочищенный продукт очищали препаративной ВЭЖХ (NH 4 HCO 3 ) с получением A3M (13,0 мг, 30,54 мкМ, выход 10,70%) в виде белого твердого вещества. A3E и A3P были синтезированы с использованием той же процедуры, что показана на рис. 1.

клеток

клеток HEp-2 (ATCC, CCL-23) поддерживали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM).Номер АТСС CCL-23 получен из контаминанта клеток HeLa и рекомендуется для выращивания RSV. Клетки BSRT7 / 5 — клетки BHK-21, которые конститутивно экспрессируют РНК-полимеразу Т7 22 — поддерживались в MEM 19 Глазго. HH-сигнальный путь. Gli-зависимые клетки NIh4T3, экспрессирующие репортер люциферазы (BPS Bioscience, 60409), поддерживались в DMEM. Клетки выращивали в среде с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) с добавлением раствора пенициллин-стрептомицин.Кроме того, 0,5 мг / мл -1 генетицина добавляли к клеткам BSRT7 / 5 и клеткам NIh4T3, экспрессирующим Gli-зависимую люциферазу-репортер. Клетки выращивали в инкубаторе при 37 ° C в 5% CO 2 . Клеточные линии не были аутентифицированы. Клетки BSRT7 / 5 и HEp-2 дали отрицательный результат на микоплазму с использованием набора MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit (Lonza).

Штаммы вируса и спасение рекомбинантного вируса

Длинный штамм RSV (АТСС, VR-26) использовали для анализов на инфекцию. Рекомбинантные вирусы RSV-Luc, которые экспрессируют люциферазу светлячков, и RSV-M2-1-mGFP, которые экспрессируют M2-1, слитый с мономерным GFP, были получены, как описано ранее 19 .Рекомбинантный RSV, экспрессирующий репортерный ген люциферазы и кодирующий замену Arg-to-Lys в положении 151 в белке M2-1 (RSV-M2-1 (R151K) -Luc), был сконструирован с использованием вектора pACNR-rHRSV-Luc (доступ в GenBank). , KF713491.1) в качестве матрицы для амплификации семи фрагментов, покрывающих весь геном RSV. Фрагменты собирали вместе с фрагментом вектора p15A-Chl с использованием Gibson Assembly Master Mix (NEB, E2611). Были спасены рекомбинантный RSV-M2-1 (R151K) -Luc (доступ в GenBank, MW039343), RSV-P-BFP (доступ в GenBank, MT994243) и RSV-M2-1 (R151K) -P-BFP (доступ в GenBank, MT994242). с помощью обратной генетики и амплифицирован в клетках HEp-2, как описано ранее 19 .

Анализы ингибирования RSV

Клетки HEp-2 высевали по 5 × 10 4 клеток на лунку в 96-луночные планшеты накануне и инфицировали 10 4 бляшкообразующих единиц (БОЕ) RSV-Luc в наличие различных концентраций соединений. СРМ (Selleck, S1146), аналоги СРМ и GDC-0449 (также известный как Vismodegib; Selleck, S1082) солюбилизировали в ДМСО в концентрации 8 мМ, 8 мМ и 10 мМ соответственно. Соединения были дополнительно серийно разбавлены в DMEM, содержащей 0,25% ДМСО, до конечных концентраций в диапазоне от 20 мкМ до 0.0005 мкМ. В лунки с клеточным и вирусным контролем добавляли 0,25% ДМСО. Разведения соединений предварительно инкубировали с вирусными суспензиями в течение 5 минут при 37 ° C перед добавлением к клеточным монослоям в 96-луночных планшетах. Перед анализом планшеты инкубировали при 37 ° C в течение 24 ч для RSV – Luc. Люминесцентные показания выполняли с помощью люциферазной системы Bright Glo (Promega, E2610) и планшет-ридера Bioteck Synergy h2. Относительные световые единицы указывают на активность люциферазы относительно среднего контрольного значения (выраженного в процентах).IC 50 был определен как концентрация соединения, необходимая для достижения 50% снижения максимальной репликации вируса. Кроме того, анализы цитотоксичности проводили с помощью люминесцентного анализа жизнеспособности клеток CellTiter-Glo (Promega, G7570) после инкубации с соединениями для проверки жизнеспособности клеток. 50% цитотоксическая концентрация (CC 50 ) была определена как снижение люминесценции на 50% по сравнению с контрольными лунками. Значения IC 50 и CC 50 были рассчитаны путем подгонки данных к уравнению сигмоидальной кривой в программном обеспечении GraphPad (GraphPad Prism 5).

Изоляты RSV с минимальным лабораторным опытом

Первичные изоляты RSV были получены в Ганноверской медицинской школе, Германия, в 2013 и 2016 годах от детей с инфекциями дыхательных путей и с подтвержденным множественным RT – PCR диагнозом RSV-инфекции 23 . Клетки HEp-2 инокулировали мазком из носа, жидкостью из бронхиального лаважа или материалом мазка из зева в течение 4 ч при 37 ° C. После перехода на свежую среду клетки инкубировали и, при необходимости, пассировали в течение нескольких дней до тех пор, пока не стало видно сильное образование синцитиев.супернатант и клетки собирали, и ассоциированный с клеткой вирус высвобождали за три цикла замораживания-оттаивания в жидком азоте. Клеточный дебрис удаляли из среды центрифугированием при 1000 g и аликвоты супернатанта быстро замораживали в жидком азоте и хранили при -80 ° C. Вирусная РНК была выделена, подвергнута обратной транскрипции, и подтипы RSV (RSV A GA2, RSV A ON1 и RSV B) были определены секвенированием по Сэнгеру гена G-белка (или секвенированием следующего поколения полного вирусного генома) и сопоставлены с найденными известными последовательностями. с использованием Nucleotide BLAST.

Анализы для проверки антагонизма HH аналогов СРМ

Скрининг соединений на антагонизм HH проводили в BPS Bioscience с использованием репортерной системы Gli-люциферазы 24 . Вкратце, Gli-зависимые экспрессирующие репортер люциферазы клетки NIh4T3, стабильно трансфицированные Gli-зависимой плазмидой экспрессии люциферазы светлячка, высевали в белые 96-луночные микропланшеты и культивировали в течение ночи. Через 24 часа среду заменяли на Opti-MEM, содержащую разбавленные соединения, и клетки инкубировали в течение дополнительных 2 часов с последующим добавлением 1 мкг мл рекомбинантного мышиного белка SHH -1 .Необработанные клетки использовали в качестве контроля. После обработки в течение 24 часов клетки лизировали и проводили анализ люциферазы с использованием системы анализа люциферазы ONE-Step (BPS bioscience, 60690). Люминесценцию измеряли с помощью люминометра (ридер для микропланшетов BioTek SynergyTM 2). Репортерные анализы выполняли в трех экземплярах для каждой концентрации, а интенсивность люминесценции ( L ) анализировали с использованием Graphpad Prism. Интенсивность люминесценции в отсутствие соединения использовали в качестве положительного контроля ( L p ) и оценивали как 100%.Сигнал, зарегистрированный в отсутствие клеток ( L b ), был оценен как 0%. Процент люминесценции в присутствии каждого соединения рассчитывали согласно следующему уравнению: Люминесценция (%) = ( L L b ) / ( L p L b ) . Затем значения процента люминесценции для различных концентраций одного и того же соединения наносили на график с использованием нелинейного регрессионного анализа с последующим вычислением значения IC 50 .

Количественная оценка дезорганизации IB и IBAG после обработки соединением

Клетки HEp-2 выращивали на покровных стеклах и инфицировали RSV-M2-1-mGFP или RSV-M2-1 (R151K) -P-BFP при множественном инфицировании (MOI) 1. Через 24 часа после заражения клетки обрабатывали СРМ или A3E в указанных концентрациях в течение 1 часа. FISH выполняли, как описано ранее 3 . Вкратце, клетки фиксировали 4% формальдегидом в PBS (об. / Об.) В течение 10 минут при 4 ° C, а эндогенный биотин блокировали в PBS – 1% BSA (мас. / Об.) С добавлением свободного стрептавидина (4 мкг мл — 1 ) на 1 час.Покровные стекла инкубировали в гибридизационной смеси (2 × SSC, 300 мМ NaCl и 30 мМ цитрат натрия), 10% декстрана (мас. / Об.), 20% формамида (об. / Об.), 1 мг / мл -1 ДНК сперматозоидов сельди и 1 мкМ поли (dT) зонда в увлажненной камере при 37 ° C в течение 3 часов. После серийных промываний зонды были обнаружены путем инкубации клеток с конъюгатом стрептавидин-Alexa Fluor 647 (8 мкг мл -1 ) в PBS-1% BSA (вес / объем), а затем окрашены кроличьими поликлональными антителами против N 3 . Получение изображений стопки z примерно 50 инфицированных клеток для каждого состояния выполняли с использованием микроскопа WLL Leica SP8 с иммерсионным объективом 63 × и числовым увеличением × 2.Мечение специфических антител N использовали для автоматического обнаружения ИБ в программном обеспечении ImageJ с использованием функции анализа частиц и порогового значения размера> 3 мкм 2 . Затем присутствие IBAG (ов) оценивали вручную на основании сигналов M2-1 – mGFP (если уместно) и поли (A) РНК.

Эксперименты с покадровой микроскопией и фотообесцвечиванием

Эксперименты по визуализации живых клеток и FRAP проводили с использованием клеток HEp-2, высеянных в μ-чашки Ibidi с полимерным дном покровного стекла, инфицированных рекомбинантными вирусами (RSV – P – BFP, RSV –M2-1 (R151K) –P – BFP или RSV – M2-1 – mGFP) при высоком MOI в течение от 20 до 24 часов.Получение изображений осуществлялось с использованием инвертированного конфокального микроскопа Olympus FV3000 с масляным иммерсионным объективом 60 × и числовым увеличением × 2,5. Во время визуализации клетки поддерживали в камере с контролируемым климатом (37 ° C, 5% CO 2 ). Для анализа динамики ИБ изображения получали каждые 30 с в течение 15–30 мин с использованием клеток, обработанных в течение 1 ч 5 мкМ CPM или 25 мкМ A3E, или обработанных имитацией (ДМСО). Изображения и видео представляют десять видеороликов из двух экспериментов. Десять 15-минутных видеороликов из двух независимых экспериментов были проанализированы для количественной оценки событий слияния и подвижности IB.Редактирование изображений выполнялось с использованием программ ImageJ и Icy. IB были обнаружены с помощью плагина Spot Detector программного обеспечения Icy, а события слияния подсчитывались вручную. Максимальные скорости были получены с использованием плагина Spot Detector с опцией фильтрации по размеру и плагина Track Manager программного обеспечения Icy.

Для визуализации динамики IBAG после обработки CPM и A3E изображения получали каждые 6 с. Через 5 минут добавляли химическое соединение (5 мкМ CPM или 25 мкМ A3E) и снимали изображения в течение 20 минут.Видео представляют собой девять видео из трех независимых экспериментов.

Получение

FRAP выполняли через 1 час после добавления 5 мкМ CPM, 25 мкМ A3E или ДМСО (имитация, контроль). Все эксперименты FRAP были реализованы с использованием одних и тех же настроек: предварительное отбеливание 6 с, отбеливание 5 мс и пост-отбеливание 60 с при частоте кадров 1 изображение каждые 126 мс. Отбеливание выполняли в круговой области при 100% и 80% интенсивности лазера для GFP и BFP, соответственно. Целевые ИБ были близки к другим контрольным ИБ, которые использовали для коррекции потери флуоресценции из-за фотообесцвечивания.Средняя интенсивность флуоресценции как функция времени для каждой обесцвеченной области была получена с использованием программного обеспечения Icy. Интенсивность фона оценивалась путем измерения области вне клетки как можно дальше от мишени IB. Нормализация кривых восстановления была выполнена с использованием easyFRAP, отдельного приложения MATLAB 25 . Для каждого экспериментального условия было проведено два индивидуальных эксперимента, в которых было проанализировано 12 ИБ. Для получения изображений FRAP, представленных на рис.2, одно изображение было получено за 5 с до обесцвечивания, а интересующие области обесцвечивались лазерным лучом полной мощности в течение 10 мс. Затем изображения получали каждые 30 с (после первого изображения через 10 с). Редактирование изображений выполнялось с использованием программ ImageJ и Icy.

Характеристика площади и формы RSV IB

Клетки HEp-2, выращенные на покровных стеклах, инфицировали RSV – P – BFP при MOI = 1 в течение 24 часов и подвергали указанным обработкам (DMSO, CPM или A3E) в течение 1 часа. . Затем клетки фиксировали PBS – 4% формальдегида (об. / Об.) В течение 10 мин при комнатной температуре и повышали проницаемость с помощью PBS, содержащего 1% BSA (мас. / Об.) И 0.1% Triton X-100 (об. / Об.) В течение 10 мин. Клетки инкубировали в течение 1 ч с Hoechst 33342 (1 мкг мл -1 ) и после промывания в PBS покровные стекла помещали в антифадный реагент ProLong Diamond (Thermofisher). Получение изображений стопки z 100 клеток на условие из 2 независимых экспериментов было выполнено с использованием микроскопа WLL Leica SP8 с иммерсионным объективом 63 × и числовым увеличением × 2. Измерения формы и площади IB RSV выполнялись с помощью программного обеспечения ImageJ с использованием функции Analysis Particles.{2} \,} \) (где a, соответствует площади, а b — большой оси) каждого IB. Для множественных сравнений между различными группами обработок был проведен дисперсионный анализ Уэлча с последующим апостериорным тестом Геймса – Хауэлла с использованием статистического языка R (https://www.r-project.org/).

Чувствительность ИБ к осмотическому шоку и обработке 1,6-гександиолом

Клетки HEp-2 высевали на полимерные покровные стекла Ibidi μ-Dish и инфицировали RSV – P – BFP или RSV – M2-1 (R151K) –P –BFP с высоким MOI.Через 24 часа после заражения клетки подвергали воздействию 5 мкМ CPM или 25 мкМ A3E в течение 1 часа при 37 ° C. Получение изображений осуществлялось с помощью инвертированного конфокального микроскопа Olympus FV3000 с масляным иммерсионным объективом 60 × и числовым увеличением × 2,5. Клетки поддерживали в камере с контролируемым климатом (37 ° C, 5% CO 2 ) во время многопозиционной визуализации. В каждом эксперименте изучали пять отдельных положений, и одно изображение было получено перед обработкой в ​​двух независимых экспериментах. Гипотонический шок выполняли путем инкубации клеток в 10% MEM, разведенном в воде (об. / Об.), В течение 5 мин.Для изучения возможного восстановления ИБ после шока добавляли свежий 100% МЕМ, и клетки визуализировали каждые 1 мин в течение 5 мин. Для оценки чувствительности к 1,6-гександиолу клетки инкубировали с 10% 1,6-гександиолом (мас. / Об.) И визуализировали каждые 2 мин в течение 20 мин после обработки. Пороговая обработка изображений и обнаружение IB выполнялись автоматически в программном обеспечении Icy с использованием алгоритма пороговой кластеризации Otsu из плагина Best Threshold и плагина Spot Detector путем определения минимальной (0,8 мкм 2 ) и максимальной (50 мкм 2 ) ROI. размер.

Эксперименты по микроинъекции

Клетки HEp-2, посеянные на покровные стекла из полимера Ibidi μ-Dish, инфицировали RSV – P – BFP в течение 24 часов и подвергали воздействию CPM, A3E или DMSO в указанных концентрациях в течение 1 часа при 37 ° C. Микроинъекции клеток выполняли с помощью микроинъектора FemtoJet (Eppendorf), установленного на инвертированном микроскопе Olympus IX73, с использованием игл Femtotips II (Eppendorf). Тетраметилродамин-декстран (40 кДа и 70 кДа, Sigma-Aldrich) и Texas-Red-декстран (10 кДа, Sigma-Aldrich) получали в буфере для инъекций (48 мМ K 2 HPO 4 4.5 мМ KH 2 PO 4 , 14 мМ NaH 2 PO 4 , pH 7,2) при конечных концентрациях 6 мг / мл -1 . Декстраны массой 10, 40 и 70 кДа имеют гидродинамический радиус приблизительно 2–3 нм, 4–5 нм и> 6 нм соответственно 17 . Клетки были визуализированы через 2–5 минут после микроинъекции с использованием иммерсионного объектива 63x, и средние значения интенсивности флуоресценции каждой области (цитоплазма, конденсаты и фон) были получены с использованием программного обеспечения Icy.Средняя интенсивность флуоресценции каждой области корректировалась путем вычитания фона (область вне клетки).

Окрашивание тиофлавином S

Клетки HEp-2 выращивали на покровных стеклах, инфицировали RSV – P – BFP в течение 24 часов, а затем обрабатывали CPM, A3E или DMSO в указанных концентрациях при 37 ° C в течение 1 часа. Затем клетки фиксировали 4% формальдегидом в PBS (об. / Об.) И повышали проницаемость с помощью PBS, содержащего 1% BSA (мас. / Об.) И 0,1% Triton X-100 (об. / Об.), В течение 10 мин при комнатной температуре.Тиофлавин S (Sigma-Aldrich) растворяли в воде до 1% (мас. / Об.) И фильтровали перед использованием. Клетки инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре с 0,01% тиофлавина S в 10% FBS и 0,5% Tween-20 в PBS (об. / Об.). После серийных промывок 0,5% Tween-20 в PBS (об. / Об.) Ядра клеток окрашивали Hoechst 33342 (1 мкг мл -1 ). Амилоидные фибриллы PrP мыши адсорбировали на фиксированных клетках и обрабатывали параллельно в качестве положительного контроля амилоидных фибрилл в концентрации 1 мкМ. Получение изображения выполняли с использованием микроскопа WLL395 Leica SP8 с иммерсионным объективом 63 × и числовым увеличением × 4, а редактирование изображения выполнялось с помощью программного обеспечения Icy.

Анализ на основе проточной цитометрии для количественной оценки минимально испытанного в лабораторных условиях RSV

клеток HEp-2 высевали из расчета 2 × 10 4 клеток на лунку в 96-луночные планшеты за день до инокуляции вируса. Клетки инфицировали при MOI = 1 в присутствии соответствующего соединения. Через 2 часа супернатант удаляли и добавляли свежую среду, содержащую такую ​​же концентрацию соединения. Через 24 ч после инокуляции клетки один раз промывали PBS и отделяли обработкой трипсином.Клетки промывали, центрифугировали при 400 г , ресуспендировали в буфере для фиксации (0,5% PFA и 1% FBS в PBS) и инкубировали при 4 ° C в течение не менее 30 минут или хранили в течение ночи. Затем клетки подвергали проницаемости с помощью 0,1% сапонина и 1% FBS в PBS на льду в течение 20 минут. Очищенный супернатант мышиной гибридомы с фосфопротеином против RSV разбавляли 1: 500 в буфере для пермеабилизации и инкубировали с клетками на льду в течение 45 мин. 26 . Затем клетки один раз промывали 1% FBS в PBS и затем инкубировали с козьим вторичным антителом против мышиных Alexa 488 (ThermoFisher) в буфере для пермеабилизации в темноте на льду в течение 1 часа.После двух дополнительных промывок 1% FBS в PBS клетки ресуспендировали в буфере для фиксации и хранили при 4 ° C в течение ночи. Образцы анализировали с использованием фильтра ослабления 99% в проточном цитометре BD Accuri C6. Результаты были проанализированы с помощью FlowJo V10. FSC-A по сравнению с SSC-A использовали для гейтирования живых клеток. Живые клетки, которые имели более высокий сигнал FL1-A по сравнению с окрашенными, но неинфицированными клетками, считались RSV-положительными. Для каждой вирусной инфекции в присутствии соединения инфекцию нормализовали для инфицированных, обработанных ДМСО контрольных клеток.

Инфекция мышей и введение соединения

Самок мышей BALB / c (возраст приблизительно 8 недель) были приобретены в Centre d’Elevage R. Janvier. Мышей содержали в стандартных условиях с фильтрацией воздуха в помещении для животных, свободном от специфических патогенов, с использованием небеленого тканевого материала для гнездования, а воду и пищу предоставляли без ограничений. Перед началом экспериментов мышей акклиматизировали в течение 1 недели. Для экспериментов по заражению мышей содержали в клетках внутри отдельных изолирующих шкафов из нержавеющей стали, которые вентилировались под отрицательным давлением воздухом с высокоэффективной фильтрацией твердых частиц.Перед заражением мышей анестезировали смесью кетамина и ксилазина (1 мг и 0,2 мг на мышь соответственно) и инфицировали 50 мкл PBS, содержащего 6 × 10 4 БОЕ RSV-Luc или RSV-M2-1 ( R151K) –Luc через интраназальный путь инокуляции. Для введения соединения животным соединения растворяли в натрий-фосфатно-цитратном буфере (pH 3), содержащем 10% 2-гидропропил-β-циклодекстрина (мас. / Об.). Соединения вводили внутрибрюшинно в указанных дозах в объеме 200 мкл дважды в сутки.Контрольная группа получила только транспортное средство.

Измерения люминесценции in vivo

Для визуализации in vivo мышей анестезировали кетамином и ксилазином, но для ежедневных экспериментов по визуализации анестезию вызывали с помощью изофлурана в хорошо вентилируемой комнате и в системе очистки. Расчет размера выборки и рандомизации в этих экспериментах не проводился. Вкратце, мышей помещали в камеру (XGI-8, Caliper Life Sciences), включали наркозный блок с потоком 100% кислорода со скоростью 1.5–2 л мин. –1 , смешанный с примерно 4–5% (об. / Об.) Изофлураном, доставленным в анестезиологическую камеру. Затем глубоко анестезированным мышам вводили интраназальной инъекцией 50 мкл PBS, содержащего d-люциферин в дозе 0,75 мг, кг -1 . Через 2 мин мышей помещали спиной на планшет в системе визуализации IVIS 200 (Xenogen, Perkin Elmer) с носовым конусом, обеспечивающим 100% кислород, смешанный с примерно 1,5–2% (об. / Об.) Изофлураном. Программное обеспечение Living Image (версия 4.0, Caliper Life Sciences) использовалось для измерения активности люциферазы.Биолюминесцентные изображения получали в течение 1 мин с f / stop = 1 и binning = 8. Было создано цифровое изображение мыши с фотонной эмиссией в искусственных цветах, и фотоны были подсчитаны в пределах постоянной интересующей области, соответствующей поверхности грудной клетки. охватывая всю область дыхательных путей. Эмиссия фотонов измерялась как яркость в пс −1 см −2 sr −1 .

Гистопатология RSV-инфицированных мышей

Самок мышей BALB / c содержали в индивидуально вентилируемых клетках в лабораториях уровня биобезопасности 2 WuXi AppTec после карантина.Уход за животными и их использование соответствовали протоколу использования животных, одобренному WuXi IACUC (IACUC № ID01-QD029-2020v1.0).

Соединения (CPM или A3E) вводили в дозе 15 мг / кг -1 внутрибрюшинно два раза в день в течение 4 дней, начиная с 0 d.p.i. Мышей анестезировали смесью золетила 50 и ксилазина (30 мг на кг -1 и 6 мг на кг -1 соответственно) и инокулировали посредством интраназальной инъекции примерно 10 5 БОЕ в 50 мкл штамма RSV A2. Контрольная группа получила только транспортное средство.При 4 d.p.i. мышей умерщвляли, легочную ткань собирали и быстро замораживали в сбалансированном солевом растворе Хэнкса в объеме, равном десятикратному весу ткани (мас. / Об.) Для дальнейших анализов. Титрование вируса проводили, как описано ранее 13 . Супернатант тканевых гомогенатов или исходный вирус использовали для инфицирования клеток HEp-2 в 12-луночных планшетах. После 4-часовой инкубации клетки промывали и затем покрывали 0,625% легкоплавкой агарозой в DMEM с добавлением антибиотиков и 2% FBS, а затем инкубировали в течение 96 часов.Впоследствии клетки фиксировали 4% PFA в течение 30 минут при комнатной температуре, промывали, блокировали BSA при комнатной температуре в течение 1 часа и инкубировали в течение примерно 2–3 часов при комнатной температуре с моноклональными антителами к слитому белку мыши против RSV (Abcam. , ab94968) в 1 × TBS с последующей стадией промывки PBS – 0,02% Tween-20. Комплексы антиген-антитело выявляли путем инкубации клеток в течение 2–4 ч при комнатной температуре с вторичным козьим антителом, конъюгированным с мышиным HRP (Abcam, ab6728), в 1 × TBS. Затем клетки промывали PBS – 0.02% Твин-20 и покрытый 4CN (4-хлор-1-нафтол) и H 2 O 2 в течение 0,5 часа. Затем планшеты промывали водой и сушили для подсчета очагов. Конечные титры RSV выражены как log 10 -трансформированных БОЕ на грамм легкого.

Гистопатологический анализ мышей был проведен в WuxiAppTec. Брали дольки легочной ткани, фиксировали в 4% PFA в течение 24 ч перед переносом в 70% раствор этанола. Затем образцы залили парафином и разрезали на срезы толщиной 5 мкм.Срезы окрашивали гематоксилином и эозином и исследовали под широкоугольным микроскопом три независимых патолога, которые не знали, в какой группе животных лечили. Воспаление легких и отшелушивание регистрировали и оценивали полуколичественно. Степень патологических изменений оценивалась по минимальной, легкой, умеренной и выраженной шкале, соответствующей числам от 0 до 3.

Заявление об этике

Работа в этом исследовании in vivo проводилась в соответствии с руководящими принципами INRAE ​​в соответствии с европейскими стандартами. правила защиты животных.Протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию в Центре исследований Жуи-ан-Жоза (COMETHEA) при соответствующем разрешении учреждения (Ministère de l’éducation nationale, de l’enseignement supérieur et de la recherche). , номер авторизации 20151006112v1 (APAFIS # 1487)). Все экспериментальные процедуры проводились в учреждении с уровнем биобезопасности 2.

Краткое изложение отчета

Дополнительная информация о дизайне исследования доступна в Резюме отчета по исследованию природы, связанном с этим документом.

Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция (RSV)

Последняя редакция: октябрь 2011 г.

Что такое респираторно-синцитиальная вирусная инфекция?

Респираторно-синцитиальный вирус, или RSV, инфекция — респираторное заболевание, вызываемое вирусом.

Кто заражается RSV?

Заразиться может любой человек, но чаще всего RSV вызывает серьезные заболевания у младенцев и очень маленьких детей. Вирус также может вызывать серьезные заболевания у пожилых людей и людей с ослабленной иммунной системой.

Когда случаются инфекции RSV?

Инфекции RSV обычно возникают осенью и зимой.

Как распространяется RSV?

RSV передается через контакт с каплями из носа и горла инфицированных людей, когда они кашляют и чихают. RSV также может передаваться через высохшие выделения из дыхательных путей на постельном белье и подобных вещах. RSV может оставаться на твердых поверхностях в течение нескольких часов и на коже в течение более короткого времени.

Каковы симптомы инфекции RSV?

Типичные симптомы напоминают простуду.Однако инфекция RSV также может привести к пневмонии, особенно у очень молодых, очень старых или людей с ослабленной иммунной системой. Однако может возникнуть легкое или незаметное заболевание. Симптомы могут сохраняться от нескольких дней до нескольких недель.

Как скоро после контакта появляются симптомы?

Симптомы обычно появляются через четыре-шесть дней после заражения. Симптомы обычно развиваются медленно в течение нескольких дней. Период заразности обычно составляет менее 10 дней после появления симптомов, но иногда и дольше.

Как диагностируется инфекция RSV?

RSV обычно диагностируется по появлению типичных симптомов. Использование специальных лабораторных тестов часто ограничивается случаями тяжелого заболевания и специальными расследованиями вспышек.

Как лечить RSV-инфекцию?

Лекарство под названием рибавирин эффективно против RSV-инфекции, если его начать в первые несколько дней после появления симптомов. Поскольку инфекция RSV часто проходит сама по себе, для большинства людей лечение легких симптомов не требуется.Антибиотики не являются эффективным средством лечения вирусных заболеваний, таких как инфекция RSV (хотя у некоторых пациентов антибиотики могут использоваться для лечения бактериальных инфекций, которые осложнили инфекцию RSV у этого пациента).

Делает ли перенесенное заражение RSV иммунитетом человека?

Иммунитет после инфицирования RSV действительно возникает, но не сохраняется на всю жизнь. Известно, что имеют место повторные инфекции, хотя они могут быть более легкими. Продолжительность неизвестна.

Что можно сделать, чтобы предотвратить распространение RSV?

В настоящее время доступны два продукта, которые содержат антитела к RSV для предотвращения заражения RSV.Эти продукты назначаются один раз в месяц во время сезона RSV и рекомендуются некоторым детям из группы высокого риска. Когда инфекции RSV отмечаются в учреждении, таком как больница или дом престарелых, изоляция контактов (для минимизации передачи от человека к человеку) и мытье рук медицинскими работниками, как было показано, ограничивают распространение вируса. Как и при любом респираторном заболевании, всем людям следует прикрывать лицо при кашле и чихании.

Экспериментальная вакцина против респираторно-синцитиального вируса (RSV) вызывает сильный иммунный ответ

ОСТИН, Техас. Экспериментальная вакцина против респираторно-синцитиального вируса (РСВ), одной из основных причин смертности младенцев от инфекционных заболеваний, показала первые результаты в фазе 1 клинических испытаний на людях.Группа исследователей, включая Джейсона Маклеллана из Техасского университета в Остине, сообщила сегодня в журнале Science , что одна доза их вакцины-кандидата вызвала значительное повышение уровня RSV-нейтрализующих антител, которое сохранялось в течение нескольких месяцев.

Люди заражаются RSV на всех этапах жизни, но наиболее опасно для очень молодых и очень старых. Вирус вызывает пневмонию, бронхиолит и другие заболевания нижних дыхательных путей. Ежегодно миллионы людей заболевают RSV и более 100000 умирают, в основном в районах, где отсутствует доступ к современной медицинской помощи.Для младенцев в возрасте до 1 года RSV уступает только малярии по смертности от инфекционных заболеваний.

Барни Грэм и Питер Квонг из Национального института исследований вакцины против аллергии и инфекционных заболеваний (VRC) вместе с Маклелланом, бывшим докторантом в VRC, а ныне доцентом в UT Austin, возглавили разработку вакцины-кандидата DS. -Cav1.

Послушайте подкаст-интервью с Джейсоном Маклелланом, в котором рассказывается, как создавалась вакцина

Ученые пытались создать вакцину против RSV с использованием традиционных методов более 50 лет — и пока ни один из них не работал.Вместо этого Маклеллан и его коллеги использовали новый подход, названный конструкцией вакцины на основе структуры.

Уже было известно, что определенная часть RSV, называемая белком F, запускает иммунную систему человека для выработки антител. Но белок F изменяет форму — прежде чем он заразит клетку, он принимает одну форму, а затем во время заражения принимает вторую форму. Если иммунная система сталкивается с вирусом RSV с белком F в первой форме, она вырабатывает мощные антитела. Но если белок имеет вторую форму, вырабатывается меньше антител, и они не очень эффективны.Производство вакцин против RSV с использованием традиционных методов обычно приводит к белкам F во второй форме и плохому ответу антител.

Вот где приходит на помощь подход, основанный на структуре. Во-первых, исследователи использовали метод, называемый рентгеновской кристаллографией, для определения структуры на атомном уровне белка F в первой форме. Затем они модернизировали белок F, чтобы лишить его способности изменять форму, зафиксировав его в форме, которая вырабатывает лучшие антитела.

Перед тем, как RSV начнет заражать клетку, ее белок F имеет форму, показанную слева.Во время заражения он принимает вторую форму. Новая вакцина против RSV была сделана путем фиксации белка F в первой форме, чтобы иммунная система могла производить лучшие антитела. Маклеллан и его коллеги определили эти две структуры в 2013 году. Изображение предоставлено Джейсоном Маклелланом.

В 2013 году они протестировали несколько версий вакцины как на мышах, так и на приматах. Эти варианты белка вызывали высокие уровни нейтрализующих антител и защищали животных от инфекции RSV.

«Когда мы впервые тестировали эти стабилизированные молекулы на животных, реакция была в 10 раз выше, чем все, что когда-либо видели», — сказал Маклеллан. «И в этот момент мы думаем:« Вот и все. Мы получили это ». Это было захватывающе».

Самая многообещающая из этих вакцин-кандидатов, DS-Cav1, была выбрана для клинической оценки и впоследствии произведена VRC.

Отчет Science представляет собой промежуточный анализ данных первых 40 здоровых взрослых добровольцев, принявших участие в испытании, которое началось в Клиническом центре Национального института здоровья в 2017 году.Исследователи обнаружили, что вакцина-кандидат вызывает более чем 10-кратное увеличение количества антител, нейтрализующих RSV, по сравнению с количеством антител, которые человек вырабатывает естественным образом в результате воздействия RSV в более раннем возрасте.

Результаты многообещающие, но Маклеллан осторожно рассматривает их в перспективе.

«Фаза 1 просто спрашивает: безопасно ли это, и вызывает ли она те типы антител и реакцию, которые мы надеялись увидеть?» он сказал. «Ему все еще необходимо пройти фазы 2 и 3, чтобы оценить эффективность, например, снижает ли он тяжесть заболевания или уменьшает количество госпитализаций?»

Многие лекарства не проходят клинические испытания.Но если этот или другой, основанный на той же структуре белка F, которую он помог обнаружить, Маклеллан говорит, что это может изменить правила игры.

«Если это сработает достаточно хорошо и мы предотвратим от 70 до 80 процентов всех смертей, просто подумайте обо всех маленьких младенцах и малышах, которых мы спасем», — сказал Маклеллан. «В мире не так много вакцин, поэтому, если мы действительно сможем участвовать в создании той, которая работает и спасает жизни, это было бы здорово».

Дополнительная информация о фазе 1 исследования DS-Cav1 (также известного как VRC 317) доступна в клинических исследованиях.gov с использованием идентификатора пробной версии NCT03049488. Окончательные результаты судебного разбирательства ожидаются в следующем году.

Техасский университет в Остине стремится к прозрачности и раскрытию всех потенциальных конфликтов интересов. Исследователь из университета, участвовавший в этом исследовании, Джейсон Маклеллан, отправил в университет необходимые формы раскрытия финансовой информации. Маклеллан является автором нескольких патентных заявок, связанных с этим исследованием, поданных Национальными институтами здравоохранения, от которых он получает гонорары.

патогенез респираторно-синцитиальной вирусной болезни в детском возрасте | Британский медицинский бюллетень

Абстрактные

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является основной причиной тяжелых респираторных инфекций у младенцев и детей. RSV — это РНК-вирус, геном которого кодирует 10 белков. Белок G отвечает за прикрепление вируса к клеткам, тогда как белок F способствует образованию синцитий. Эти белки также важны для иммунного ответа на RSV.Как врожденная, так и адаптивная ветви клеточной иммунной системы участвуют в иммунологическом ответе на RSV. Цитопатические эффекты вируса объясняют многие патологические находки при RSV-заболевании. Однако есть убедительные доказательства того, что иммунный ответ клетки-хозяина также играет важную роль в патогенезе заболевания. Неиммунологические факторы также могут иметь значение.

Респираторно-синцитиальный вирус (RSV) является единственной наиболее важной причиной вирусных инфекций нижних дыхательных путей в младенчестве и раннем детстве во всем мире.

Несмотря на его открытие в 1955 году, бремя, связанное с RSV для педиатрической популяции, только сейчас становится полностью осознанным. Только в США инфекция RSV является причиной госпитализации примерно 50 000–80 000 младенцев в год 1 , смерти примерно 500 младенцев ежегодно 2 и стоит 365–585 миллионов долларов в год 3 . Большинство госпитализаций связано с бронхиолитом, наиболее частым проявлением инфекции RSV в нижних дыхательных путях.

RSV — это сезонный вирус, вспышки которого ежегодно происходят зимой в умеренном климате и в сезон дождей в тропическом климате. Это чрезвычайно заразно. К 18 месяцам 87% детей имеют антитела к RSV, а к 3 годам практически все дети инфицированы 4 . Повторное инфицирование RSV происходит регулярно на протяжении всей жизни, хотя у младенцев рецидив бронхиолита маловероятен.

У большинства детей, инфицированных RSV, проявляются такие симптомы со стороны верхних дыхательных путей, как ринит, кашель и насморк 5 .У трети инфицированных детей также развивается острый средний отит 5 . Лихорадка, если она присутствует, обычно субфебрильная 5 . Симптомы со стороны верхних дыхательных путей обычно на несколько дней предшествуют поражению нижних дыхательных путей. Одышка, субкостальная рецессия и трудности с кормлением характеризуют инфекцию нижних дыхательных путей. При бронхиолите может присутствовать хрип с продолжительной фазой выдоха и хрипы. Захват воздуха приводит к учащению дыхания, пальпации селезенки и печени и типичной рентгенологической картине гиперинфляции с диффузными интерстициальными отметками и утолщением перибронхов.Часто наблюдается сегментарный ателектаз. Бронхиолит может привести к острой дыхательной недостаточности с тяжелым бронхоспазмом, умеренной и тяжелой гипоксией и задержкой углекислого газа. Апноэ обычно возникает у младенцев в возрасте до 2 месяцев и часто у недоношенных 4 . Поддерживающие меры по-прежнему являются основой лечения бронхиолита. Варианты лечения тяжелого заболевания не претерпели значительного прогресса с тех пор, как в 1963 году Кук и Рейнольдс 6 прокомментировали, что «кислород жизненно важен при бронхиолите, и существует мало доказательств того, что какое-либо другое лечение полезно».

В промышленно развитых странах тяжелый бронхиолит в первую очередь встречается у четко определенных групп высокого риска, таких как младенцы с преждевременными родами в анамнезе, бронхолегочной дисплазией, врожденными пороками сердца, муковисцидозом и иммунодефицитом 4 . К другим факторам риска тяжелого заболевания относятся теснота жизни, курение матери, низкий уровень антител к RSV в сыворотке пуповины и мужское начало 5 . Социально-экономический класс также является фактором, поскольку младенцы из малообеспеченных семей моложе, когда впервые заболевают этой болезнью.Как следствие, частота госпитализаций этих детей выше 5 . Наличие материнских IgA-антител в молозиве дает грудным детям некоторую защиту от RSV-бронхиолита 7 .

У большинства детей, инфицированных RSV в возрасте до 1 года, развиваются легкие симптомы со стороны верхних дыхательных путей. Однако до 40% развиваются симптомы со стороны нижних дыхательных путей, и 0,5–2% всех младенцев нуждаются в госпитализации 5 . Чаще всего бронхиолит, связанный с РСВ, встречается у маленьких детей в возрасте 2–5 месяцев.Это необычно для детей младше 1 месяца и старше 2 лет. Из числа госпитализированных детей 1-2% нуждаются в интенсивной терапии, и среди них смертность может достигать 10% 5 . Смерть от бронхиолита у детей без основных кардиореспираторных или иммунологических заболеваний встречается редко, и подавляющее большинство детей, инфицированных RSV, полностью выздоравливают. Однако у некоторых младенцев с бронхиолитом, вызванным RSV, впоследствии развиваются повторяющиеся эпизоды хрипов и кашля, что свидетельствует об астме 8 .

В этом обзоре будут рассмотрены последние достижения в биологии респираторно-синцитиального вируса, в частности, достижения в вирусологии и иммунопатологии RSV. Также будут обсуждаться неиммунологические аспекты патогенеза заболевания.

Свойства вируса

RSV — парамиксовирус с РНК-оболочкой среднего размера из рода пневмовирусов (рис. 1). Вирусный геном состоит из 15 000 нуклеотидов и кодирует 10 вирусных белков (рис. 2 и 3). Геном плотно инкапсидирован белком нуклеокапсида N, который вместе с фосфопротеином P и большой субъединицей полимеразы L образует минимальную единицу для репликации РНК.Репликация РНК включает синтез инкапсидированного репликативного промежуточного продукта с положительным смыслом, точной копии, называемого антигеномом, который, в свою очередь, служит матрицей для генома потомства. Помимо белков, связанных с нуклеокапсидом, для транскрипции требуется белок открытой рамки считывания 1 (ORF1) M2, который обеспечивает эффективное производство полноразмерной мРНК. Ген M2 также кодирует белок открытой рамки считывания 2 (ORF-2), который имеет отрицательный регуляторный эффект и может приводить к покою нуклеокапсидов до включения в вирионы.Кроме того, RSV кодирует матричный белок M, который, как полагают, опосредует взаимодействие между нуклеокапсидом и оболочкой во время морфогенеза вириона. Есть два неструктурных белка, NS1 и NS2, функции которых неизвестны, хотя NS1, по-видимому, является негативным регуляторным фактором для синтеза РНК. RSV кодирует три поверхностных белка оболочки, которые являются компонентами вириона: связывающий белок G, гибридный белок F и небольшой гидрофобный белок SH 9 .

Рис 1.

Электронная микрофотография респираторно-синцитиального вируса с отрицательным окрашиванием (полоса = 100 нм). Любезно предоставлено правообладателем, профессором К.А. Харт.

Рис. 1.

Электронная микрофотография респираторно-синцитиального вируса с отрицательным окрашиванием (полоса = 100 нм). Любезно предоставлено правообладателем, профессором К.А. Харт.

Рис. 2.

Схематическая диаграмма вириона RSV.

Рис. 2.

Схематическая диаграмма вириона RSV.

Рис 3.

Геном RSV, отображающий расположение 10 открытых рамок считывания и размер белка, кодируемого отдельными генами РНК.

Рис. 3.

Геном RSV, отображающий расположение 10 открытых рамок считывания и размер белка, кодируемого отдельными генами РНК.

Сильно гликозилированный белок G RSV состоит из 289–299 аминокислот и отвечает за прикрепление вируса к клеткам 10 . Антигенная изменчивость этого белка составляет большую часть различий между двумя основными штаммами RSV (A и B).Белки G штаммов A и B могут различаться на 47%, тогда как белки G одного и того же штамма могут отличаться на 20% 11 . Несмотря на эту вариабельность, все штаммы RSV человека содержат неизменяемую 13-аминокислотную область в G-белке, которая имеет петлеобразную структуру 9 , 11 . Это возможный кандидат на место связывания рецептора хозяина. Две формы G-белка синтезируются из альтернативных инициирующих кодонов одного и того же гена. Одна форма связана с мембраной, тогда как другая, составляющая 15% от общего количества, секретируется.Считалось, что секретируемая форма является приманкой для антител, поскольку большая часть ответа антител RSV связана с G-белком, но недавняя работа предполагает, что мембранные и секретируемые формы вызывают разные иммунные ответы 12 . Белок G может быть не единственным белком прикрепления, поскольку рекомбинантный RSV, лишенный белка G, все еще может инфицировать клетки 9 . Это повышает вероятность того, что белок F может иметь дополнительные функции прикрепления к корецептору хозяина, хотя рецептор (рецепторы) клетки-хозяина для RSV не идентифицирован.

Белок RSV F в его инактивированной форме (F 0 ) содержит 574 аминокислоты и имеет тримерную структуру спиральной спирали, аналогичную другим вирусным гибридным белкам 10 . Активация происходит посредством расщепления F 0 на две дисульфидно связанные субъединицы, F 1 и F 2 10 . Белок F способствует как слиянию вирусных и клеточных мембран, что приводит к переносу вирусного генетического материала, так и слиянию инфицированных и соседних клеточных мембран, вызывая образование синцитий 9 .Эти синцитии являются отличительной чертой цитопатического эффекта RSV и необходимы для передачи вируса от клетки к клетке. Взаимодействие между белком F и небольшой GTPase, RhoA, облегчает RSV-индуцированное образование синцития 13 . Возможное терапевтическое вмешательство в будущем может включать блокирование этого взаимодействия 14 . Образование синцитий также связано с экспрессией цитокератина-17 RSV-инфицированными клетками респираторного эпителия 15 . Цитокератины являются одними из основных компонентов сетей филаментов, составляющих цитоскелет.Экспрессия цитокератина-17 при инфекции RSV нейтрализуется антителом к ​​белку F 15 RSV.

Точная роль третьего трансмембранного белка, SH (содержащего 64 аминокислоты), в настоящее время неизвестна. Белок SH не требуется для репликации вируса или образования синцития, хотя он способствует слиянию 9 . Рекомбинантный RSV без гена SH при интраназальном введении мышам неотличим от вируса дикого типа в отношении репликации в нижних дыхательных путях, но репликация ограничена в 10 раз в верхних дыхательных путях 16 .Это сайт-специфическое ослабление репликации вируса может иметь значение для будущей разработки вакцины.

Патогенез RSV бронхиолита

Классическое понимание патогенеза инфекций предполагает, что проявления болезни являются прямым результатом микробной репликации и цитотоксичности. Хотя эти механизмы могут иметь важное значение при бронхиолите, большая часть работы была сосредоточена на иммунологических и неиммунологических ответах на инфекцию RSV и их роли в патогенезе заболевания.Некоторые наблюдения предполагают, что иммунологические механизмы могут быть ключом к серьезности бронхиолита, вызванного RSV, в младенчестве. Во-первых, заболевание наиболее распространено, когда младенец является наименее иммунологически зрелым, несмотря на наличие у матери специфических антител к RSV; во-вторых, опыт борьбы с болезнью, усиленной вакцинами (см. ниже). Иммунологический ответ на инфекцию RSV у людей можно разделить на врожденную и адаптивную.

Врожденный иммунитет

Этот эволюционно примитивный ответ вносит вклад в самую раннюю фазу защиты хозяина от чужеродных организмов.Врожденный иммунный ответ привлекает эффекторные молекулы и фагоцитарные клетки к месту инфекции посредством высвобождения цитокинов. Он быстрый, не зависит от клональной экспансии и не имеет иммунологической памяти.

Легочный сурфактант — это первая линия врожденной защиты легких. Он состоит из слоя фосфолипидов (в первую очередь лецитина и сфингомиелина) вместе с несколькими поверхностно-активными белками. В жидкости бронхоальвеолярного лаважа от инфицированных RSV младенцев, находящихся на ИВЛ, наблюдается снижение концентрации сурфактантного белка A, B и D 17 .Поверхностно-активный белок А является членом семейства коллинов, группы структурно родственных белков, которые связываются с поверхностными олигосахаридами ряда патогенов и опосредуют ряд действий, которые вносят вклад в врожденный иммунный ответ, включая опсонизацию и активацию комплемента. In vitro сурфактантный белок A нейтрализует RSV путем связывания с белком F, но не с белком G 18 .

Распознавание микробных продуктов клетками-хозяевами опосредуется рецепторами распознавания образов.Два важных члена этой группы рецепторов, CD14 и Toll-подобный рецептор 4 (TLR4), необходимы для врожденного ответа на компоненты грамотрицательных и грамположительных бактерий, микобактерий, спирохет и дрожжей. Недавняя работа с моноцитарными клетками предполагает, что белок F RSV активирует врожденный иммунный ответ через рецепторы CD14 и TLR4 19 . Таким образом, общий рецепторный путь инициирует иммунный ответ на множество бактериальных, грибковых и вирусных патогенов, включая RSV.

При инфекции RSV наиболее важными клеточными компонентами врожденного ответа являются фагоцитарные клетки (нейтрофилы и макрофаги), эозинофилы и естественные клетки-киллеры.

нейтрофилов

Нейтрофилы являются преобладающими лейкоцитами дыхательных путей при бронхиолите, вызванном RSV 20 . В исследовании RSV-инфекции у младенцев было обнаружено, что они представляют в среднем 93% клеток в верхних дыхательных путях и 76% в нижних дыхательных путях 20 . Эти наблюдения и другие исследования хемотаксиса, адгезии и цитотоксичности нейтрофилов предполагают, что нейтрофилы играют важную роль в патологических изменениях, которые происходят при бронхиолите, вызванном RSV 21 .

При RSV-инфекции хемотаксис нейтрофилов зависит от продукции мощного хемокина, IL-8, респираторными эпителиальными клетками и макрофагами 21 . Исследования in vitro демонстрируют двухфазный паттерн экспрессии гена IL-8 в клетках респираторного эпителия, подвергнутых воздействию RSV 22 . Первый пик наступает через 2 часа и не зависит от репликации вируса. Таким образом, воспалительная реакция может возникнуть практически сразу до того, как установится респираторно-синцитиальная вирусная инфекция.Поздняя экспрессия (через 24 часа) зависит от репликации вируса. Важность IL-8 при заболевании RSV у человека подчеркивается недавним элегантным исследованием, демонстрирующим генетический полиморфизм, близкий к гену IL-8, как детерминант серьезности заболевания 23 . Недавняя работа нашей группы показала значительную связь между концентрацией IL-8 в носоглотке и тяжестью заболевания при бронхиолите, вызванном RSV 24 . Неудивительно, что образцы сыворотки и бронхоальвеолярного лаважа от младенцев, находящихся на ИВЛ с RSV-бронхиолитом, также показывают повышенные уровни IL-8 25 , 26 .

Процесс рекрутирования нейтрофилов из кровотока в инфицированную ткань можно разделить на четыре этапа: перекатывание, адгезия, экстравазация и миграция. Как и в случае многих инфекций, начальный этап включает обратимое прикрепление молекул адгезии (селектинов и интегринов) между эндотелием сосудов и нейтрофилами 21 . При инфекции RSV L-селектин играет ключевую роль в установлении слабого адгезивного взаимодействия, которое позволяет нейтрофилам катиться вдоль эндотелия.Нейтрофил становится прикрепленным к эндотелию в результате индукции ICAM-1 и активации его рецепторов, интегринов LFA-1 и Mac-1 21 . Экспрессия интегрина и ICAM-1 повышена на нейтрофилах периферической крови у младенцев, инфицированных RSV 21 . Затем нейтрофилы протискиваются между эндотелиальными клетками и мигрируют по градиенту концентрации хемоаттрактанта к месту инфекции 27 . Пройдя через эндотелий сосудов, экспрессия L-селектина подавляется при RSV-инфекции, хотя физиологическое значение этого «выделения» остается неясным.

Проходя через эндотелий сосудов, цитотоксический эффект нейтрофилов максимизируется за счет их удержания в месте инфекции. При RSV-заболевании адгезия нейтрофилов и эпителиальных клеток использует те же молекулярные взаимодействия, что и адгезия нейтрофилов и эндотелиальных клеток. Исследования in vitro на линиях эпителиальных клеток человека показывают, что инфекция RSV увеличивает экспрессию антигенов ICAM-1, VCAM-1 и главного комплекса гистосовместимости (MHC) 21 . Адгезия нейтрофилов может блокироваться антителами как к интегринам, так и к ICAM-1, последний снижает концентрацию нейтрофилов до 70% в дыхательных путях крыс с вирусным бронхиолитом 28 , 29 .Другие недавние исследования показывают, что повышенная адгезия нейтрофилов к респираторным эпителиальным клеткам зависит от дозы и времени 21 , 28 . Таким образом, чем дольше длится инфекция, тем больше нейтрофилов попадает в дыхательные пути. Исследования in vitro показывают, что RSV сам по себе может повредить и отделить респираторные эпителиальные клетки в ограниченной степени, и что этот эффект усиливается нейтрофилами 21 . Эти исследования могут иметь клиническое значение для младенцев, ранее не получавших РСВ, у которых наблюдается замедленный адаптивный иммунный ответ с длительным клиренсом вируса.У этих младенцев рекрутирование нейтрофилов может продолжаться в ответ на неконтролируемую репликацию вируса с последующим повреждением эпителиальных клеток в результате дезинтеграции / дегрануляции нейтрофилов. Возможной реакцией хозяина на это является ускорение апоптоза нейтрофилов, тем самым уменьшая повреждение эпителия 21 .

Макрофаги

Макрофаги образуются при миграции циркулирующих моноцитов в ткань. Они играют важную роль в контроле иммунного ответа на вирусную инфекцию не только за счет прямого взаимодействия с хелперами и цитотоксическими Т-клетками, но и за счет продукции цитокинов.Они могут уничтожать вторгшиеся патогены, но чаще действуют как антигенпредставляющие клетки. Макрофаги, наряду с клетками респираторного эпителия, являются первыми клетками, которые сталкиваются с RSV в дыхательных путях 30 . Оба типа клеток отвечают на инфекцию, секретируя цитокины. In vitro RSV-инфицированные респираторные эпителиальные клетки секретируют RANTES, MIP-1α, IL-6, IL-8 и IL-1β 31 , в то время как макрофаги секретируют IL-1β, IL-6, IL-8, IL-10 , IL-12 и TNF-α 32 , 33 . Эти цитокины дополнительно регулируют иммунный ответ, увеличивая проницаемость сосудов и вызывая активацию и привлечение лимфоцитов, нейтрофилов, NK-клеток и, возможно, эозинофилов в очаг инфекции.Сравнительные исследования мононуклеарных клеток из пуповинной крови новорожденных и взрослых показали, что продукция IL-6 и TNF-α в ответ на инфекцию RSV менее эффективна у новорожденных по сравнению со взрослыми 34 . При сравнении апоптоза неонатальных и взрослых мононуклеарных клеток, инфицированных RSV, наблюдалось снижение клеточного апоптоза из обоих источников, хотя это снижение было более выраженным в неонатальных клетках 35 . Эти наблюдения могут помочь объяснить механизм более тяжелого заболевания, наблюдаемого у маленьких детей.

В недавнем исследовании изучалась связь между продукцией моноцитарного ИЛ-12 и тяжестью заболевания у 30 детей, получавших ИВЛ по поводу RSV-бронхиолита 36 . Наблюдалась обратная зависимость между продолжительностью вентиляции и продукцией IL-12. Авторы предположили, что низкий ответ моноцитов на IL-12 во время начальной инфекции RSV может отрицательно повлиять на клинический исход пациентов с тяжелым бронхиолитом RSV. Таким образом, продукция моноцитами IL-12, который является противовирусным цитокином, может влиять на тип и продолжительность клинического заболевания, наблюдаемого при инфекции RSV.

Эозинофилы

Учитывая клиническое сходство между вирусным бронхиолитом и астмой, можно предположить роль эозинофилов в заболевании RSV. И эозинофилы, и эозинофильные РНКазы обладают противовирусной активностью 9 , а инфицированные RSV респираторные эпителиальные клетки повышают экспрессию хемоаттрактантов эозинофилов, RANTES и MIP-1α 26 , 31 . Несколько групп продемонстрировали доказательства дегрануляции эозинофилов как в носоглотке, так и в паренхиме легких во время инфекции RSV 9 .Другие исследования подтверждают развитие длительной воспалительной реакции в дыхательных путях после бронхиолита, вызванного RSV, в котором важную роль играют эозинофилы 37 –39 . У младенцев с бронхиолитом, вызванным RSV, уровни катионного белка эозинофилов (ECP) в крови были выше во время выздоровления, чем во время острого заболевания. Секреция эозинофилов ECP также связана с хрипом во время инфекции RSV 9 .

Вероятно, наиболее убедительные доказательства участия эозинофилов в иммунопатогенезе бронхиолита, вызванного RSV, получены из клинических испытаний вакцины, инактивированной формалином 5 .Последующее воздействие RSV привело к увеличению смертности и заболеваемости среди вакцинированных младенцев. При вскрытии выявлены массивные легочные инфильтраты эозинофилов.

Однако, несмотря на эти результаты, исследования первичной инфекции RSV как на мышах, так и на людях не смогли идентифицировать эозинофилы в легких, инфицированных RSV 18 , 40 , хотя они составляют до 8% клеток в лаважной жидкости из дыхательных путей астмы 41 . Это может отражать неспособность иммунного ответа полностью активировать миграцию эозинофилов или возможное ограничение движения эозинофилов в легкие и паренхиму носоглотки.

Естественные клетки-киллеры

Сравнительно немного исследований было посвящено роли естественных киллеров (NK) в RSV-инфекции. Недавние исследования на мышах показали, что NK-клетки накапливаются в легких в первые несколько дней заражения RSV и ответственны за большую часть ранней продукции IFN-γ 42 . NK-клетки активируются IFN-β, IL-12 и TNF-α, всеми цитокинами, обнаруженными в легком, инфицированном RSV –31 . IL-12 и TNF-α синергетически повышают продукцию IFN-γ NK-клетками 27 .У детей, поступивших в больницу с бронхиолитом, вызванным RSV, количество NK-клеток в крови значительно ниже, чем в контрольной группе, что позволяет предположить, что NK-клетки привлекаются из периферического кровообращения в другие ткани, вероятно, в легкие 43 . NK-клетки распознают инфицированные вирусом клетки-хозяева, выявляя снижение экспрессии молекул MHC класса I. RSV увеличивает экспрессию MHC класса I, что, первоначально защищая инфицированные клетки-хозяева от цитотоксичности, опосредованной NK-клетками, в конечном итоге делает их более восприимчивыми к гибели, вызванной цитотоксическими лимфоцитами.Сила ответа NK-клеток может определять тип опосредованного клетками ответа Т-хелперов 11 .

Адаптивная невосприимчивость

Адаптивный иммунный ответ отличается иммунологической памятью и основан на клональной селекции лимфоцитов, несущих антигенспецифические рецепторы. Адаптивный иммунитет можно разделить на гуморальный и клеточно-опосредованный ответы. При инфекции RSV гуморальный ответ в первую очередь участвует в защитном иммунитете, тогда как клеточно-опосредованный ответ способствует выведению вируса.

Гуморальный

Все доношенные новорожденные имеют специфические нейтрализующие RSV антитела в результате плацентарного переноса материнского иммуноглобулина. Наиболее тяжелое заболевание RSV возникает в возрасте 2–6 месяцев, когда должна присутствовать защита от материнских антител. Это предполагает, что антитела против RSV могут играть роль в иммунопатогенезе RSV-бронхиолита 8 . Однако относительная щадимость серьезного RSV-заболевания у детей младше 6 недель и корреляция между тяжестью заболевания и низким титром RSV-антител в пуповинной крови противоречат концепции, согласно которой местная или системная продукция антител играет важную роль в патогенезе заболевания 5 .

Инфекция RSV вызывает выработку сывороточных антител даже у самых маленьких детей, хотя титры антител, вырабатываемые у младенцев, ниже, чем у детей старшего возраста и взрослых 8 . У людей вырабатываются антитела к большинству белков RSV, хотя белки F и G стимулируют выработку мощных нейтрализующих антител 7 , которые важны для защитного иммунитета 8 .

Во время первичной инфекции антитела IgM в сыворотке крови присутствуют в течение нескольких дней и остаются обнаруживаемыми в течение 1-2 недель.Антитела IgG появляются на второй неделе, достигают пика на четвертой неделе и уменьшаются через 1-2 месяца. Реакция сывороточных антител IgA у младенцев более вариабельна и может не встречаться 5 . Сывороточные RSV-нейтрализующие антитела обладают защитным эффектом, поскольку у детей с высокими титрами (> 1/100) вероятность развития бронхиолита ниже, чем у детей с более низкими титрами. Более того, недавние клинические испытания парентерального введения RSV-нейтрализующих антител младенцам из группы высокого риска показывают некоторые доказательства защиты от тяжелого заболевания.Повторное инфицирование усиливает реакцию сывороточных антител на все три класса иммуноглобулинов.

RSV также вызывает секреторный ответ антител у людей. И секреторный IgA, и секреторный IgG обеспечивают некоторую защиту от инфекции в верхних и нижних дыхательных путях, соответственно 1 .

Возможная роль IgE в бронхиолите, вызванном RSV, и последующем развитии хрипов является предметом постоянных дискуссий. Welliver и др. обнаружили RSV IgE в секретах младенцев во время фазы выздоровления от RSV-бронхиолита 8 .Уровни IgE также были высокими у младенцев с острым бронхиолитом и коррелировали со степенью гипоксии 8 . Рецидивирующее свистящее дыхание после бронхиолита было связано с исходным ответом RSV – IgE, а также с семейным анамнезом астмы 9 . Однако в других исследованиях не было обнаружено никаких секреторных или сывороточных вирусов IgE к RSV в образцах острой фазы или выздоравливающих у младенцев с RSV-инфекцией 44 .

Данные, полученные на животных моделях, показывают, что антитела защищают от болезни RSV 9 .Однако, как только инфекция установлена, это опосредованная клетками реакция способствует выведению вируса.

Клеточно-опосредованный

Важность клеточного иммунитета при заболевании RSV продемонстрирована у детей с недостаточным клеточным иммунитетом, которые выделяют вирус в течение нескольких месяцев, по сравнению с иммунокомпетентными людьми, которые избавляются от RSV в течение недель 5 . Как описано в другом месте в этом выпуске, клеточно-опосредованный иммунный ответ по экспрессии поверхностного антигена лимфоцитов классифицируется на цитотоксические лимфоциты (CTL) CD8 + и Т-хелперные клетки CD4 + .Оба этих типа клеток обладают противовирусными, а также иммунопатогенными свойствами. CD4 + Т-хелперные клетки подразделяются на лимфоциты Th2 и Th3 на основе секреции цитокинов. Ответы Th2 характеризуются секрецией IFN-γ, IL-2 и TNF-α, тогда как секреция IL-4, IL-5, IL-10 и IL-13 характеризует ответы Th3. Доказательства участия Th2 / Th3 в заболевании, вызванном RSV, поступают в основном из исследований на мышах, где вакцинация различными белками и пептидами RSV с последующей провокацией RSV позволяет управлять ответами Т-клеток и тяжестью заболевания.

Цитотоксические лимфоциты

RSV-специфические лимфоциты CD8 + важны как для выздоровления, так и для патогенеза RSV-заболевания. В мышиной модели RSV-инфекции CTL очищают вирус от постоянно инфицированных иммунодефицитных (облученных) мышей, но могут вызывать усиленный воспалительный ответ в легких 45 . Точно так же CTL ускоряют выведение RSV из легких иммунокомпетентных мышей, но также вызывают повреждение легких 9 , 45 .Другие исследования охарактеризовали ответы субпопуляций Т-клеток и их функциональный вклад у мышей во время инфекции RSV 46 . Когда оба субпопуляции Т-лимфоцитов были истощены, репликация RSV была заметно пролонгированной, но без явных доказательств болезни, что позволяет предположить, что иммунный ответ хозяина, а не вирусный цитоцидный эффект, был первичной детерминантой заболевания у мышей. Пассивная передача RSV-специфических лимфоцитов CD4 + и CD8 + инфицированным мышам уменьшала выделение вируса из легких, хотя некоторые исследования демонстрируют усиление повреждения легких 9 .Таким образом, хотя сильный ответ CD8 + на инфекцию RSV важен для выздоровления, слишком сильный ответ может быть вредным.

Есть несколько исследований, оценивающих активность CTL у младенцев и детей. В одном из них цитотоксический ответ на респираторно-синцитиальный вирус (RSV) изучали в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) от RSV-инфицированных младенцев по сравнению с контрольной группой. Активность CTL достигла пика в течение 1 недели после инфицирования и, по-видимому, зависела от возраста: более 65% детей в возрасте 6–24 месяцев и 35–38% детей в возрасте до 5 месяцев проявляли клеточную цитотоксичность по отношению к RSV 47 .Другие исследования показывают снижение CD8 + CTL в крови у младенцев, поступивших по поводу бронхиолита, вызванного RSV, по сравнению с образцами выздоравливающих, взятыми через неделю 43 . В недавнем исследовании сывороточные CTL и цитокиновые ответы в когорте младенцев, за которыми наблюдали в течение трех последовательных сезонов RSV, были измерены до их первого заражения RSV и при последующих инфекциях 48 . В течение первого года жизни почти у 80% младенцев, инфицированных RSV, развивалась RSV-специфическая активность CTL.Ответ CTL на инфекцию RSV был недолгим, но его можно было сохранить и усилить при новом контакте с вирусом. Уровни специфичных для RSV CTL положительно коррелировали с концентрациями IFN-γ и обратно — с концентрациями IL-4. Младенцы с обнаруживаемой активностью CTL на первом году жизни были менее подвержены серьезным заболеваниям нижних дыхательных путей во время последующих эпидемий RSV.

Т-хелперы

Неопровержимые доказательства, подтверждающие иммунопатологический механизм заболевания RSV, получены из исследований вакцины, инактивированной формалином, испытанной в 1960-х годах. 11 .Вакцина, осажденная внутримышечно квасцами, не защищала младенцев от инфекции RSV. Действительно, как упоминалось ранее, дети, получившие вакцину, демонстрировали более высокую заболеваемость и смертность с последующим естественным инфицированием по сравнению с непривитыми детьми контрольной группы. Гистопатологическое исследование умерших детей выявило яркую легочную эозинофилию с геморрагическим некрозом, не связанными с первичной инфекцией RSV. За последние 10 лет животные модели помогли выяснить возможные механизмы, лежащие в основе этой патологии, усиленной вакциной 5 .

В моделях RSV-инфекции на мышах индукция различных Т-клеточных ответов CD4 + может зависеть от сенсибилизирующего антигена RSV. Примирование мышей рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим белок F, индуцирует Т-клеточный ответ Th2 CD4 + и сильный ответ CTL 11 . Иммунизация мышей белком RSV G способствует активации Т-клеточного ответа Th3 CD4 + и индуцирует эозинофильные инфильтраты в легких после последующей инфекции RSV 11 .Поскольку иммунизация вакциной G или инактивированной формалином вакциной приводит к аналогичным профилям заболевания при инфицировании RSV, постулируется, что эпитопы G ответственны за усиленное вакциной заболевание. Эта концепция подкрепляется идентификацией эпитопа G-белка, связанного с индукцией эозинофилов 49 . Однако рассматриваемый эпитоп является компонентом RSV дикого типа, который, как известно, индуцирует ответы Th2 11 . Другие недавние исследования показали, что можно вызвать как Th2, так и Th3 ответы от одного и того же эпитопа на G-гликопротеине (аминокислоты 184–198), подразумевая, что комплексы MHC – лиганд, полученные из G-белка RSV, не направляют дифференцировку CD4. + Т-лимфоциты по отношению к определенному фенотипу Th2 или Th3 50 .Интересно, что существуют различия между иммунизацией секретируемыми или мембраносвязанными белками. Праймирование мышей секретируемой формой белка F индуцирует промежуточный Th3-подобный фенотип, при котором продуцируются как IL-4, так и IL-5 вместе с F-специфическими CTL RSV и высокими уровнями IFN-γ 51 . Секретируемая форма G намного более эффективна, чем мембраносвязанная форма, в индукции легочной эозинофилии после заражения RSV 11 .

У человека не менее сложная ситуация.Многие группы пытались определить доминирующий профиль цитокинов Th2 или Th3 в крови, носоглоточных аспиратах и ​​бронхо-альвеолярном лаваже, взятых у младенцев с заболеванием RSV. Идея о том, что RSV-бронхиолит может быть заболеванием Th3-типа, была изучена, поскольку она может помочь объяснить развитие постбронхиолитического рецидивирующего хрипа 8 . Однако на сегодняшний день обнаружены лишь ограниченные доказательства роли цитокинов Th3 в патогенезе бронхиолита. Roman и др. сообщили, что стимулированные PBMC от детей с RSV-бронхиолитом показывают повышенное соотношение IL-4 / IFN-γ по сравнению со здоровыми детьми контрольной группы, хотя уровни обоих цитокинов были снижены 52 .Renzi и др. показали, что экспрессия IFN-γ в PBMC ниже при тяжелой форме по сравнению с легкой формой RSV. 53 . Та же группа продемонстрировала связь между ответами Th3 и ранним хрипом после бронхиолита, вызванного RSV 38 . В другой недавней работе изучались профили цитокинов у младенцев с различными проявлениями RSV-инфекции. Преобладающий цитокиновый ответ Th2, характеризующийся продуцированием IFN-γ, был продемонстрирован независимо от клинической тяжести 54 . Концентрации белка IFN-γ также повышены в секретах носоглотки у младенцев с инфекцией RSV и коррелируют с хрипом 55 .

В конечном итоге, несколько факторов, вероятно, влияют на тип ответа Т-хелперных клеток, вызываемого у людей во время инфекции RSV. Внутренние факторы хозяина, такие как атопия, «цитокиновая среда», присутствующая во время праймирования антигена, и присутствие иммуномодулирующих эффекторных клеток, таких как CTL, могут вносить вклад в дифференцировку Th2 / Th3 11 .

Неиммунологические факторы

Анатомия дыхательных путей предрасполагает младенцев к тяжелой форме RSV 5 .При ламинарном потоке сопротивление дыхательных путей обратно пропорционально четвертой степени радиуса дыхательных путей. Таким образом, обструкция мелких дыхательных путей у младенцев имеет большее клиническое значение, чем обструкция периферических дыхательных путей у детей старшего возраста или взрослых. Физиологической кульминацией воспалительного ответа на инфекцию RSV в легких является сужение дыхательных путей младенцев. Отшелушенный некротический эпителий и чрезмерная секреция слизи также усугубляют обструкцию дыхательных путей и образование слизистых пробок 5 .Это приводит к захвату воздуха и гиперинфляции или коллапсу дистальной ткани легкого. Несколько исследований показали, что у части детей наблюдаются признаки небольшой обструкции дыхательных путей через много лет после бронхиолита 56 . Это может быть совместимо с ранее существовавшей аномалией, повреждением легких во время инфекции или легкой формой астмы. Возможно, что у этих младенцев относительно небольшие дыхательные пути, что предрасполагает их как к RSV-бронхиолиту, так и к рецидивирующим симптомам нижних дыхательных путей в детстве.Одно исследование показало, что частота симптомов нижних дыхательных путей в раннем детстве в значительной степени определяется функцией легких в раннем младенчестве 57 .

Исследования нейрогенно-опосредованного воспаления в дыхательных путях также могут дать более глубокое понимание патогенеза RSV-заболевания. Недавно было показано, что RSV делает дыхательные пути аномально чувствительными к провоспалительным эффектам вещества P за счет активации экспрессии рецептора гена нейрокинина-1, тем самым увеличивая плотность рецепторов вещества P на некоторых клетках 58 .Среди этих клеток есть клеточные медиаторы воспалительных и иммунных ответов, такие как эндотелиальные клетки, лимфоциты, макрофаги и тучные клетки. Усиление этого воспалительного пути является долгосрочным явлением и может предрасполагать к стойкому воспалению дыхательных путей и гиперреактивности.

Ключевые моменты клинической практики

  • • Респираторно-синцитиальный вирус является наиболее важной причиной инфекции нижних дыхательных путей у младенцев и детей раннего возраста

  • • RSV вызывает широкий спектр клинических заболеваний у младенцев, от легких симптомов со стороны верхних дыхательных путей до дыхательной недостаточности

  • • Все аспекты иммунной системы участвуют в защите хозяина от RSV

  • • Существует тонкий баланс между защитными и усиливающими болезнь эффектами иммунного ответа хозяина на RSV

  • • Конечный результат этого воспалительные изменения в легких — сужение дыхательных путей с последующими клиническими симптомами бронхиолита

  • • Выяснение патогенных механизмов, лежащих в основе заболевания RSV, может дать объяснение наблюдаемому спектру заболевания RSV и его отдаленным последствиям

Пол Макнамара поддерживается грантом Action Resea рч.

Список литературы

1

Шей Д.К., Холман Р.К., Ньюман Р.Д., Лю Л.Л., Стаут Д.В., Андерсон Л.Дж. Госпитализации в связи с бронхиолитом среди детей в США, 1980–1996 гг.

JAMA

1999

;

282

:

1440

–62

Шей Д.К., Холман Р.К., Рузвельт Г.Е., Кларк М.Дж., Андерсон Л.Дж. Смертность от бронхиолита и оценки смертности от респираторно-синцитиального вируса среди детей в США, 1979–1997 гг.

J Инфекция Dis

2001

;

183

:

16

–223

Stang P, Brandenburg N, Carter B.Экономическое бремя госпитализаций при бронхиолите, ассоциированном с респираторно-синцитиальным вирусом.

Arch Pediatr Adolesc Med

2001

;

155

:

95

–64

Simoes EA. Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция.

Ланцет

1999

;

354

:

847

–525

Холл CB. Респираторно-синцитиальный вирус. В: Фейгин Р.Д., Вишня Ж.Д. (ред.) Учебник детских инфекционных болезней . Филадельфия, Пенсильвания: У. Б. Сондерс, 1998; 2084–111

6

Reynolds EOR, Cook CD.Лечение бронхиолита.

J Pediatr

1963

;

63

:

1205

–77

Голдинг Дж., Эммет П.М., Роджерс И.С. Защищает ли грудное вскармливание от не желудочных инфекций?

Early Hum Dev

1997

;

49 (Дополнение)

:

S105

–208

Stein RT, Sherrill D, Morgan WJ et al . Респираторно-синцитиальный вирус в молодом возрасте и риск возникновения хрипов и аллергии к 13 годам.

Ланцет

1999

;

354

:

541

–59

Domachowske JB, Rosenberg HF.Респираторно-синцитиальная вирусная инфекция: иммунный ответ, иммунопатогенез и лечение.

Clin Microbiol Rev

1999

;

12

:

298

–30910

Мэйнвелл Н.А., Кристал М. Респираторно-синцитиальный вирус: недавний прогресс в открытии эффективных профилактических и терапевтических средств.

Drug Discov Today

2000

;

5

:

241

–5211

Graham BS, Johnson TR, Peebles RS. Патогенез иммуноопосредованных заболеваний при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.

Иммунофармакология

2000

;

48

:

237

–4712

Хасселл Т., Опеншоу П. Последние достижения в биологии респираторно-синцитиального вируса: не за горами ли вакцины и новые методы лечения?

Curr Opin Microbiol

1999

;

2

:

410

–413

Пасти М.К., Кроу-младший Дж. Э., Грэм Б.С. RhoA взаимодействует со слитым гликопротеином респираторно-синцитиального вируса и способствует индуцированному вирусом образованию синцития.

J Virol

1999

;

73

:

7262

–7014

Пасти М.К., Гауэр Т.Л., Спирман П.В., Кроу-младший Дж. Э., Грэм Б.С. Пептид, производный от RhoA, ингибирует образование синцития, индуцированное респираторно-синцитиальным вирусом и вирусом парагриппа типа 3.

Nat Med

2000

;

6

:

35

–4015

Domachowske JB, Bonville CA, Rosenberg HF. Цитокератин 17 экспрессируется в клетках, инфицированных респираторно-синцитиальным вирусом, посредством активации NF-kappaB и связан с образованием цитопатических синцитий.

J Инфекция Dis

2000

;

182

:

1022

–816

Букреев А., Уайтхед С.С., Мерфи Б.Р., Коллинз П.Л. Рекомбинантный респираторно-синцитиальный вирус, из которого был удален весь ген SH, эффективно растет в культуре клеток и проявляет сайт-специфическое ослабление в дыхательных путях мыши.

J Virol

1997

;

71

:

8973

–8217

Kerr MH, Paton JY. Уровни сурфактантного белка при тяжелой респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.

Am J Respir Crit Care Med

1999

;

159

:

1115

–818

Гильдьял Р., Хартли С., Варрассо А. и др. . Поверхностно-активный белок А связывается с гликопротеином слияния респираторно-синцитиального вируса и нейтрализует инфекционность вириона.

J Infect Dis

1999

;

180

:

2009

–1319

Курт-Джонс Э.А., Попова Л., Квинн Л. и др. . Рецепторы распознавания образов TLR4 и CD14 опосредуют ответ на респираторно-синцитиальный вирус.

Нат Иммунол

2000

;

1

:

398

–40120

Everard ML, Swarbrick A, Wrightham M et al . Анализ клеток, полученных при промывании бронхов младенцев с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией.

Arch Dis Child

1994

;

71

:

428

–3221

Wang SZ, Forsyth KD. Взаимодействие нейтрофилов с клетками респираторного эпителия при вирусной инфекции.

Респирология

2000

;

5

:

1

–1022

Fiedler MA, Wernke-Dollries K, Stark JM.Респираторно-синцитиальный вирус увеличивает экспрессию гена IL-8 и высвобождение белка в клетках A549.

Am J Physiol

1995

;

269

:

L865

–7223

Hull J, Thomson A, Kwiatkowski D. Ассоциация респираторно-синцитиального вирусного бронхиолита с областью гена интерлейкина 8 в семьях Великобритании.

Грудь

2000

;

55

:

1023

–724

Смит Р.Л., Моббс К.Дж., О’Хи Ю., Эшби Д., Харт, Калифорния. Респираторно-синцитиальный вирусный бронхиолит: тяжесть заболевания, интерлейкин-8 и генотип вируса.Педиатр Пульмонол 2002; In press

25

Bont L, Heijnen CJ, Kavelaars A et al . Ответы цитокинов периферической крови и тяжесть заболевания при респираторно-синцитиальном вирусном бронхиолите.

Eur Respir J

1999

;

14

:

144

–926

Harrison AM, Bonville CA, Rosenberg HF, Domachowske JB. Экспрессия хемокинов, индуцированная респираторно-синцитиальным вирусом, в нижних дыхательных путях: рекрутирование и дегрануляция эозинофилов.

Am J Respir Crit Care Med

1999

;

159

:

1918

–2427

Джейнвей, Калифорния, Трэверс П.Защита хозяина от инфекции. В: Janeway CA, Travers P, Walport M, Capra JD. (ред.) Иммунобиология. Эдинбург: Черчилль Ливингстон, 1999; 363–415

28

Старк Дж. М., Годдинг В., Седжвик Дж. Б., Бусс, WW. Инфекция респираторно-синцитиальным вирусом усиливает адгезию нейтрофилов и эозинофилов к культивированным клеткам респираторного эпителия. Роль CD18 и молекулы межклеточной адгезии-1.

J Immunol

1996

;

156

:

4774

–8229

Соркнесс Р.Л., Мехта Х., Каплан М.Р., Миясака М., Хефле С.Л., Леманске РФ.Влияние блокады ICAM-1 на воспаление легких и физиологию при остром вирусном бронхиолите у крыс.

Педиатр Res

2000

;

47

:

819

–2430

Kimpen JL. Респираторно-синцитиальный вирус и астма. Роль моноцитов.

Am J Respir Crit Care Med

2001

;

163

:

S7

–931

Becker S, Soukup JM. Активация моноцитов и эозинофилов, вызванная эпителиальными клетками дыхательных путей при респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.

Иммунобиология

1999

;

201

:

88

–10632

Becker S, Quay J, Soukup J. Производство цитокинов (фактор некроза опухоли, IL-6 и IL-8) альвеолярными макрофагами человека, инфицированными респираторным синцитиальным вирусом.

J Immunol

1991

;

147

:

4307

–1233

Пануска Дж. Р., Меролла Р., Реберт Н. А. и др. . Респираторно-синцитиальный вирус индуцирует интерлейкин-10 альвеолярными макрофагами человека. Подавление ранней продукции цитокинов и последствия для неполного иммунитета.

Дж. Клин Инвест

1995

;

96

:

2445

–5334

Мацуда К., Цуцуми Х., Соне С. и др. . Характеристики продукции IL-6 и TNF-альфа макрофагами, инфицированными респираторно-синцитиальным вирусом, у новорожденных.

J Med Virol

1996

;

48

:

199

–20335

Крилов Л.Р., МакКлоски Т.В., Харкнесс С.Х., Понтрелли Л., Пахва С. Изменения апоптоза пуповинных и взрослых мононуклеарных клеток периферической крови, вызванные инфекцией in vitro респираторно-синцитиальным вирусом.

J Инфекция Dis

2000

;

181

:

349

–5336

Bont L, Kavelaars A, Heijnen CJ, van Vught AJ, Kimpen JL. Продукция моноцитов интерлейкина-12 обратно пропорциональна продолжительности дыхательной недостаточности при респираторно-синцитиальном вирусном бронхиолите.

J Инфекция Dis

2000

;

181

:

1772

–537

Смит Р.Л., Флетчер Дж. Н., Томас Х. М., Харт, Калифорния, Openshaw PJ. Респираторно-синцитиальный вирус и хрипы [письмо; комментарий].

Ланцет

1999

;

354

:

1997

–838

Renzi PM, Turgeon JP, Yang JP et al . Активизируется клеточный иммунитет, и ответ Th-2 связан с ранним хрипом у младенцев после бронхиолита.

J Pediatr

1997

;

130

:

584

–9339

Смит Р.Л., Флетчер Дж. Н., Томас Х. М., Харт, Калифорния. Иммунологические ответы на респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию в младенчестве.

Arch Dis Child

1997

;

76

:

210

–440

Бартон Л.Л., Грант К.Л., Лемен Р.Дж.Иммуноглобулин респираторно-синцитиального вируса: решения и затраты.

Pediatr Pulmonol

2001

;

32

:

20

–841

Леунг К.Б., Флинт К.С., Бростофф Дж., Хадспит Б.Н., Джонсон Н.М., Пирс Флорида. Некоторые свойства тучных клеток, полученных с помощью бронхоальвеолярного лаважа человека.

Действия агентов

1986

;

18

:

110

–242

Hussell T, Openshaw PJ. Внутриклеточная экспрессия IFN-гамма в естественных клетках-киллерах предшествует рекрутированию CD8 + Т-клеток в легких во время респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.

J Gen Virol

1998

;

79

:

2593

–60143

De Weerd W, Twilhaar WN, Kimpen JL. Анализ субпопуляции Т-клеток в периферической крови детей с бронхиолитом, вызванным RSV.

Scand J Infect Dis

1998

;

30

:

77

–8044

Томс Г.Л., Куинн Р., Робинсон Дж. У. Неопределяемые IgE-ответы после респираторно-синцитиальной вирусной инфекции.

Arch Dis Child

1996

;

74

:

126

–3045

Graham BS.Патогенез респираторно-синцитиальной вирусной вакцинно-усиленной патологии.

Am J Respir Crit Care Med

1995

;

152

:

S63

–646

Graham BS, Bunton LA, Wright PF, Karzon DT. Роль субпопуляций Т-лимфоцитов в патогенезе первичной инфекции и повторного заражения респираторно-синцитиальным вирусом у мышей.

Дж. Клин Инвест

1991

;

88

:

1026

–3347

Chiba Y, Higashidate Y, Suga K, Honjo K, Tsutsumi H, Ogra PL.Развитие клеточно-опосредованного цитотоксического иммунитета к респираторно-синцитиальному вирусу у младенцев после естественной инфекции.

J Med Virol

1989

;

28

:

133

–948

Mbawuike IN, Wells J, Byrd R, Cron SG, Glezen WP, Piedra PA. HLA-ограниченные ответы цитотоксических Т-лимфоцитов CD8 + , гамма-интерферона и интерлейкина-4 на респираторно-синцитиальную вирусную инфекцию у младенцев и детей.

J Инфекция Dis

2001

;

183

:

687

–9649

Sparer TE, Matthews S, Hussell T et al .Устранение области белка прикрепления респираторно-синцитиального вируса позволяет вызвать защитный иммунитет без усиленной вакциной эозинофилии легких.

J Exp Med

1998

;

187

:

1921

–650

Srikiatkhachorn A, Chang W, Braciale TJ. Индукция Th-1 и Th-2 ответов гликопротеином прикрепления респираторно-синцитиального вируса не зависит от эпитопа и главного комплекса гистосовместимости.

J Virol

1999

;

73

:

6590

–751

Bembridge GP, Lopez JA, Bustos R et al .Праймирование секретируемой формой гибридного белка респираторно-синцитиального вируса (RSV) способствует выработке интерлейкина-4 (IL-4) и IL-5, но не эозинофилии легких после заражения RSV.

J Virol

1999

;

73

:

10086

–9452

Роман М., Калхун В.Дж., Хинтон К.Л. и др. . Инфекция респираторно-синцитиальным вирусом у младенцев связана с преобладающим Th-2-подобным ответом.

Am J Respir Crit Care Med

1997

;

156

:

190

–553

Renzi PM, Turgeon JP, Marcotte JE et al .Снижение продукции гамма-интерферона у младенцев с бронхиолитом и астмой.

Am J Respir Crit Care Med

1999

;

159

:

1417

–2254

Brandenburg AH, Kleinjan A, van Het LB et al . Иммунный ответ типа 1 обнаруживается у детей с респираторно-синцитиальной вирусной инфекцией независимо от клинической степени тяжести.

J Med Virol

2000

;

62

:

267

–7755

van Schaik SM, Tristram DA, Nagpal IS, Hintz KM, Welliver RC, Welliver RC.Повышенная продукция IFN-гамма и цистеиниловых лейкотриенов при хрипах, вызванных вирусом.

J Allergy Clin Immunol

1999

;

103

:

630

–656

Everard ML, Milner AD. Респираторно-синцитиальный вирус и его роль при остром бронхиолите.

Eur J Pediatr

1992

;

151

:

638

–5157 ​​

Мартинес Ф. Д., Морган В. Дж., Райт А. Л., Хольберг С. Дж., Тауссиг Л. М.. Снижение функции легких как предрасполагающий фактор к респираторным заболеваниям с хрипом у младенцев.

N Engl J Med

1988

;

319

:

1112

–758

Пьедимонте Г.

Опубликовано в категории: Разное

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.